WHO人類精液檢查與處理實驗手冊課件

1、WHO人類精液檢查與處理實驗手冊（第五版）修訂要點及臨床應用第1頁，共37頁。背景1980年出版第一版“人類精液及精子宮頸精液實驗實檢驗手冊”（生育調(diào)節(jié)）1987年出版第二版（生育調(diào)節(jié)、不育癥的診治）1992年出版第三版（生育調(diào)節(jié)、不育癥的診治、環(huán)境污染）1999年出版第四版（男用避孕病、輔助生育技術-ICSI、環(huán)境污染）第2頁，共37頁。背景以往精液分析存在問題：檢測方法不一結(jié)果帶有主觀性、不客觀、不真實精確度低、重復性差對男性生育力的評估、臨床診斷應用價值很有限 因此，需要一個標準化的手冊第3頁，共37頁。2010年出版第五版隨著近年來男科學和生殖醫(yī)學的快速發(fā)展，基于詢證醫(yī)學的證據(jù)，不少原

2、有的概念和診療建議需要修訂；為此，WHO組織成立了專門的委員會來負責這項工作，編寫制訂了新一版的手冊，以期達到更好的標準化，提高精液分析的質(zhì)量。第4頁，共37頁。修改WHO人類精液檢查手冊的目的提高精液分析各參數(shù)的準確性簡化方法，提高可操作性提供質(zhì)控結(jié)果不良時的應對提示及細節(jié)利于實驗室間的標準化提高精液分析各參數(shù)的臨床應用價值（結(jié)果判斷評述）提高療效評估的準確性第5頁，共37頁。第5版手冊提綱一、精液分析標準程序：常規(guī)分析、抗體包被精子、非精子成分；可供選擇的試驗：精子多發(fā)性缺陷指數(shù)、白細胞免疫細胞化學染色、精子宮頸粘液相互作用、精槳生化、CASA；研究試驗：活性氧、頂體反應、精子卵細胞相互作

3、用作用、精子透明帶結(jié)合、去透明帶倉鼠卵穿透試驗、精子染色質(zhì)檢測等。第6頁，共37頁?！熬悍治觥辈糠值男抻喼饕婕埃壕訚舛群途涌倲?shù)的測定；精子活動力分級；精子形態(tài)學評估；精液參考值范圍。第7頁，共37頁。精子濃度和精子總數(shù)的測定簡化精液稀釋方法及增加計數(shù)池的面積，每份標本均采用兩次取樣、兩次稀釋和兩次計數(shù)，每次計數(shù)至少200個精子，且兩次計數(shù)在95%可信區(qū)間內(nèi)。一次射精中的精子總數(shù)能夠提供反映睪丸功能的更為精確的信息，因此，新版手冊強調(diào)必須精確地測定精液體積。第8頁，共37頁。精液采集和體積測定根據(jù)重量間接計算精液體積，假定精液比重為1g/ml（實際為1.014g/ml)來計算。（首選方法

4、）1.秤取容器的重量，2.秤取裝有精液的容器的重量，3.計算重量之差（g=ml)第9頁，共37頁。精子濃度和精子總數(shù)的測定推薦使用改良Neubauer血細胞計數(shù)板；制備兩份分別稀釋的樣本；不將同一份稀釋樣本加入到兩個計數(shù)池中；不要兩次計數(shù)同一個數(shù)池。第10頁，共37頁。精子數(shù)低的樣本：不必精確測定時粗略估計 如果4/ X 400HPF(或16/ X 200HPF)，則說明濃度為“2x106/ml”存在精子嗎？ 取1ml精液，離心300g x 15min;棄上清，留下50l液體，取2份10 l沉淀加于載片，分別加蓋22mm x 22mm蓋片（20 m深）； 觀察整個蓋片（2 x 480個視野）；

5、如果有精子，則為“隱匿精子癥”。存在活動精子嗎？ 將40 l精液置于24mm x 50mm蓋片下（33 m深）；觀察整個蓋片（1200視野）；如果見到活動精子，則計數(shù)有多少。注意：以上過程并不精確 少的精子=大的計數(shù)誤差 未見精子沒有精子存在； 0的95%可信區(qū)間上限=3.7第11頁，共37頁。精子活動力檢測精子前向運動的情況與受孕具有密切的關聯(lián)；新版手冊中一個重要的修訂是精子活動力的分類方法。精子活動力的分類 前向運動（Progressive motility,PR) 非前向運動（Non-progressive motility,NP) 不運動（Immotility,IM)第12頁，共37頁

6、。精子形態(tài)學：染色方法推薦采用Papanicolaou、Shorr或Diff-Quik染色法使用光學顯微鏡觀察，精子頭部頂體區(qū)為淺藍色，頂體后區(qū)為深藍色，中段略呈紅色，尾部為藍色或紅色。殘余的胞漿小滴染成粉紅色或橙紅色。第13頁，共37頁。精液的參考值范圍新版手冊對正常生育男性額精液參考值范圍進行了修訂。為了制訂參考值范圍，采納了3大洲8個國家的4001900分最近使女方生育的男性的精液標本的原始數(shù)據(jù)。在數(shù)據(jù)統(tǒng)計方面，由于各項精液參數(shù)的高值都不太可能對生育產(chǎn)生危害，所以采用單側(cè)參考值區(qū)間，并以第5百分位數(shù)作為參考值下限對于精液常規(guī)分析參數(shù)來說更為合適，而不需要像一般的統(tǒng)計學分析那樣采用雙側(cè)參考

7、值區(qū)間和第2.5百分位數(shù)。第14頁，共37頁。新版手冊制定的參考值范圍WHO 版本 2 3 4 5 年 1987 1992 1999 2010 參考值 正常 正常 參考 百分位數(shù) 5 50 95精液量.（ml) 2.0 2.0 2.0 1.5 3.7 6.8總數(shù)（m) 40 40 40 39 255 802精子深度（M/ml) 20 20 20 15 73 213前向運動（%） 50 50 50 32 55 72存活（%） 50 75 75 58 79 91正常形態(tài)（%） 50 30 （15） 4 15 44第15頁，共37頁。新版手冊制訂的參考值范圍參數(shù)參考值下限精液體積（ml)1.5（1.

8、+1.7）精子總數(shù)(106/次射精）39（33-46）精子深度 (106/ml)15（12-16）總活動率（PR+NP,%)40（38-42）前向活動率(PR,%)32（31-34）存活率（存活精子。%）58（55-63）精子形態(tài)學（正常形態(tài)，%）4（3.0-4.0）其它參數(shù)PH7.2過氧化物酶陽性白細胞（106/ml)1.0MAR試驗（附著粒上的活動精子，%）50免疫珠試驗（附著珠上的活動精子，%）50精漿鋅（ mol/射精）2.4精漿果糖（ mol/射精）13精漿中性葡糖苷本酶（mU射精）20第16頁，共37頁。精液分析參數(shù)的臨床應用生育力評估：女方妊娠、妊娠時相明確不育診斷，尋找病因其他

9、男性病診斷治療策略制定（常規(guī)治療及輔助生殖）療效評估避孕節(jié)育效果評估第17頁，共37頁。生育力評估評估男性生育三大要點： 女方妊娠 妊娠時相 精液參數(shù)第18頁，共37頁。其他男性病診斷精子的總數(shù)：睪丸生殖功能 輸精管道的通暢程度血精、膿精：附性腺疾病精漿生化： 附性腺功能第19頁，共37頁。治療策略制定（常規(guī)治療及輔助生殖） 少精子癥的分類和ART治療方案 精子濃度 治療輕度少精子癥 10，20(15) 106/ml IUI 中度少精子癥 5， 10 106/ml IUI/IVF 嚴重少精子癥 1， 5 106/ml IVF/ICSI極度少精子癥 1 106/ml ICSI 引用WHO指南第2

10、0頁，共37頁。治療策略制定（常規(guī)治療及輔助生殖） 弱精子癥的分類和ART治療方案 精子活力（a+b) 治療輕度弱精子癥 30(20)% IUI 50(32)%中度弱精子癥 10%,30(20)% IUI/IVF 嚴重弱精子癥 1， 10% IVF/ICS極度弱精子癥 1 % ICSI 或死精子癥引用WHO指南第21頁，共37頁。治療策略制定（常規(guī)治療及輔助生殖） 畸形精子癥的分類和ART治療方案 精子正常形態(tài)率 治療輕度畸形精子癥 10(3)% IUI 5(4)%中度畸形精子癥 5（2）%,10(3)% IUI/IVF 嚴重畸形精子癥 1， 5（2）% IVF/ICS極度畸形精子癥 1 %

11、ICSI 引用WHO指南第22頁，共37頁。精子形態(tài)與功能常用檢測方法 國家人口計生委科研所 世界衛(wèi)生組織生殖合作研究中心 谷翊群第23頁，共37頁。背景：不育癥發(fā)病率各國報道不盡相同，WHO研究如果表明：發(fā)達國家發(fā)病率約在5%-8%，發(fā)展中國家亞洲和中東地區(qū)發(fā)生率較低，約3%-4.8%，發(fā)病率高的是非洲國家，高達10%-30%，我國患病率約為1-5%按8%計算，全世界約有5000-8000萬人有生育問題，每年新增200萬對不育夫婦，而且這數(shù)目還在增加，在不育夫婦中，男性生殖能力異常的約占50%第24頁，共37頁。男性生育力的判斷缺乏金標準精液常規(guī)分析是臨床診療男性不育癥的最常用、最簡便、直觀

12、的輔助檢查及判斷男性生育力的實驗室指標。臨床研究資料顯示，精液中的精子密度。精子活力及活精子數(shù)與自然妊娠率有著明確的統(tǒng)計學上的相關性。但是對精液常規(guī)檢查結(jié)果正?；蚪咏５牟挥∪巳狈τ行?、簡便快速的檢測方法。第25頁，共37頁。精液常規(guī)檢查的項目包括精液量、PH、精子密度、精子活力、精子存活率及精子形態(tài)學。這些指標參數(shù)只是在一定程度上反映出達到自然妊娠所要求的最低精子質(zhì)量，不能反映精子功能及頂體激活、頂體反應、精卵識別及受精過程諸多環(huán)節(jié)中是否功能正常。因此，有必要建立或選用特殊實驗對精子功能進行測定。第26頁，共37頁。精子存活率精子形態(tài)分析精子頂體完整性精子與透明帶結(jié)合試驗精子細胞核成熟度

13、與DHA損傷檢測精子表面結(jié)合抗體檢測附睪功能檢測第27頁，共37頁。精子形態(tài)學評估標準在評估精子正常形態(tài)時應采用嚴格標準（Krugeret al.,1986;Menkveld et al.,1990;Coetzee al.,1998)精子包括頭、頸、中段、主段和末端。由于通過光學顯微鏡很難觀察到精子末端，因此可以認為細胞是由頭（和頸）和尾（中段和主段）組成。只有頭和尾都正常的精子才認為是正常的。所有處于臨界狀態(tài)的精子均認為是異常。第28頁，共37頁。WHO第5版與第4版精子形態(tài)判斷標準比較精子頭部判斷標準分類WHO第5版WHO第4版正常標準精子頭外形上應該光滑、規(guī)則，大體上呈橢圓形；長度95%

14、可信限區(qū)間為3.7-4.7；寬度95%可信限區(qū)間為2.5-3.2；長度比95%可信限區(qū)間為1.3-1.8，頂體界限清晰，占頭部的40%-70%；精子頭的形狀必須是橢圓形的，長度為4。0-5.0um；寬為2.5-3.5um；長寬比為1。50-1.75之間；頂體界限清晰，占頭部的40%-70%異常標準有空泡的頭（超過2個空泡或未染色的空泡區(qū)域占頭部的20%以上）頂體后區(qū)有空泡、頂體過小或頂過大的頭（小于頭部的40%或大于頭部的70%）有空泡的頭（未染色的空泡區(qū)域占頭部的20%以上）； 頂體過?。ㄐ∮陬^部的40%）第29頁，共37頁。WHO第5版與第4版精子形態(tài)判斷標準比較精子頸和中段判斷標準分類W

15、HO第5版WHO第4版正常標準中段應細，規(guī)則，大約與頭部長度相等，并且主軸與頭部長軸一致；長度95%可信限區(qū)間為3.3-5.2寬度95%可信限區(qū)間為0.5-0.7中段應細，大約為頭部長度的1.5倍，并且在軸線上緊貼頭部；寬度90度）、主段寬度不規(guī)則、主段卷曲以及上述缺陷的任何組合精子胞漿小滴判斷標準胞漿小滴體積大于精子頭部的1/3胞漿小滴體積大于精子頭部的1/3第31頁，共37頁。WHO第四版與第五版精子形態(tài)學評估標準比較研究研究目的：比較WHO第四版與第五版精子形態(tài)學評估標準的變化。研究對象：1000個精子圖片，一張精子形態(tài)質(zhì)控版研究方法：1.用WHO第四版的評估標準，對上述精子進行評估2.

16、精子庫9名工作人員學習第五版精子形態(tài)學評估標準及精子圖譜，并進行室內(nèi)質(zhì)量控制，統(tǒng)一評估標準，工作人員之間無顯著差異。3.用WHO第五版的評估標準，對上述精子再次進行評估。4.比較上述兩種標準分析結(jié)果的差異。研究結(jié)果：WHO第五版與第四版相比1.形態(tài)正常精子百分率高，頭部異常率低，尾部異常率低，有顯著差異；2.頸和中段異常率、胞漿小滴率無顯著差異。第32頁，共37頁。WHO第五版第四版精子形態(tài)學評估標準的主要區(qū)別1、頭部外形輪廓判斷變的寬松，僅要求大致成橢圓形。2、對頭部空泡的判斷更嚴格，多于2個空泡或者頂體后區(qū)空泡，都判斷為異常。3、頸部的長度有原來頭部的1.5倍縮短為1倍，并且寬度比第4版要

17、更細。4、尾部只有尖銳的折角才判斷為異常，而不再以彎曲角度90度為界限。5、胞漿小滴的標準無差異。第33頁，共37頁。精子形態(tài)學評估正常形態(tài)精子百分率與受精率相關異常形態(tài)精子的類型、部位和程度更重要WHO第五版手冊中精液參考值的來源12個月內(nèi)使女方妊娠的男性精液參數(shù)400-1900份精液標本（來自3大洲，8個國家）單側(cè)參考范圍，第5百分位數(shù)作為下限任何精液參數(shù)的高值都不能判斷生育力第34頁，共37頁。-精漿- 葡糖苷酶測定精漿總-葡糖甘酶的測定 檢測方法為葡萄糖氧化酶法精漿中性-葡糖甘酶的測定 精漿中既含有源自附睪的中性-葡糖苷酶同功酶，也含有源自前列腺的酸性-葡糖苷酶同功酶。前列腺分泌的酸性-葡糖苷酶能夠被十二烷基硫酸鈉（SDS）選擇性抵制，檢測過程中加入SDS后，檢測出的-葡糖苷酶活性即為中性-葡糖苷酶活性。第35頁，共37頁。臨床意義附睪是精子運輸、儲存和成熟的場所。臨床上對不育患者的診斷需要了解附睪的功能狀態(tài)。國內(nèi)處研究表明，精漿-葡糖苷酶主要由附睪分泌，是附睪的特異酶和標記酶，因此，可作為附睪的功能性指標。精漿-葡糖苷酶分泌可因附睪后的輸精管、射精管梗阻而被阻，故在梗阻性無精子癥患者中精漿-葡糖苷酶顯著降低。對于鑒別輸精管阻塞病變