酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定錯誤結(jié)果的原因分析

1、ELISA測定錯誤結(jié)果的原因分析ELISA即酶聯(lián)免疫吸附試驗，是一種常用的固相酶免疫測定方法。Engvall和Perlmann于1971年最先應用該法進行了IgG定量測定，并命名為enzymelinkedimmunosorbentassay（ELISA）。ELISA的基本原理是：使抗原（或抗體）結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性；使抗原（或抗體）與某種酶聯(lián)結(jié)成酶標抗原（或抗體），而且此酶標抗原（或抗體）既保留其免疫活性，又保留其酶活性；測定時將受檢標本（抗體或抗原）和酶標抗原（或抗體）按不同步驟與固相載體表面的抗原或抗體進行反應，再用洗滌方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其它物質(zhì)分開

2、，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標本中受檢的抗體或抗原量成一定比例；再加入酶反應底物后，底物被酶催化后變?yōu)橛猩a(chǎn)物，根據(jù)其顏色反應的深淺進行定性或定量分析，以了解被測標本中抗體或抗原含量。ELISA方法被廣泛應用于各種抗原和抗體測定。但ELISA測定中影響因素較多，而且其操作中有一定的技術要求，在臨床檢驗中除正常反應外，有時?？梢姷揭恍╁e誤結(jié)果（即假陽性或假陰性結(jié)果）。引起ELISA測定錯誤結(jié)果的原因主要有：標本因素；試劑因素；操作因素。本文就標本因素對ELISA測定的影響做如下討論。血清是最常用的ELISA標本，血漿一般可視為與血清同等的標本，標本引起的假陽性和假陰性結(jié)果主要是干擾性物質(zhì)所致，

3、分為內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)兩種：1內(nèi)源性物質(zhì)有人認為大約40%的人血清標本中含有非特異性干擾物質(zhì)，可以不同程度影響檢測結(jié)果。常見的干擾物質(zhì)有：類風濕因子、補體、嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫(yī)源性誘導的抗鼠Ig（s）抗體、交叉反應物質(zhì)和其它物質(zhì)等。（1）類風濕因子人血清中IgM、IgG型類風濕因子（RF）可以與ELISA系統(tǒng)中的捕獲抗體及酶標記二抗的FC段直接結(jié)合，從而導致假陽性。解決該情況的辦法是：用F（ab）2替代完整的IgG;標本用聯(lián)有熱變性（63C,10min）IgG的固相吸附劑處理（將熱變性IgG加入到標本稀釋液中同樣有效）；檢測抗原時，可以用2-巰基乙醇等加入到標本稀釋液中，使RF

4、降解。（2）補體ELISA系統(tǒng)中固相一抗和標記二抗過程中，抗體分子發(fā)生變構，其FC段的補體C1q分子結(jié)合位點被暴露出來，使C1q可以將二者連接起來，從而造成假陽性。解決的辦法是：用EDTA稀釋標本；用53C,10min或56C,30min加熱血清使C1q滅活。（3）嗜異性抗體人類血清中含有能與嚙齒類動物（如鼠等）Ig（s）結(jié)合的天然嗜異性抗體，可將ELISA系統(tǒng)中一抗和二抗連接起來，也能造成假陽性。解決的辦法是：可在標本稀釋液中加入過量的動物Ig（s），但加入量不足或亞類不同時無效。（4）嗜靶抗原的自身抗體抗甲狀腺球蛋白、抗胰島素等嗜靶抗原的自身抗體，有時能與靶抗原結(jié)合形成復合物，在ELISA

5、方法中均可干擾抗原抗體測定結(jié)果。為避免以上情況出現(xiàn)，解決的辦法是：測定前需用理化方法將其解離后再測定。（5）醫(yī)源性誘導的抗鼠Ig（s）抗體臨床開展的用鼠源性CD3等單克隆抗體治療，用放射性同位素標記鼠源性抗體的影像診斷及靶向治療等新技術，均有可能使這些病人體內(nèi)產(chǎn)生抗鼠抗體；另外，被鼠等嚙齒類動物咬傷的病人體內(nèi)也可以產(chǎn)生抗鼠Ig（s）抗體。這些病人ELISA測定時均可產(chǎn)生假陽性。解決的辦法是：測定抗原時，在標本中加入足量的正常鼠Ig（s），從而克服由于上述原因造成的假陽性。（6）交叉反應物質(zhì)類地高辛、類AFP樣物質(zhì)等，是與靶抗原有交叉反應的物質(zhì)。在用多抗測定抗原時對測定結(jié)果影響不大，但在用單克隆

6、抗體測定抗原時，如果交叉抗原決定簇正好是所用單克隆抗體相對應的靶決定簇時，也會出現(xiàn)假陽性結(jié)果。（7）標本中其它成分的影響血清脂質(zhì)過高、膽紅素、血紅蛋白及血液粘度過大等，均對ELISA測定結(jié)果有干擾作用。2外源性物質(zhì)外源性物質(zhì)常常是由于用于ELISA測定的血標本的采集、貯存等不當所致。如標本溶血、標本被細菌污染、標本貯存過久、標本凝集不全和采血管中添加物等影響。（1）標本溶血由于各種人為原因引起的標本溶血，均可因紅細胞破壞溶解時釋放出大量具有過氧化物酶活性的血紅蛋白，在以辣根過氧化物酶為標記的ELISA測定中，會導致非特異性顯色，干擾測定結(jié)果。為克服上述干擾作用，標本采集時必須注意避免溶血。（2

7、）標本受細菌污染因菌體中可能含有內(nèi)源性辣根過氧化物酶，因此，被細菌污染的標本同溶血標本一樣，亦可產(chǎn)生非特異性顯色而干擾測定結(jié)果。（3）標本保存不當在冰箱中保存過久的標本，血清中IgG可聚合成多聚體、AFP可形成二聚體，在間接法ELISA測定中會導致本底過深、甚至造成假陽性；標本放置時間過長（如一天以上），有時抗原或抗體免疫活性減弱，亦可出現(xiàn)假陰性。為克服上述干擾，ELISA測定的血清標本宜為新鮮采集；如不能立即測定，5天內(nèi)測定的血清標本可存放于4C,1周后測定的血清標本應低溫凍存；凍存后融解的標本，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，應充分混合后再測定，但混勻時應輕柔，不可強烈振蕩。（4）標本凝集不全在

8、沒有促凝劑和抗凝劑存在的情況下，正常血液采集后1/22h開始凝固，1824h完全凝固。臨床檢驗工作中，有時為了爭取時間快速檢測，常在血液還未開始凝固時即強行離心分離血清，此時的血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結(jié)果；這類情況于次日復查時因血凝已完全，血清中不再有纖維蛋白原存在，故復查結(jié)果變?yōu)殛幮?。為避免上述干擾作用，解決的辦法最好是血液標本采集后必須使其充分凝固后再分離血清，或標本采集時用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當?shù)拇倌齽＃?）標本管中添加物質(zhì)的影響抗凝劑（如肝素，EDTA）、酶抑制劑（如NaN3可抑制ELISA系統(tǒng)中辣根過氧化物酶