一株野生多孔菌的分離鑒定及生物學(xué)特性研究

1、 一株野生多孔菌的分離鑒定及生物學(xué)特性研究 楊和川 蘇文英 譚一羅 秦裕營 馬騰 浦漢春 周振玲Summary：本研究通過對一株野生多孔菌子實體進(jìn)行分離純化，并對獲得的菌株進(jìn)行ITS鑒定。序列分析結(jié)果表明，該菌株與硬毛栓菌相似性為100%。進(jìn)一步研究了不同溫度、碳源、氮源以及pH對野生多孔菌菌絲生長的影響，從中選出最優(yōu)的3個水平進(jìn)行正交實驗。結(jié)果表明，野生多孔菌菌絲的最適生長條件為：碳源為蔗糖、氮源為酵母浸粉、pH 7.0、培養(yǎng)溫度為35。本研究為野生多孔菌資源的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。Key：多孔菌;生物學(xué)特性;ITS序列分析多孔菌（polypore）是高等真菌的一個類群，該類群真菌子實層體

2、呈孔狀、質(zhì)地為革質(zhì)至木質(zhì)1。多孔菌廣泛分布于各種類型的森林中，目前在我國已知的多孔菌有704種。多孔菌除了在生態(tài)生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮重要的生態(tài)功能外，很多種類本身具有良好的經(jīng)濟(jì)價值，如藥用多孔菌靈芝（Ganoderma lucidum）、云芝（Coriolus versicolor）、樺褐孔菌（Inonotus obliquus）、茯苓（Wolfiporia cocos）、桑黃（Inonotus sanghuang）、豬苓（Polyporus umbellatus）等，已被證實具有調(diào)節(jié)增強(qiáng)人體免疫力、抗腫瘤、降血壓及降血脂等功效2-5。有些多孔菌如灰樹花（Grifola frondosa）、疊生干酪

3、孔菌（ Oligoporus obductus）等，因營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量較高，具有很好的食用價值6。 此外，有些多孔菌產(chǎn)生的木質(zhì)素分解酶，如漆酶（Lacease）、錳過氧化物酶（Manganese peroxidase）、木質(zhì)素過氧化物酶（Lignin peroxidase），被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、生物修復(fù)、紙漿漂白和環(huán)境治理等領(lǐng)域7-9。因此，對野生多孔菌的采集分離和應(yīng)用研究，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和開發(fā)前景。本研究將利用從連云港市海州區(qū)許莊村采集的野生多孔菌子實體為試材，分離獲得其菌絲體并對其進(jìn)行生物學(xué)特性和分子鑒定研究，為保護(hù)野生多孔菌生物多樣性及資源的合理開發(fā)應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。1材料與方

4、法1.1供試材料1.1.1供試菌株野生多孔菌采自江蘇省連云港市海州區(qū)許莊村，供試菌株為野生分離。保藏于連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)中心，編號DK1。轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上活化，用于后續(xù)試驗。1.1.2供試固體培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨3g，瓊脂20g，水1L，pH自然。碳源實驗培養(yǎng)基：碳源 20g、蛋白胨3g，瓊脂20g，水1L，pH自然。氮源實驗培養(yǎng)基：氮源3g、葡萄糖20g，瓊脂20g，水1L，pH自然。pH 實驗培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨3g，瓊脂20g，水1L，調(diào)節(jié)pH。溫度實驗培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨3g，瓊脂20g，水1L，pH自然。1.2方法1.2.1菌種活化在超凈

5、工作臺上將保存的野生多孔菌菌株轉(zhuǎn)接至基礎(chǔ)培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)。1.2.2ITS序列分析菌絲體總DNA提取利用DNA提取試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，北京）。以真菌通用引物ITS1（ 5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3） 和ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGGATATGC-3）為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，體系采用50 L體系（10Taq Buffer，3;dNTP，4;ITS1，2;ITS4，2;DNA Taq 聚合酶，1;基因組DNA，3;ddH2O，33），反應(yīng)條件為：94，2min;94，30s;56，30s;72，30s; 30 次循環(huán)，72，10min。獲得的PC

6、R產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠檢測。引物合成與PCR產(chǎn)物測序由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。測得的 ITS 序列通過 BLAST 軟件進(jìn)行同源序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。1.2.3碳源試驗分別以等量麥芽糖、淀粉、蔗糖、乳糖替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，121滅菌20min后倒入9cm培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿裝培養(yǎng)基15mL，待培養(yǎng)基凝固后，用打孔器（ 直徑8 mm） 在菌種菌落邊緣取接種塊分別接種，每個處理5 個重復(fù)，接種后置于25恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行黑暗培養(yǎng)。自接種后48h 開始，采用十字交叉法測量菌落直徑，觀察并記錄菌絲長勢。1.2.4氮源試驗分別以等量硫酸銨、酵母浸粉、氯化銨、尿素替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中蛋白胨，

7、實驗方法同1.2.2。1.2.5溫度試驗將接種后的平板培養(yǎng)皿分別置于 15、20、25、30、35、40不同溫度條件下培養(yǎng)，每個處理5個重復(fù) （培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基 ） ，實驗方法同1.2.2。1.2.6pH試驗用0.5047mol /L 的鹽酸和 0.5001 mol /L 氫氧化鈉溶液分別調(diào)各培養(yǎng)基初始pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，實驗方法同1.2.2。1.2.7正交試驗在以上單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取各單因素實驗中中最優(yōu)良的3個條件進(jìn)行L9（34）正交試驗，實驗方法同1.2.2。2結(jié)果與分析2.1ITS序列分析經(jīng)PCR擴(kuò)增和序列測定，獲得供試菌株ITS序列片段，經(jīng)Blast在

8、線比對后，與相近種菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。系統(tǒng)發(fā)育樹表明，供試菌株DK1與硬毛栓菌（Trametes trogii）（EU790491.1）的相似性最高，達(dá)到100%。2.2不同碳源對菌絲生長的影響實驗菌株在不同碳源下的生長情況見表1。以葡萄糖和麥芽糖為碳源時，菌絲生長速度較快，菌落邊緣整齊，但菌絲較為稀疏，其次為蔗糖，乳糖，可溶性淀粉為碳源時菌絲生長最為緩慢。2.3不同氮源對菌絲生長的影響實驗菌株在不同氮源下的生長情況見表2。以酵母浸粉為氮源時，菌絲生長速度較快，菌落邊緣整齊，且菌絲濃密，其次為蛋白胨，氯化銨以及硫酸銨為氮源時，菌絲生長速度相差不大，但菌絲較為稀疏。在以尿素為氮源的培養(yǎng)基

9、上，實驗菌株菌絲未見萌發(fā)。2.4不同溫度對菌絲生長的影響野生多孔菌菌株在不同溫度下菌絲的生長情況見表3。實驗菌株在1545溫度范圍內(nèi)均能萌發(fā)生長，但在15條件下培養(yǎng)的實驗菌株菌絲生長速度明顯慢于其他溫度條件下培養(yǎng)菌絲。從菌絲長勢及生長速度來看，35更利于實驗菌株菌絲的生長。2.5不同pH對菌絲生長的影響實驗菌株在不同pH下的生長情況見表2。菌絲在pH 69.0的條件下均可生長，且多孔菌菌絲在不同pH下差異并不顯著。綜合比較，最適pH為7.0。2.6正交實驗對碳源、氮源、pH 和溫度4個因素進(jìn)行篩選，挑選出最優(yōu)3 組水平處理，選擇4因素3水平作L9（34）正交試驗（表5）。結(jié)果顯示，4種因素對多

10、孔菌菌絲生長的影響為：溫度氮源pH碳源。綜合評價，野生多孔菌最佳生長條件是蔗糖、酵母浸粉、pH 7.0、35。3小結(jié)硬毛栓菌（Trametes trogii）是一種廣分分布于世界各地的白腐擔(dān)子菌，目前的多項研究都已證實該菌可被用于工業(yè)染料的脫色11。在本研究中，通過ITS分子生物學(xué)鑒定，野生多孔菌菌株DK1與硬毛栓菌相似性最高，為100%。但該菌株是否為硬毛栓菌，還需進(jìn)一步的形態(tài)學(xué)鑒定。通過單因素實驗以及正交實驗，最終確定野生多孔菌的最適生長條件為：碳源為蔗糖、氮源為酵母浸粉、pH 7.0、培養(yǎng)溫度為35。本研究為野生多孔菌菌株的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)。Reference1周麗偉， 戴玉

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