生物化學第六章酶化學

1、生物化學第六章酶化學第一節(jié)概述一、酶的概念1、酶的概念-酶是生物催化劑（1）所有酶均由生物體產生幾乎所有的生物都能合成酶，甚至病毒也能合成或含有某些酶。（2）酶和生命活動密切相關幾乎所有的生命活動或過程都有酶參加A執(zhí)行具體的生理機制，如乙酰膽堿酯酶和神經沖動有關。B參與消除藥物毒物轉化的過程，如限制性核酸內切酶能特異性地水解外源DNA,防止異種生物遺傳物質的侵入。C協(xié)同激素等物質起信號轉化、傳遞與放大作用，如細胞膜上的腺苷酸環(huán)化酶。D催化代謝反應，在生物體內建立各種代謝途徑，形成相應的代謝體系。酶的組成和分布是生物進化與組織功能分化的基礎。不同生物，有各自相應的酶系和輔酶；即使同類生物，酶的組

2、成與分布也有明顯的種屬差異,例如精氨酸酶只在排尿素動物的肝臟內，在排尿酸的動物中沒有；例如，肝臟是氨基酸代謝與尿素形成的主要場所，因此，精氨酸酶幾乎全部集中在肝臟內。在生物的長期進化過程中，為適應各種生理機能的需要，為適應外界條件的千變萬化，還形成了從酶的合成到酶的結構和活性各種水平的調節(jié)機制。2、酶的化學本質-大多數酶都是蛋白質（1）酶的相對分子質量很大,如胃蛋白酶的相對分子質量為36000.（2）酶由氨基酸組成，將酶制劑水解后可得到氨基酸。（3）酶具有兩性性質（4）酶的變性失活與水解一切可以使蛋白質失活變性的因素同樣可以使酶變性。酶都是蛋白質？核酶不是二、酶的催化特性1、高效率酶的催化效率

3、比一般化學劑高1061013倍2、專一性一種酶只能作用于一類或某一種物質的性質稱為酶作用的專一性或特異性。蔗糖酶只能催化蔗糖等。三、酶的組成及分類1、酶的組成根據組成分為單純酶和結合酶單純酶：由簡單蛋白質構成，如水解酶（淀粉酶、蛋白酶等）結合酶：結構中含有蛋白質和非蛋白成分，結合酶分為酶蛋白或脫輔基酶蛋白，非蛋白成分稱為輔因子，輔因子又分為輔酶（與酶蛋白結合疏松，可用透析法除去）和輔基（不能用透析法去除）兩類。輔酶及輔基從化學本質來看分為兩類：一類為無機金屬元素（銅/鋅/鎂/錳等），另一類為小分子有機物，如維生素。酶蛋白決定酶的專一性。2、酶的命名3、酶的分類酶按其催化的反應分類氧化還原酶類這

4、類酶催化氧化還原反應，如脫氫酶、氧化酶、還原酶。轉移酶類催化基團轉移反應，大多數需要輔酶參與水解酶類催化加水分解反應裂合酶類催化從底物上移去基團形成雙鍵異構酶類催化單底物單產物的反應，催化底物結構的異構化反應。合成酶類催化兩個底物分子反應生成一個分子，大多數需要提供能量才能進行。第二節(jié)酶的結構與功能的關系一、酶的一級結構與催化功能的關系1、必需基團-酶分子中只有少數幾個氨基酸側鏈基團與活性直接相關定義：關系到酶催化作用的化學基團稱為酶的必需基團。常見的有組氨酸的咪唑基、絲氨酸的羥基、半胱氨酸的巰基等。必需基團分為兩類：能與底物結合的必需基團稱為結合基團；能促進底物發(fā)生化學變化的必需基團為催化基

5、團。2、酶原激活-切去部分片段是酶原激活的共性有些酶原的激活過程是通過去掉分子中的部分肽段，引起酶分子空間結構的變化從而形成或暴露出活性中心。如凝血過程中酶原的激活過程。另外一些酶當其肽鏈在細胞內合成之后，即可自發(fā)盤曲折疊成一定的三維結構，立即表現(xiàn)出全部酶活性。3、共價修飾-改變一定基團可使酶活性改變應用化學試劑可與某些氨基酸側鏈基團發(fā)生結合、氧化或還原等反應，生成共價修飾物，使酶分子的一些基團發(fā)生結構和性質的變化。不同氨基酸側鏈基團可用不同的修飾劑，同一側鏈基團可用幾種修飾劑來修飾。酶共價修飾的基本要求：（1）修飾劑的要求相對分子質量小、對蛋白質吸附有良好的生物相容性和水溶性、表面有較多的反

6、應活性基團、修飾劑上反應基團的活化方法和活化條件以及修飾后酶科學研究的半衰期越長越好。（2）酶的要求熟悉酶反應的最適條件和穩(wěn)定性條件，酶的活性部位的情況以及酶分子側鏈基的化學性質以及反應的活性等。（3）反應條件的確定選擇的條件盡可能少的破壞酶活性必需基團，一般二硫鍵的斷裂將使酶變性而喪失其催化功能。二、酶的活性與其高級結構的關系1、活性中心-酶分子中只有很小的結構域與活性直接相關活性中心：通常把酶分子上必需基團比較集中并構成一定空間構象、與酶的活性直接相關的結構區(qū)域稱為酶的活性中心?；钚灾行陌ńY合中心和催化中心。2、牛胰核糖核酸酶拆合實驗二級結構、三級結構與酶活性的關系以枯草桿菌蛋白酶水解R

7、Nase分子中的Ala20-Ser21間的肽鍵產生的影響為例圖6-1旳12丙11024$蛋臼圖卜1牛胰楂糖核期醜分子的切斷與去糾I枯草桿繭S肽與S蛋白單獨存在時沒有活性，但將兩者按1:1的比例混合，則能恢復酶活性，雖然第20位與第21位之間的肽鍵并未恢復。這是因為S肽通過氫鍵及疏水作用與S蛋白結合，使His12和His119在空間位置上互相靠近而重新形成了活性中心。可見，只要酶分子保持一定的空間構象，使活性中心必需基團的相對位置保持恒定，一級結構中個別肽鍵的斷裂，甚至某些區(qū)域的小片段的去處并不影響酶的活性。3、聚合與解聚四級結構與酶活性的關系具有四級結構的酶，按其功能分為兩類：一類與催化作用有

8、關，另一類與代謝密切相關。四級結構完整時，酶的催化功能才會充分發(fā)揮出來，當四級結構被破壞時，亞基被分離，若采用的分離方法適當，被分離的亞基仍保留著各自的催化功能，但用強烈的條件破壞其四級結構形成的亞基則沒有催化功能，如天冬氨酸轉氨甲酰酶4、同工酶-高級結構與酶活性關系的典型（1）同工酶的概念指的是能催化相同的反應，但其酶蛋白本身的分子結構組成不同的一組酶。（2）同工酶的結構與功能同工酶的結構主要表現(xiàn)在非活性中心部分不同或所含亞基組合情況不同。乳酸脫氫酶（LDH）二二LDH)LDHj二二LDH!.DH4陰械LDHf腎訕LHt-2乳醴脫氫酷同丄酣電泳圖謂四眾棒殞白*有五種同工爾這五種同丁.誨的犯基

9、組成不間;Tcra8仙urn.SCTffLDHnapamLDH，u戸0&牡0LDik說明：同一種組織或同一細胞中所含的同一種酶可在結構上顯示出器官特異性或細胞部位特異性。LDH有5種同工酶，LDH1主要分布在心肌中，LDH5主要分布在骨骼肌中。（3）研究同工酶的意義同工酶具有組織器官特異性和細胞部位特異性，在體內調節(jié)上具有重要意義。同工酶的研究為細胞分化、發(fā)育、遺傳等方面提供了分子基礎。（相對比例發(fā)生變化）同工酶分析法在農業(yè)上開始用于優(yōu)勢雜交組合的預測在臨床上可用同工酶作某些病變的診斷指標，如骨骼肌損傷、急性肝炎及肝癌患者LDH5增高。第三節(jié)酶催化反應的機制一、酶促反應的本質1、酶是催化劑只影

10、響反應速率而不改變反應平衡點能加速化學反應速率只能加速在熱力學上有可能進行的化學反應只能縮短化學反應達到平衡所需要的時間,不改變化學反應的平衡點催化可逆反應的酶對可逆反應的正反應和逆反應都有催化作用。2、加速反應的本質降低活化能A+-B翩.反應過程ABf產物.Si有載謖比反l應的活化能3、中間產物學說-酶的工作方式學說認為在酶促反應中，底物先與酶結合成不穩(wěn)定的中間產物，然后再分解釋放出酶與產物。解釋：當底物和酶結合成過渡態(tài)的中間物時，要釋放一部分結合能，這部分能量的釋放，使得過渡態(tài)的中間物處于比E+S更低的能級，因此使整個反應的活化能降低，使反應大大加速。中間產物可以被證明存在，如有些可以直接

11、用電鏡觀察或X射線衍射而證實其存在。二、酶反應機制1、酶作用專一性的機制-誘導契合學說屁酣仝催疋SE團圖卜4誘泵契脅學說吞建圖誘導契合學說認為（1）酶分子具有一定的柔順性（2）酶的作用專一性不僅取決于酶與底物的結合，也取決于酶的催化基團有正確的取位。2、酶作用高效性的機制-共價催化與酸堿催化共價催化是指：親核催化劑或親電子催化劑分別放出電子或吸收電子并作用于底物的缺電子中心或負電中心，迅速形成不穩(wěn)定的共價中間配合物，這個中間物很容易變成轉變態(tài)，因此，反應活化能大大降低，底物可以越過較低的能閾而形成產物。酸堿催化：是通過瞬時地向反應物提供質子或從反應物接受質子以穩(wěn)定過渡態(tài)、加速反應的一種催化機制

12、。有兩種酸堿催化劑，狹義的酸堿催化劑，即H離子和OH離子和廣義酸堿催化劑，即質子供體和質子受體。第四節(jié)酶促反應動力學一、酶促反應的基本動力學1、底物濃度的影響-底物濃度對酶促反應速率的影響是非線性的一聶反磧琵昔圾反應零艱巫應J圖專-E幽促反應邃率與低物儺度的關系2、米氏方程定量表達底物濃度與酶反應速率的關系米氏方程：(P112)Km：米氏常數為酶促反應速率達到最大反應速率一半時的底物濃度3、Vmax和Km-動力學基本參數(1)Km值的求法利用v-Cs圖求，斜牢=圖6-8EadiHofsl址和IIelfcs（i）匕ulie-HcM蛀怦圖itb）丹旳辟樸圖iofsiet和H嗆嘲柞團為動力學研究者所

13、偏愛，怛雙倒數作團法那Eadie-Hofstee和Hanes作圖2）米氏常數是酶學研究中的重要數據Km是酶的特征常數，只與酶的性質有關，與酶的濃度無關。Km的應用是有條件的（在一定的溫度、pH值等條件下）Km值可以反映酶同底物的親和力如果一個酶對某底物的Km值越大，說明反應速率達到最大反應速率一半的時候所需底物濃度高，表明酶同底物的親和力小。底3X105X10-L.It6-5-燮醋的米氏常融己斷議酶己晡議釉Ke.U臉離乳*白聘碰乳東白初過籾化竜擁Jtt珀浪睨魚叫曲附戰(zhàn)脫氧劇卑轉脫曲島-笨用戰(zhàn)酪氨戰(zhàn)胺I0T35Xl&-t6X10-.&xio-3LSX10-*ISHI酸推HcnrL2X1013.2

14、X10-h?XSXlfl-13）酶的Km值在實際應用中的重要意義鑒定酶通過測定Km值，可鑒別不同來源或相同來源但在不同發(fā)育階段、不同生理狀態(tài)下催化相同反應的酶是否屬于同一種酶。判斷酶的最適底物一種酶可能作用于多個底物，就有多個Km值，Km值最小的就是最適底物。計算一定速率下的底物濃度了解酶的底物在體內具有的濃度水平判斷反應方向或趨勢（正逆兩向的Km值常常不同）判斷抑制類型測定不同抑制劑對某個酶的Km及Vmax的影響，可以判斷該抑制劑作用類型。推測代謝途徑，一種物質在體內有不同的代謝途徑，根據Km判斷催化的不同途徑。如丙酮酸的轉化方向判斷。二、酶濃度對酶反應速率的影響TOC o 1-5 h z酶

15、耀度I圖6-10酶就度對酶j反應逮率的影響_7.帕咅具門ftmcr.cfri&Fia7i當底物濃度大于酶濃度條件下，pH、溫度一定時，反應速度與酶濃度成正比三、溫度對酶反應速率的影響溫度每升高10度所增加的反應速率稱為溫度系數（Q）。一般化學反應的Q1010為2-3（提高2-3倍）。同一種酶最適宜的溫度不是一定的，跟底物濃度、激活劑、抑制劑等因素有關。四、pH值對酶反應速率的影響烹霍4爪躍掘匡（1）酶反應具有各自的最適pH值，并且最適pH往往與等電點不一致。（2）經過部分修飾的酶，其最適pH通常不變（3）最適pH值主要和活性中心側鏈基團的解離直接相關，并不是作用于整個酶分子，而是改變了酶活性中

16、心或與之相關的基團的解離狀態(tài)。五、激活劑對酶反應速率的影響激活劑或活化劑：凡能提高酶的活性，加速酶促反應進行的物質稱為激活劑或活化劑。酶的激活與酶原的激活不同，酶激活是使已具有活性的酶的活性加強，使活性變大；酶原激活是使本來無活性的酶原變成有活性的酶。有些酶的激活劑是金屬離子或某些陰離子，如許多激酶需要Mg2+。激活劑的作用是相對的，一種酶的激活劑對另一種酶來說，也可能是一種抑制劑。不同濃度的激活劑對酶活性的影響也不同。六、抑制劑對酶反應速率的影響1、抑制所用的概念-抑制作用不同于失活作用和去激活作用（1）失活作用：指酶蛋白分子受到一些物理或化學因素的影響后次級鍵被破壞，部分或全部改變了酶分子

17、的空間構象，從而引起酶活性的降低或喪失，這是酶蛋白變性的結果。（2）抑制作用：指酶的必需基團（包括輔因子）的性質受到某種化學性質的影響而發(fā)生改變，導致酶活性的降低或喪失。這時酶蛋白一般并未變性。（3）去激活作用：某些酶只有在金屬離子存在下才能很好的表現(xiàn)其活性，如果用金屬螯合劑去除金屬離子，會引起酶活性的降低或喪失。2、抑制作用的類型可逆抑制與不可逆抑制（1）不可逆抑制：這類抑制作用通常指抑制劑與酶活性中心必需基團以共價鍵結合，引起酶活性喪失，包括非專一不可逆抑制和專一性不可逆抑制。（2）可逆抑制：這類抑制作用是指抑制劑與酶蛋白以非共價鍵結合，具有可逆性，可用透析、超濾、凝膠過濾等方法將抑制劑除

18、去。競爭性抑制：某些抑制劑的化學結構與底物相似，因而與底物競爭性地同酶活性中心結合，當抑制劑與活性中心結合后，底物就不能再與活性中心結合，反之，如果酶活性中心已被底物占據，則抑制劑也不能同酶結合，所以，這種抑制作用的強弱取決于抑制劑與底物濃度的比例。這種抑制可以通過增大底物濃度的方法來消除。非競爭性抑制：酶可以同時與底物及抑制劑結合，兩者沒有競爭作用。不能用增大底物濃度的方法來消除抑制作用。非競爭性通常與酶的非活性中心部位結合，這種結合引起酶分子構象變化，致使活性中心的催化作用降低。非競爭性抑制作用的強弱取決于抑制劑的絕對濃度，因而不能用增大底物濃度的方法來消除抑制作用。第五節(jié)酶的制備一、酶的

19、制備及純化1、制備戰(zhàn)略-活性蛋白提取的一般原則應盡量低溫下操作；大多數酶在pH小于4或大于10時不穩(wěn)定，避免過酸過堿；酶容易在溶液表面或界面處形成薄膜而變性，故操作中應盡量避免泡沫形成；重金屬、有機溶劑、微生物污染以及蛋白質存在能使酶失活。包括抽提、純化和制劑制備第一步是將酶從原料中抽提出來制成酶溶液；然后純化，即選擇性地將酶從溶液中分離出來或者選擇性地從酶溶液中移除，最后制劑制備，即將純化的酶做成一定形式的制劑。2、酶提取純化的方法-不同目的選用不同的方法（1）預處理和破碎細胞（植物、動物、現(xiàn)多為微生物材料）胞外酶不用細胞破碎，胞內酶需要；動植物用絞肉制成組織糜、或高速研磨；微生物材料用丙酮

20、，能有效破壞細胞壁、同時溶解脂肪，溶菌酶和鹽振蕩方法等。（2）抽提（考慮的因素，pH、鹽、溫度、其他）過酸過堿不可；低濃度鹽溶液中溶解度較大，一般用等滲溶液；溫度一般控制在0-4度（3）濃縮：蒸發(fā)、超過濾、凝膠過濾、冰凍濃縮、其他蒸發(fā)（真空條件下好）；超過濾（允許小分子和水分子通過微孔超濾膜，沒有熱破壞）；凝膠過濾（利用葡聚糖凝膠Sephadex能吸水膨潤、而酶分子排阻于凝膠外的原理進行的）；冰凍濃縮（原理：溶液相對于純水熔點升高，冰點降低）（4）酶的純化（純化的含義、純化方法的選擇）純化方法：根據溶解度（鹽析法、有機溶劑沉淀法等）根據分子大?。z過濾，超過濾和離心）；解離電學性質（離子交換

21、色譜法）；利用穩(wěn)定性差異（如選擇熱變性法、堿變性法等）；基于酶和底物、輔助因子以及抑制劑間具有專一的親和性作用的特點，如親和色譜法。二、酶活性的測定1、定性測定-根據酶催化的反應判斷檢查某一個酶是否存在，利用該酶所催化的化學反應特征，將所提取的酶液與它所催化的底物在一定條件下進行反應，如有產物產生，并且一經煮沸此種活性即消失，就可以證明提取液中有此酶的存在。2、活力單位表示酶量的指標酶活力：酶催化一定化學反應的能力稱為酶活力。酶活力單位：表示酶活力大小的單位，是根據某種酶在最適條件下，單位時間內酶作用的底物的減少量或產物的生成量來表示，所以，反應速率的單位為：濃度/單位時間3、比活力-表示酶純

22、度的指標比活力：是指每毫克酶蛋白所含的酶活力單位數（有時也用每克酶制劑或每毫升制劑含多少活力單位來表示）。即比活力=活力單位數/毫克酶蛋白（氮）4、轉換數-另一種表示酶催化能力大小的方法酶的轉換數表示酶的催化中心的活性，它是每秒內每一催化中心（或活性中心）所能轉換的底物分子數，或每微摩爾酶活性中心每秒轉換底物的物質的量。5、酶活力的定量測定方法-不同酶選用不同方法（1）化學分析法：根據酶的最適溫度和最適pH,從加進酶液后即開始反應，每隔一定時間，分幾次取出一定容積的反應液，停止作用，然后分析底物的消耗量和產物的生成量。（2）分光光度計量法利用底物和產物光吸收性質的不同，在整個反應過程中可不斷的

23、測定其吸收光譜的變化。（3）量氣法當酶促反應中底物或產物之一為氣體時，可以測定反應系統(tǒng)中氣相或壓力的改變（4）pH值測量法使酶反應在較稀的緩沖液中進行，然后用pH計測定反應進行過程中溶液的pH的改變。（5）氧和過氧化氫的極譜測定：用陰極極化的鉑電極進行氧的極譜測定，可以記錄在氧化酶作用過程中溶解于溶液內的氧濃度的降低。第六節(jié)酶的多樣性一、核酶和蛋白質的自我剪接核酶能催化RNA分子中一定部位的磷酸二酯鍵，DNA、直鏈淀粉的分支反應。二、調節(jié)酶調節(jié)酶：這種在體內活性可發(fā)生改變并調節(jié)代謝速度的酶，稱為調節(jié)酶。通過酶分子本身的結構變化來改變酶的活性。1、共價修飾酶共價修飾或化學修飾：酶蛋白分子肽鏈上某

24、些氨基酸基團，在另一種酶的催化下，發(fā)生可逆的化學修飾，使酶分子共價連接（或脫掉）一定的化學基團，稱為共價修飾或化學修飾。2、別構酶變構酶：不是通過共價鍵的變化（化學基團），而是通過酶分子構象的變化來改變酶的活性。別構酶具有兩個空間上彼此獨立并分開的特異部位，即活性部位和調節(jié)部位。前者是底物結合部位，后者為效應物（或調節(jié)物，常常為代謝產物）的結合部位。當底物與活性部位結合時，酶即催化底物轉變?yōu)楫a物；當效應物同調節(jié)部位結合時，可引起酶分子的構想變化，從而引起酶活性的改變。3、聚合解聚調節(jié)酶這類調節(jié)酶中，有的是亞基聚合后才有活性，有的則相反，解聚后才是有活性的，聚合后是無活性的（或活性降低）。三、多

25、功能酶多功能酶是指結構上僅為一條肽鏈，卻具有兩種或兩種以上功能的酶蛋白。四、人工酶1、抗體酶抗體酶是將抗體（免疫球蛋白）的高度選擇性（專一性）與酶的高效催化能力融為一體的特殊蛋白質，它既具有酶的催化特性，又能與特異性抗原相結合。人工合成的半抗原免疫動物，使該動物產生抗體，這種抗體即具有酶的催化功能和抗體專一性。2、突變酶利用蛋白質工程技術將天然酶的活性基團進行改造所得到的酶稱為突變酶。3、模擬酶利用有機化學的方法合成比酶分子結構簡單得多的具有催化功能的非組蛋白，這種分子模擬天然酶對底物結合和催化過程，既具有酶催化作用的高效率和專一性又具有比天然酶穩(wěn)定的特性。模擬分為3個層次：（1）合成具有類似酶活力的簡單化合物（2）酶活性部位模擬（3）整個酶分子模擬第七節(jié)酶在工業(yè)上的應用及酶工程一、酶在食品工業(yè)中的應用1、淀粉加工常用的淀粉加工的酶由a-淀粉酶、0-淀粉酶、糖化酶、葡萄糖異構酶和脫