動(dòng)物免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)-免疫酶技術(shù)

1、PAGE PAGE 19 第十二章 免疫酶技術(shù)(Immunoenzymatic technique)一、概述原理 免疫酶技術(shù)是近代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新的免疫技術(shù)。它是把抗原抗體的免疫學(xué)反應(yīng)與酶的高效催化作用原理有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，即把具有催化活性的酶類通過化學(xué)的方法和抗體(或抗原)結(jié)合起來(lái)成為酶標(biāo)記物。這種酶標(biāo)記物同時(shí)具有免疫學(xué)反應(yīng)性和化學(xué)反應(yīng)性，將其與待測(cè)的抗原或抗體結(jié)合，通過酶的活性降解底物呈現(xiàn)出顏色反應(yīng)從而顯示出該免疫學(xué)反應(yīng)的存在。酶的活性與底物以及與顯色反應(yīng)呈一定的比例關(guān)系。顯色越深，說(shuō)明酶降解底物量越大，與酶標(biāo)抗體(抗原)相檢測(cè)對(duì)應(yīng)的抗原(或抗體)量也就越多。（二）免疫酶的分類與特點(diǎn)1分類2

2、免疫酶技術(shù)的特點(diǎn) 靈敏度高，可與放射免疫相比，檢測(cè)能力可達(dá)ng水平。 應(yīng)用范圍廣，既能檢測(cè)抗體又能檢測(cè)抗原，既能定性又能定量、定位及抗原分析。免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)和免疫酶技術(shù)的應(yīng)用比較見表121表121免疫酶技術(shù)、免疫熒光和放射免疫技術(shù)的比較定性定量定位抗原分析免疫熒光技術(shù)免疫酶技術(shù)放射免疫技術(shù) 不需要特殊設(shè)備，放射免疫需要特殊的實(shí)驗(yàn)室條件，免疫熒光法需要熒光顯微鏡。 標(biāo)本可長(zhǎng)期保存。 酶標(biāo)記物有效時(shí)間較長(zhǎng)，一般低溫保存可達(dá)一年以上。（三）常用標(biāo)記酶及其底物1標(biāo)記酶的選擇條件 活性高，分解底物的能力強(qiáng)。 特異性強(qiáng)，即作用于底物的專一性強(qiáng)。 與抗原抗體結(jié)合后仍保持酶的活性。 與底物作用可以

3、顯色。 純度高、易純化，即含雜蛋白少。 可溶性(水溶性)好，在溶液中穩(wěn)定。 測(cè)定方法簡(jiǎn)單。 酶來(lái)源方便、價(jià)格低廉。2符合條件的酶 辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase HRP)，分子量40 000。 堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase AKP），分子量82 000。 -半乳糖甙酶（-galactosidase），分子量540 000。 葡萄糖氧化酶（glucose oxidase）,分子量186 000。其中以HRP最為常用，因其具有活力高、穩(wěn)定、分子量小、易提純等優(yōu)點(diǎn)。3辣根過氧化物酶 HRP廣泛地分布于植物界，以辣根中含量最高。它是由無(wú)色的酶蛋白和

4、棕色的鐵卟啉輔基組成的一種糖蛋白，含糖量18%，它由300個(gè)氨基酸和4個(gè)二硫鍵連接而成。分子量40 000，等電點(diǎn)5.59.0之間，它催化的最適pH因供氫體不同而有所差異，但多在pH5.0左右。HRP易溶于水和58%以下的飽和硫酸銨溶液。HRP酶蛋白和其它雜蛋白的最大吸收光譜為275nm，輔基部分的最大吸收光譜為403nm，二者比值OD403/OD275為酶的純度。以RZ值(Reinheit Zabl德文)表示。RZ3為高質(zhì)量，RZ2.5為中等質(zhì)量，RZ2.5則需要純化。RZ值越小，表示雜蛋白越多,如RZ為0.6，則表示有75%的雜蛋白。衡量酶質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)有兩條，一個(gè)是純度即RZ值，一個(gè)是活力。

5、只用酶的純度表示是不全面的。目前國(guó)際上規(guī)定,酶的活力以國(guó)際單位表示。一個(gè)酶單位是在一定的條件下(pH、溫度和底物濃度)一分鐘能降解1mMol/L底物的酶活力。1mg酶所含有酶的單位數(shù)稱為比活性。用比活性進(jìn)行酶的比較。用作標(biāo)記的過氧化物酶活性一般要大于250units/mg。4HRP的作用底物與供氫體 底物為H2O2，催化時(shí)需供氫體。 組化法常用的供氫體是3，3二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(3.3diaminobenzidine . DAB)。其反應(yīng)物由于形成的氧化型中間體迅速聚合，形成不溶性的棕色吩嗪衍生物，可用于光學(xué)顯微鏡觀察。這種多聚物能還原和螯合四氧化鋨(OSO4)形成具有電子密度的產(chǎn)物，可適用于

6、電子顯微鏡觀察。 用于ELISA的供氫體有下列數(shù)種。見表122。表122 ELISA的供氫體供 氫 體反應(yīng)顏色波長(zhǎng)終止劑終止顏色測(cè)定波長(zhǎng)聯(lián)大茴香胺(OD)桔紅5125Mol/L HCI黃400鄰苯二胺(OPD)黃4442Mol/L H2SO4桔黃492鄰苯甲苯胺(OT)蘭6362Mol/L H2SO4黃4425氨基水楊酸褐4751Mol/L NaOH褐449以O(shè)D和OPD最為常用。OPD有致癌作用，使用時(shí)需注意。5堿性磷酸酶 可從小牛腸粘膜或大腸桿菌中提取。它是一種磷酸脂酶,其作用是催化磷酸脂水解釋放出無(wú)機(jī)磷酸而顯色?；蛘咄ㄟ^水解產(chǎn)生的磷酸與鉬酸反應(yīng)生成磷鉬酸，然后在還原劑作用下生成藍(lán)色的產(chǎn)物

7、進(jìn)行測(cè)定。二、酶標(biāo)記抗體的制備技術(shù)（一）酶標(biāo)抗體的條件1純度高、含雜蛋白少,用IgG優(yōu)于血清抗體，用Fab優(yōu)于IgG。2特異性強(qiáng) 即抗IgG與IgG在免疫電泳上只有一條沉淀線,與IgG的全血清也只有一條沉淀線,這才算是特異性的單價(jià)抗體。3效價(jià)高 一般瓊脂擴(kuò)散鑒定為164以上才算合格。（二）酶標(biāo)記方法1交聯(lián)法 交聯(lián)法通常用的交聯(lián)劑是戊二醛，戊二醛商品大多為25%的水溶液，利用戊二醛分子上對(duì)稱的兩個(gè)醛基，分別與酶和蛋白質(zhì)分子中游離的氨基、酚基等以共價(jià)鍵結(jié)合而進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記時(shí)應(yīng)盡量采用新鮮純品，當(dāng)戌二醛的OD235nm/OD280nm3時(shí)，即為好的交聯(lián)劑。戊二醛交聯(lián)法又分為一步法和二步法。 一步法：

8、即把酶、戊二醛和抗體一起加入進(jìn)行交聯(lián)。然后透析出過量的戊二醛而制備出具有高分子量的酶結(jié)合物。由于抗體分子量大(16萬(wàn))，酶分子量小(4萬(wàn)),抗體分子的氨基數(shù)比酶蛋白分子氨基數(shù)多得多，結(jié)果生成的抗體戊二醛或抗體戊二醛抗體多而造成酶標(biāo)物的活性小。一步法操作：抗IgGAKP的制備：將10mgAKP溶于含有5mg抗IgG的1mlPBS(0.01Mol/L pH7.0)中，在冰浴中緩緩攪拌，盡量避免氣泡產(chǎn)生，完全溶解后，緩緩滴加1%戊二醛溶液4ml，使戊二醛的最終濃度為0.2%，移至室溫中靜置2h3h后，以0.01Mol/L pH7.0 PBS液4充分透析或以SephadexG25柱除去過量的戊二醛，4

9、保存?zhèn)溆?也可保存于50%甘油中置低溫冰箱)；抗IgGHRP的制備：將12mgHRP溶于含5mg抗IgG的1mlPBS(0.1Mol/L pH6.8)中,緩慢攪拌下加入1%戊二醛溶液4mL，置室溫2h3h，充分透析或以SephadexG25除戊二醛，小量分裝后保存于低溫冰箱，避免反復(fù)凍融?；蚶鋬龈稍锉４?。 二步法：是先使酶與戊二醛反應(yīng),除去未反應(yīng)的戊二醛，再使已“活化”的酶分子與抗體分子的氨基結(jié)合，最后加入少量的賴氨酸封閉被戊二醛激活的酶的殘基。二步法操作：將10mg的酶溶于0.2ml含1.25%戊二醛的0.1mol/L pH6.8 PBS中室溫放置18h，充分透析或以SephadexG25柱

10、除去未反應(yīng)的戊二醛。加生理鹽水至1ml然后加入1ml(含5mg)的抗體溶液和1ml 1Mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液，混合后4冰箱放置24h，加入0.1ml 0.2mol/L賴氨酸，置室溫2h，以0.15Mol/L pH7.2 PBS液充分透析，離心去沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，再進(jìn)一步以硫酸銨沉淀純化后應(yīng)用。AKP一般不采用二步法,而只用一步法。改良HRP二步標(biāo)記法：取HRP10mg溶于0.4ml,0.25Mol/L pH6.8PBS液中或0.05Mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液中，加入25%戊二醛0.1ml，37溫育2h后加入冰冷的分析純的無(wú)水乙醇2ml，2 500r/min離心沉淀1

11、0min15min，傾去溶液。沉淀以80%乙醇4ml5ml混懸，同上離心，傾去乙醇，將管倒置，使乙醇充分流出。沉淀用1ml 0.05Mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液溶解，加入0.5ml1ml 抗IgG抗體溶液(含抗體15mg左右)，放在冰箱內(nèi)過夜后，加KH2 PO4，使近中性即可應(yīng)用。2氧化法 采用過碘酸鈉，過碘酸鈉是強(qiáng)氧化劑，能將HRP的甘露糖部分(與酶活性無(wú)關(guān)的部分)的羥基氧化成醛基，然后與抗體的氨基結(jié)合,形成酶標(biāo)抗體。（1）氧化法操作過程如下：將5mgHRP溶于新配制的1ml 0.30Mol/LpH8.1重碳酸鈉中，加0.1 ml 1%氟二硝基苯(FDNB)無(wú)水乙醇溶液,在室溫中混合后

12、，再加入1ml 0.04Mol/L0.08Mol/L過碘酸鈉(NaIO4)，置室溫中輕攪30min，在溶液呈黃綠色時(shí)，加1ml 0.16Mol/L乙二醇溶液，在室溫中放置1h，使氧化反應(yīng)中止，然后在4中對(duì)0.10Mol/L pH 9.5重碳酸鈉緩沖液透析，換液3次。在3ml HRP醛基溶液中，加入5mg(溶于1ml的碳酸鹽緩沖液中)，室溫置2h3h，加入5mg氫化硼鈉(NaBH4)，于4冰箱放置3h或過夜，然后用PBS液充分透析，離心去沉淀物。上清液即為酶結(jié)合物，純化后使用。（2）改良過碘酸鈉法：取5mg HRP溶于0.5ml雙餾水中，加入新配制的0.06Mol/L NaIO4水溶液(10ml

13、雙餾水128mg NaIO4) 0.5ml，混勻，置430min； 取出后加入0.16Mol/L乙二醇水溶液(10mlH2O+0.09ml乙二醇)0.5ml，室溫放置30min；加入含5mg純化抗體的水溶液1ml，混勻，并裝入透析袋，對(duì)0.05Mol/L pH 9.5碳酸鹽緩沖液緩緩攪拌透析6h(或過夜)，使之結(jié)合；加入NaBH4溶液(5mg/ml)0.2ml，混勻，置42h；在以上溶液中緩慢加入等體積的飽和硫酸銨溶液，混勻，430min，離心，去上清，沉淀以少許0.02Mol/L pH7.4 PBS液溶解，裝入透析袋，以同樣液體在4透析除鹽過夜；次日取出離心，以除去不溶物，即得酶抗體(HRP

14、IgG)結(jié)合物，以0.02Mol/L pH 7.4 PBS液加至5ml；效價(jià)測(cè)定合格后，加入等量?jī)?yōu)質(zhì)甘油，分裝小瓶，低溫保存。戊二醛交聯(lián)法與過碘酸鈉氧化法比較，見表123。表123 戊二醛法與過碘酸鈉法比較比較項(xiàng)目戊二醛法過碘酸鈉法一步法二步法標(biāo)記方法簡(jiǎn)單較復(fù)雜較復(fù)雜酶利用率24%24%70%酶偶聯(lián)到99%抗體上產(chǎn)率5%5%50%標(biāo)記抗體分子量750萬(wàn)25萬(wàn)40萬(wàn)穿入組織能力差好一般抗體活性丟失多少較多酶活性丟失多少較多染色效應(yīng)差較好較好3二馬來(lái)酰亞胺法 二馬來(lái)酰亞胺(Dimaleimide)能與蛋白質(zhì)半胱氨酸的硫基反應(yīng)。首先用巰基乙胺還原蛋白質(zhì)(IgG),并用N、N苯二馬來(lái)酰亞胺活化，然后除

15、去多余的試劑，最后使含二馬來(lái)酰IgG與含硫基的半乳糖苷酶連接。具體操作如下：將抗lgG抗體溶于0.1Mol/L pH5.0醋酸鈉緩沖液并對(duì)同一緩沖液透析平衡過夜,離心除去不溶性物質(zhì),抗IgG(14mg/2ml)與10ml巰基乙胺在37溫育90min。過Sephadex后濃縮使每ml含3.0mg左右的還原抗IgG。在0中,按11滴加飽和N、NO苯二馬來(lái)酰亞胺溶液，混合，于30溫育20min，過SephadexG25柱，除去未反應(yīng)的二馬來(lái)酰亞胺。收集二馬來(lái)酰亞胺“活化”的抗IgG,濃縮使?jié)舛葹镺D280nm=1.0(光徑1cm),取1ml溶液加20l(5mg/ml)半乳糖苷酶，置3020min，用

16、0.10Mol/L NaOH中和后，于4置24h72h，再過Sepharose-6B柱(1.540cm)，以pH7.0PBS洗脫,收集酶結(jié)合物，加疊氮鈉(NaN3)防腐，4保存?zhèn)溆谩Ｃ笜?biāo)抗體結(jié)合物的純化 在酶標(biāo)記的溶液中，出現(xiàn)的是各種交聯(lián)物的混合物,有酶抗體、酶抗體酶、抗體抗體、酶酶，甚至還有游離的酶和抗體。在這中間,除了抗體酶和酶抗體酶外,其它都應(yīng)該給予除去。150%飽和硫酸銨沉淀法。 此法只能除去游離的酶及酶酶聚合體。而不能除去其它不需要者。但是此法對(duì)酶標(biāo)抗體的損耗少。2過SephadexG200或Sepharose6B柱。此法較繁瑣,而且對(duì)酶標(biāo)抗體的損耗較大,但提純的質(zhì)量好。（三）酶標(biāo)抗

17、體的鑒定1酶標(biāo)抗體的活性鑒定 一般以瓊脂擴(kuò)散和免疫電泳進(jìn)行鑒定。使酶標(biāo)抗體和相應(yīng)的抗原(抗原濃度為1mg/ml)產(chǎn)生沉淀線,洗滌后于底物溶液中顯色,顯色后用生理鹽水漂洗,沉淀線不褪色,說(shuō)明酶和抗體都具有活性。良好的酶標(biāo)結(jié)合物瓊脂擴(kuò)散滴度一般應(yīng)在1：16以上。2酶結(jié)合物的定量測(cè)定 包括酶量、IgG含量、酶與IgG克分子比值以及結(jié)合率的測(cè)定。酶量(g/ml)=OD403nm0.42 （1）戊二醛法：IgG(mg/ml)=(OD280nmOD403nm0.42)0.940.62(OD4030.42為酶在403nm的光密度，抗體與酶戊二醛結(jié)合后OD280nm約增加6%，所以乘以0.94校正。由于兔Ig

18、GOD280nm=1.0時(shí)為0.62mg，所以又乘以0.62)。（2）過碘酸鈉法：IgG(mg/ml)=(OD280OD4030.30)0.62(40 000和160 000分別為辣根過氧化物酶和IgG的分子量)。 酶結(jié)合率=結(jié)合物中的酶量/標(biāo)記時(shí)加入的酶量100%。 酶標(biāo)記率：OD403nm/OD280nm即酶中正鐵血紅素輔基的吸光度(403nm)與抗體酶蛋白中的色氨酸、酪氨酸的吸光度(280nm)之比表示HRP在AbE中所占的比例，它與E/Ab克分子比值呈高度正相關(guān)。3酶結(jié)合物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 純化的酶結(jié)合物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包括以下幾個(gè)方面。（1）酶的催化活性。（2）免疫學(xué)活性。（3）未聯(lián)接的游離酶

19、的量。（4）未聯(lián)接的原始免疫反應(yīng)物的量。（5）每個(gè)酶分子所聯(lián)接的免疫反應(yīng)物分子數(shù)目。（6）生化性質(zhì)。（7）酶標(biāo)記免疫試驗(yàn)效果。酶結(jié)合物的質(zhì)量差異,可引起試驗(yàn)敏感度的很大變化。例如用不同的程序制得的HRPIgG結(jié)合物進(jìn)行酶標(biāo)記免疫試驗(yàn)，可得到不同的試驗(yàn)結(jié)果，故應(yīng)予重視。用于ELISA的各項(xiàng)指標(biāo)參數(shù)見表1240表124 用于ELISA酶標(biāo)抗體的各項(xiàng)指標(biāo)參數(shù)評(píng)價(jià)最好好一般酶結(jié)合量(mg/ml)1.00.50.4酶結(jié)合率(%)309107酶IgG克分子比1.51.00.7（五）酶標(biāo)抗體的保存分裝小瓶，凍干低溫保存。也可分裝小瓶,在4或0以下保存。加甘油或牛血清白蛋白(最后濃度為33%)保存更好。避免反

20、復(fù)凍融。保存期：一般12年活性不變。三、抗酶抗體及酶抗酶復(fù)合物的制備抗酶抗體的優(yōu)點(diǎn)，在于酶和抗體結(jié)合時(shí)，不需要通過化學(xué)交聯(lián)劑交聯(lián)，抗體的失活少。在酶復(fù)合物形成后，同時(shí)就具有酶的活性，遇到相應(yīng)的底物即呈現(xiàn)催化顯色作用。必須注意，抗酶抗體必須用與第一抗體同種來(lái)源的動(dòng)物制備。（一）抗酶抗體的制備于家兔的兩個(gè)后足掌內(nèi)各注入弗氏完全佐劑(含活卡介苗12mg/ml)和過氧化物(5mg/ml)的等量混合乳化液0.5ml，兩星期后，于兩側(cè)腘淋巴結(jié)內(nèi)注入同樣液體。一周后靜脈注射0.2ml0.4ml，過氧化物酶液(同樣濃度), 并同樣強(qiáng)化23次,末次注射后一周驗(yàn)血、分離血清即為過氧化物酶抗體。（二）酶抗酶復(fù)合物(

21、PAP)的制備1取單價(jià)特異性抗酶血清10ml，1.5104r/min(4)離心20min，吸取上清。2于上清液中滴加酶溶液(0.5mg/ml)直至不再產(chǎn)生沉淀,靜置1h，1.5104r/min離心20min。3將沉淀物用冷生理鹽水125ml洗三次，每次1.5104r/min離心20min。4于冰浴下，將沉淀物懸混于4ml HRP(2mg/ml)中。5在pH計(jì)監(jiān)測(cè)下，邊攪拌邊加0.1Mol/L或0.01Mol/L HCl至pH 2.3。此時(shí)沉淀已全部溶解，1.5104r/min離心20min。6吸取上清，用0.1Mol/L NaOH調(diào)pH至7.4。7量體積，加入1/10容量的0.075Mol/L

22、醋酸鈉和0.15Mol/L醋酸銨的等量混合液。8逐滴加入等體積的100%飽和硫酸銨，攪拌20min。1.5104r/min離心20min。9將沉淀物用50%飽和硫酸銨洗1次，同樣離心。10將沉淀物懸混于5ml蒸餾水中，以pH6.75緩沖鹽水透析3天，每天換水1次。(緩沖鹽水由1.35104ml生理鹽水, 25ml 1.5Mol/L醋酸鈉和75ml 2Mol/L醋酸銨配成)。111.5104r/min(4)離心20min，吸取上清，于OD280nm和OD403nm測(cè)定,計(jì)算IgG和酶含量及克分子比值。12按0.1ml分裝，-20保存。13應(yīng)用時(shí)從低溫冰箱中取出,立即在37水浴中融化。四、免疫酶組

23、化法(豬瘟組化法)（一）材料與試劑1萘酚液 一苯酚 1.00g40%乙醇 100.00ml3%H2O2 0.20ml混合即可,現(xiàn)用現(xiàn)配。2派洛寧液 派洛寧(Pyroming) 0.10g 苯胺(Aniline) 4.00g 40%乙醇 96.00ml3內(nèi)源性酶抑制劑：0.01%H2O2的0.01%的疊氮鈉溶液。1%H2 O2 1.00ml1%Na N3 1.00ml0.015mol/L pH 7.4 PBS液 100.00ml40.05Mol/L pH 7.6 TrisHCl緩沖液A液：0.2mol/L Tris液三羥甲基氨基甲烷 2.43gH2 O 100.00mlB液：0.1mol/L H

24、Cl取A液25ml，B液38.9ml，混合，加蒸餾水至100ml即可。5DAB液(Karnovsky液)0.05Mol/L pH 7.6 TrisHCl緩沖液 100.00ml 3，3二胺基聯(lián)苯胺鹽酸鹽 76mg1% H2 O2 0.5ml配后立即使用。60.10Mol/L pH7.4 PBS液。（二）操作方法1豬瘟酶標(biāo)抗體工作滴度的確定 對(duì)組化法來(lái)說(shuō)，最簡(jiǎn)單的確定工作滴度的方法是將酶標(biāo)抗體進(jìn)行一系列的倍比稀釋，然后對(duì)已知陽(yáng)性標(biāo)本片進(jìn)行染色，以最為清晰的陽(yáng)性結(jié)果的最大稀釋倍數(shù)或稍提高12滴度作為工作滴度。購(gòu)買商品豬瘟酶標(biāo)抗體,則按其說(shuō)明的工作濃度稀釋即可。2待檢標(biāo)本片的制作 取可疑豬瘟病豬尸體

25、或急宰病豬立即剖檢，采取腎臟、脾臟、淋巴結(jié)等臟器進(jìn)行觸片(或涂片)或冷凍切片(4m厚度)。余下組織低溫冰箱保存或放于盛有50%甘油鹽水中于普通冰箱保存，以備復(fù)檢或比較用。也可采病豬之血作血球粥片。標(biāo)本片干后，立即以4的丙酮液固定15min。固定后的標(biāo)本片可貯藏于4冰箱中備用。3染色方法 采用單染法和復(fù)染法均可，萘酚復(fù)染法操作過程： 苯酚液染色4min5min。 0.015Mol/L pH7.4 PBS液沖洗10min。 派洛寧液染2min。 PBS沖洗后，用吸水紙吸除水滴。 滴加工作濃度的酶標(biāo)抗體液，以復(fù)蓋為度，置濕盒內(nèi)37溫育30min45min，PBS液沖洗。 加DAB液室溫染色30min

26、； PBS液沖洗后，餾水中漂洗； 干燥后，無(wú)水酒精脫水5min，二甲苯透明5min，加拿大膠封片。DAB單染法： 滴加內(nèi)源性酶抑制劑30min。 0.015Mol/L pH 7.4 PBS沖洗液10min。以下步驟同復(fù)染法。2對(duì)照組的設(shè)置：首次染色時(shí),應(yīng)設(shè)立如下對(duì)照。 已知陽(yáng)性標(biāo)本的對(duì)照。 已知陰性標(biāo)本的對(duì)照。 抗體抑制試驗(yàn)對(duì)照，即在標(biāo)本上加有與酶標(biāo)抗體來(lái)源不同的另一個(gè)體的抗豬瘟抗體處理(37作用45min)。再以酶標(biāo)抗體染色應(yīng)為陰性。 DABH2O2底物染色對(duì)照，即不加酶抗體，只加DABH2O2液。以檢查內(nèi)源性酶被抑制的情況。（三）結(jié)果判定在對(duì)照組成立的前提下，萘酚復(fù)染法：在細(xì)胞漿內(nèi)酶標(biāo)抗體

27、抗原復(fù)合物呈黃褐色,內(nèi)源性酶被染成紅色,背景為淺棕色；單染法：在細(xì)胞漿內(nèi)，酶標(biāo)抗體抗原復(fù)合物呈黃褐色,背景成淡黃色或無(wú)色。（四）注意事項(xiàng)1標(biāo)本必須新鮮，否則非特異性反應(yīng)重。2固定劑的選擇應(yīng)以不影響抗原的活性又不妨礙抗體進(jìn)入細(xì)胞為原則。病毒標(biāo)本的固定劑一般選用冷甲醇和丙酮。3消除內(nèi)源性酶的辦法： 以0.303%H2O2液室溫處理標(biāo)本15min30min； 0.10%苯肼37處理1h； 0.074%鹽酸乙醇液(100ml乙醇含0.20ml濃鹽酸)，室溫處理15min。4消除背景染色的辦法 背景染色可以是特異性的，因?yàn)榧?xì)胞漿的外溢和炎性浸潤(rùn)造成。但大量的是非特異性的，主要是由于組織成分對(duì)免疫球蛋白的

28、非特異性吸附所致，可以采用以下辦法消除。 切片以0.303% H2O2作用后,再以10%卵蛋白作用30min。 以0.05%吐溫-20和含有0.10%牛血清白蛋白的PBS液預(yù)處理。如果采用間接法測(cè)定抗原，則可采用下法來(lái)消除背景的染色。 以與第一血清不同種類的正常動(dòng)物血清做預(yù)處理。 用來(lái)自于酶標(biāo)記第二抗體的同種動(dòng)物的血清做預(yù)處理,也可用這種血清來(lái)稀釋第一抗體。5抗體濃度和酶標(biāo)抗體濃度的確定 直接法測(cè)定的酶標(biāo)抗體濃度是以不同梯度的稀釋經(jīng)過試驗(yàn)而定。間接法測(cè)定的第一抗體濃度和第二酶標(biāo)抗體濃度的確定，則必須進(jìn)行雙方陣試驗(yàn)預(yù)以選擇。抗體濃度和酶標(biāo)抗體濃度的確定均不宜過高或過低。過高易出現(xiàn)非特異性反應(yīng)，過

29、低則影響檢出的敏感性。五、免疫酶測(cè)定法(ELISA)（一）ELISA實(shí)驗(yàn)原理及類型將已知抗體或抗原結(jié)合在某種固相載體上，并保持其免疫活性。測(cè)定時(shí)將待檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體或酶標(biāo)抗原按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)，用洗滌的方法分離抗原抗體復(fù)合物和游離物成分，然后加入底物顯色，進(jìn)行定性或定量測(cè)定。ELISA可用于檢測(cè)抗體，也可用于檢測(cè)抗原。根據(jù)檢測(cè)目的和操作步驟的不同，通常有三種類型的檢測(cè)方法。1間接法 此法是檢測(cè)抗體最常用的方法。將已知抗原吸附于固相載體上，加入待測(cè)血清(抗體)與之結(jié)合，洗滌后，加酶標(biāo)抗體和底物進(jìn)行測(cè)定。其原理見圖121。酶標(biāo)抗體固相抗原待測(cè)抗體EEE圖121 ELI

30、SA間接法示意圖2雙抗體夾心法 此法常用于檢測(cè)抗原。將已知抗體吸附于固相載體，加入待測(cè)標(biāo)本(含相應(yīng)抗原)與之結(jié)合，溫育后洗滌，加入酶標(biāo)抗體及底物溶液進(jìn)行測(cè)定。見圖122。酶標(biāo)抗體固相抗體待測(cè)抗原EEE圖122 雙抗體夾心法檢測(cè)抗原 3競(jìng)爭(zhēng)法 此法可用于抗原及半抗原的定量測(cè)定，也可用于測(cè)定抗體。以測(cè)定抗原為例，將特異性抗體吸附于固相載體上，加入待測(cè)抗原和一定量的已知酶標(biāo)抗原，使二者競(jìng)爭(zhēng)地與固相抗體結(jié)合，經(jīng)過洗滌分離，最后結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原與待測(cè)抗原含量呈負(fù)相關(guān)。見圖123。固相抗體EEE酶標(biāo)抗原待測(cè)抗原E底物E顯色反應(yīng)（弱）固相抗體EEE酶標(biāo)抗原底物顯色反應(yīng)（強(qiáng)）EEEEEE圖123競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗

31、原示意圖（二）ELISA試驗(yàn)條件的選擇：1固相載體的選擇 載體的種類很多，其中包括纖維素、交聯(lián)右旋糖酐、葡萄球菌聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。從使用形式上可有凹孔平板、試管、珠粒等。聚苯乙烯凹孔板是應(yīng)用最廣泛的一種載體。聚苯乙烯塑料微量滴定板吸附蛋白的性能好，操作簡(jiǎn)便、用量小，適于大批檢查。由于聚苯乙烯的工藝過程不夠穩(wěn)定,造成各批次差異較大。所以進(jìn)行ELISA之前，必須進(jìn)行篩選。檢查方法： 吸附性能的檢查：先加抗體包被，然后加入同一稀釋度的酶標(biāo)抗體，最后加底物、顯色、測(cè)OD值,求出總平均OD值,再求出每相鄰兩孔的OD平均值,此均值在總均值的10%以內(nèi)為合格,若中間孔與四周孔OD值相差太大，或一側(cè)與另

32、一側(cè)孔OD值相差較大均屬不合格。 對(duì)比測(cè)定陽(yáng)性血清與陰性血清，觀察是否存在明顯差異，若二者OD值相差于10倍以上者為合格。板的處理。新板一般不用處理,用蒸餾水沖洗即可應(yīng)用。板用一次即廢。但不少實(shí)驗(yàn)工作者認(rèn)為用超聲波處理，清潔液Tritonx100、20%乙二醇處理仍可應(yīng)用。但發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照顯色較深和陽(yáng)性樣品顯色結(jié)果不理想時(shí)，應(yīng)棄去不用。2載體的吸附條件 載體的吸附均為物理吸附。吸附的多少取決于PH值、溫度、蛋白濃度、離子強(qiáng)度以及吸附時(shí)間等。較好的吸附條件是：離子強(qiáng)度為0.05Mol/L0.10Mol/L，pH9.0pH9.6碳酸鹽緩沖液，蛋白濃度為1g/ml100g/ml，4過夜或373h。3酶

33、標(biāo)抗體使用濃度的確定 于聚苯乙烯板孔中加足夠量的抗體包被,溫育一定時(shí)間，沖洗、把酶標(biāo)結(jié)合物倍比稀釋，每個(gè)稀釋度加2孔,溫育、沖洗、再加底物顯色、比色。以O(shè)D值為縱坐標(biāo),酶標(biāo)結(jié)合物的稀釋度為橫坐標(biāo)，制作曲線。找出OD值為1時(shí)，相對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)抗體稀釋度為最適酶標(biāo)抗體稀釋度。這個(gè)稀釋度是指在這種條件下的最適稀釋度，換個(gè)條件就不是最適的了。如1400的酶標(biāo)抗體稀釋度溫育6h可與16 400稀釋度溫育24h結(jié)果相同。所以一旦條件確定之后，就不要變更，以保證結(jié)果的重復(fù)性和相對(duì)的準(zhǔn)確性。此最適酶標(biāo)抗體稀釋度可做為工作濃度，也可提高半個(gè)至一個(gè)滴度，但不能提高過高，否則非特異性顯色增加。酶標(biāo)抗體的滴度反映酶標(biāo)抗體

34、的質(zhì)量，也可以此比較酶標(biāo)結(jié)合物的優(yōu)劣。有材料報(bào)道認(rèn)為1320滴度為合格,11 000以上更好。酶標(biāo)抗體滴度越高，用于工作濃度的稀釋倍數(shù)就越大，敏感性就越高，非特異性反應(yīng)就越低。4抗原： 抗原的要求：用于ELISA的抗原必須采用相當(dāng)純的抗原，如果含有其它雜質(zhì)，將與抗原共同競(jìng)爭(zhēng)固相載體上的有限位置。用于其它血清學(xué)反應(yīng)的抗原不一定能適用ELISA實(shí)驗(yàn)，必須經(jīng)過試驗(yàn)，抗原必須能牢固地吸附于載體上，而不喪失其免疫活性，且可得到有規(guī)律的重復(fù)的結(jié)果。另外在吸附載體后，對(duì)加入的各種試劑產(chǎn)生最小的非特異性吸附，即與陰、陽(yáng)性血清結(jié)合差異較大。 抗原效價(jià)的測(cè)定 可采用單方陣或雙方陣試驗(yàn)。單方陣試驗(yàn)：以不同稀釋度的抗

35、原包被酶標(biāo)板，以常規(guī)的1200倍稀釋的陽(yáng)性血清加入，再加入酶標(biāo)抗體、顯色、測(cè)OD值，以O(shè)D值為1.0時(shí)，相應(yīng)的抗原濃度作為使用效價(jià)；雙方陣試驗(yàn)比較精確，它既能測(cè)出抗原的最適濃度又能測(cè)出抗體的最適濃度。即將抗原抗體均稀釋成不同濃度進(jìn)行酶標(biāo)抗體反應(yīng)，以血清稀釋倍數(shù)最高的陰、陽(yáng)性血清的光吸收值差最大的所對(duì)應(yīng)的抗原稀釋度為抗原的使用效價(jià)。已吸附的抗原的固相載體經(jīng)凍干或干燥保存很穩(wěn)定,數(shù)月仍不失活。 5抗體 抗體效價(jià)的測(cè)定同抗原,采用雙方陣試驗(yàn)。6清洗液 一般采用0.01Mol/L pH 7.2 PBS吐溫緩沖液。吐溫是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，為非離子型的表面張力物質(zhì),常做助溶劑。吐溫的編號(hào)依聚合山

36、梨醇所結(jié)合的脂肪酸種類不同而定。吐溫20是結(jié)合月桂酸、吐溫40是結(jié)合棕櫚酸、吐溫60是結(jié)合硬脂酸,吐溫80是結(jié)合油酸等。通常用吐溫20加入緩沖液內(nèi)做為濕潤(rùn)劑,以減少非特異性吸附。也可在PBS緩沖液中加入1%牛血清白蛋白(或10%小牛血清或卵清蛋白),特別在抗原包被以后,以牛血清白蛋白緩沖液再包被一次,而占據(jù)孔內(nèi)剩下位置,這樣來(lái)減少非特異性反應(yīng)。7反應(yīng)時(shí)間 抗原與抗體、抗體與酶標(biāo)抗體反應(yīng)一般在37 2h3h達(dá)到高峰。時(shí)間太短,敏感性下降,時(shí)間太長(zhǎng),吸附的抗原或復(fù)合物(在這個(gè)溫度下)可能脫落。酶底物反應(yīng)時(shí)間的確定：一般采用15min30min45min。也可以標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清為準(zhǔn),隨時(shí)測(cè)定其OD值,當(dāng)

37、達(dá)到規(guī)定的OD值時(shí),即終止反應(yīng)。ELISA結(jié)果判定及表示法結(jié)果判定，分目測(cè)法和比色法。結(jié)果表示有以下幾種：1以“十” “一”表示陽(yáng)性、陰性。2直接用OD值表示。3用終點(diǎn)滴度表示 即將標(biāo)本連續(xù)稀釋,以最高稀釋度的陽(yáng)性反應(yīng)(如規(guī)定大于某一OD值或陰陽(yáng)性比值大于某一數(shù)值)為該標(biāo)本滴度。4以單位表示 將已知陽(yáng)性血清做不同稀釋進(jìn)行滴定,以陽(yáng)性血清的單位數(shù)為橫坐標(biāo),以相對(duì)應(yīng)的OD值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知樣品可根據(jù)其OD值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出單位數(shù),再乘以稀釋倍數(shù),即可獲得未知樣品的單位數(shù)。六、豬瘟單克隆抗體ELISA（一）材料及試劑1豬瘟單抗純化抗原2兔抗豬IgG酶標(biāo)抗體3豬瘟陽(yáng)性血清4豬瘟陰性血清14

38、均由指定的生物制品所購(gòu)買。5ELISA反應(yīng)板6包被液碳酸鈉 1.50g碳酸氫鈉 2.93gH2O加至 1 000mlpH值9.67PBS液氯化鈉 8.90g磷酸二氫鉀 0.20g無(wú)水磷酸氫二鈉 2.13g加雙餾水 1 000ml8PBS吐溫洗滌液PBS液 1 000ml犢牛血清 5ml混合即可9底物溶液 0.1Mol/L檸檬酸液檸檬酸 21g雙蒸餾水加至 1 000ml 0.2Mol/L Na2HPO4液Na2HPO412H2O 71.6g雙蒸餾水 加至 1 000ml pH5.0磷酸鹽檸檬酸緩沖液取液 24.30ml液 25.70ml混勻即可鄰苯二胺液取液 50ml雙餾水 50ml磷苯二胺 20mg30%H2O2 0.15ml待鄰苯二胺溶化后再加H2O2，現(xiàn)用現(xiàn)配。10終止液濃H2SO4(98%) 22.2mlH2O 177.80ml（二）