微生物限度課件

1、中國藥典2010版微生物檢驗現(xiàn)狀與展望胡昌勤中國藥品生物制品檢定所2010年5月26日 上海中國藥典2010版微生物檢驗現(xiàn)狀與展望1、中國藥典2010年版微生物檢驗框架及特點 簡要介紹中國藥典2010年版微生物檢驗的基本特點。2、藥品微生物檢驗的挑戰(zhàn)和機(jī)遇 結(jié)合近年與微生物污染緊密相關(guān)的幾件藥害事件，分析當(dāng)前藥品微生物檢查面臨的問題與對策。3、微生物檢驗重點實驗室建設(shè)規(guī)劃與發(fā)展 藥品微生物檢驗重點實驗室建設(shè)的現(xiàn)實意義，以及在未來藥品微生物檢驗、控制和監(jiān)管中可能發(fā)揮的作用。闡述以微生物實驗室分析技術(shù)平臺為基礎(chǔ)、加強(qiáng)生產(chǎn)過程微生物監(jiān)控和監(jiān)管為重點、改變我國醫(yī)藥產(chǎn)品微生物高風(fēng)險現(xiàn)狀的基本思路。藥品質(zhì)

2、量標(biāo)準(zhǔn)【性狀】【鑒別】【檢查】 無菌/微生物限度【含量測定】藥品微生物檢驗概況藥品質(zhì)量體系可控性安全性有效性圖1 藥品質(zhì)量體系構(gòu)成與相互關(guān)系醫(yī)藥產(chǎn)品是人類與疾病斗爭的工具。在世界各國的醫(yī)藥實踐中，由于藥品中污染微生物而引發(fā)的悲劇時有發(fā)生。藥品微生物檢驗概況藥品中污染的微生物通過微生物體及其分泌代謝產(chǎn)物導(dǎo)致機(jī)體過敏、中毒、感染等，嚴(yán)重的可以直接導(dǎo)致菌血癥危及生命。此外，某些藥品中污染微生物通過代謝活動改變藥物組成、破壞有效成份而造成療效改變或喪失。藥品微生物檢驗概況所以，世界各國高度重視藥品微生物檢查，無菌/微生物限度檢查均為各國藥典中的重要內(nèi)容。藥品微生物檢驗概況我國開展藥品無菌檢查和微生物限

3、度檢查已有數(shù)十年的歷史。新中國第一部藥典（1953年版）收載了無菌檢查法。我國開展藥品微生物限度檢查始于1972年。1978年頒發(fā)了第一個“藥品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)”。藥品微生物檢驗概況在中央和各地政府有關(guān)部門的關(guān)懷和重視下，經(jīng)過我國藥品微生物檢驗工作者幾十年來的艱苦奮斗，我國藥品微生物檢驗工作不斷發(fā)展，標(biāo)準(zhǔn)不斷完善，逐步建立起了符合我國國情的藥品微生物檢驗標(biāo)準(zhǔn)體系。至2010版中國藥典，我國藥品無菌、微生物限度檢查方法和標(biāo)準(zhǔn)在科學(xué)性、合理性以及與國際接軌方面均有了長足進(jìn)展，使我國藥品無菌和微生物限度檢查步入了一個嶄新的時期。藥品微生物檢驗概況2006年78月發(fā)生了震驚全國的“欣弗事件”圖2 奪命的欣弗圖

4、1 死于欣弗的兒童2006年11月1日晚，肇事企業(yè)安徽華源生物藥業(yè)有限公司原總經(jīng)理裘祖貽，在公司辦公室自殺身亡。據(jù)推測，其自殺原因可能是承受不了“欣弗欣弗”事件的重壓。技術(shù)落后、標(biāo)準(zhǔn)化程度低；重要性被忽視、事故頻繁！標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)步與標(biāo)準(zhǔn)化滯后的矛盾藥品微生物檢驗現(xiàn)狀藥品微生物檢驗的機(jī)遇與挑戰(zhàn)從“欣弗”到“刺五加”，頻繁的不良事件，把藥品微生物檢驗工作推到一個前所未有的關(guān)注高度，提供了發(fā)展的機(jī)遇；藥品質(zhì)量事故高發(fā)期，如何快速、準(zhǔn)確地獲得檢驗結(jié)果，又是對當(dāng)前藥品微生物檢驗工作的一個挑戰(zhàn)。中心任務(wù) 把握機(jī)遇， 全面推進(jìn)我國藥品微生物檢驗工作； 迎接挑戰(zhàn)， 在突發(fā)、應(yīng)急檢驗中及時提供一個可靠的檢驗結(jié)論。建立

5、合理的藥品微生物風(fēng)險評價體系企業(yè)：PAT (Processing Analytical Technology)建立合理的上市藥品監(jiān)督抽驗機(jī)制監(jiān)督管理部門：以不良反應(yīng)為先導(dǎo)的國家抽驗計劃建立完善的藥品微生物檢驗和控制體系檢驗和質(zhì)控部門：樹立微生物檢驗新理念，檢測實驗微生物控制體系的認(rèn)證與監(jiān)管生產(chǎn)部門：生產(chǎn)工藝驗證和執(zhí)行監(jiān)管 基本對策微生物檢驗與微生物控制的關(guān)系圖2 藥品微生物控制、微生物檢驗與參數(shù)放行微生物檢驗微生物控制參數(shù)放行中國藥典2010年版框架2010年版中國藥典已經(jīng)編制完成，由中國醫(yī)藥科技出版社出版發(fā)行，2010年7月1日正式實施。2010年版中國藥典是新中國成立60年來組織編制的第九

6、版藥典，新版藥典在總結(jié)歷版藥典的基礎(chǔ)上，充分利用近年來國內(nèi)外藥品標(biāo)準(zhǔn)資源，注重創(chuàng)新與發(fā)展，實事求是地反映了我國醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)和臨床用藥水平的發(fā)展現(xiàn)狀，為進(jìn)一步加強(qiáng)藥品監(jiān)督管理提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。 2010年版中國藥典分為三部出版，一部為中藥，二部為化學(xué)藥，三部為生物制品。一、二、三部共同采用的附錄分別在各部中予以收載，并盡可能做到統(tǒng)一協(xié)調(diào)、求同存異、體現(xiàn)特色。 中國藥典2010年版框架2010年版中國藥典關(guān)于微生物檢查有以下主要特點：規(guī)定眼用制劑按無菌制劑要求，明確用于燒傷或嚴(yán)重創(chuàng)傷的外用劑型均按無菌要求。中藥橡膠膏劑首次提出不得檢出致病菌檢查要求。新增抑菌效力檢查法指導(dǎo)原則、藥品微生物檢驗替代

7、方法驗證指導(dǎo)原則、微生物限度檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則、藥品微生物實驗室規(guī)范指導(dǎo)原則等，以縮小附錄在微生物方面與國外藥典的差距。中國藥典2010年版框架USP31-Chart10Microbiological TestsAntimicrobial Effectiveness TestingBiological Indicators-Resistance Performance TestsMicrobial Limit Tests()Sterility TestsMicrobiological Attributes of Nonsterile Pharmaceutical ProductApplicat

8、ion of Water Activity Determination to Nonsterile Pharmaceutical ProductMicrobiological Evalution of Clean Rooms and Other Controlled EnvironmentsMicrobiological Best Laboratory PracticesValidation of Alternative Microbiological Methods中國藥典2010年版無菌檢查法微生物限度檢查法滅菌法抑菌效力檢查法指導(dǎo)原則藥品微生物檢驗替代方法驗證指導(dǎo)原則微生物限度檢查法應(yīng)用

9、指導(dǎo)原則藥品微生物實驗室規(guī)范指導(dǎo)原則中國藥典2010版微生物檢驗標(biāo)準(zhǔn)的變化質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系基本基本與國外接軌強(qiáng)調(diào)微生物檢驗的驗證及過程控制對滴眼劑的質(zhì)控水平大幅度提高部分品種特別是抗生素品種的無菌檢查法由附錄走入各論無菌檢查法微生物限度檢查法滅菌法抑菌效力檢查法指導(dǎo)原則藥品微生物檢驗替代方法驗證指導(dǎo)原則微生物限度檢查法應(yīng)用指導(dǎo)原則藥品微生物實驗室規(guī)范指導(dǎo)原則如何建立我國的微生物檢驗質(zhì)控體系！藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)藥品標(biāo)準(zhǔn)中的質(zhì)控項目、分析方法和質(zhì)控限度構(gòu)成了藥品標(biāo)準(zhǔn)的主體。質(zhì)控項目、質(zhì)控限度的合理性及檢驗方法的可操作性直接影響著質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的可執(zhí)行性。質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的現(xiàn)狀質(zhì)控項目：目前抗生素藥品標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)控項目與國外標(biāo)

10、準(zhǔn)相比已經(jīng)趨于一致。質(zhì)控方法：通過與國外方法的比較確定國內(nèi)的質(zhì)控方法。質(zhì)控限度：基本參照國外藥典。建立適合于中國國情的微生物質(zhì)控體系藥品標(biāo)準(zhǔn)實驗室建設(shè)2010版微生物檢驗方法增修訂要點環(huán)境保證培養(yǎng)基保證無菌性檢查靈敏度檢查有效的方法方法驗證SOP操作有效的結(jié)果可靠的結(jié)論結(jié)果判斷藥品微生物檢驗的關(guān)鍵點藥品微生物實驗室規(guī)范指導(dǎo)原則藥品微生物檢驗替代方法驗證指導(dǎo)原則微生物限度檢查法指導(dǎo)原則無菌檢查法中國藥典與USP、BP方法的比較比較項目ChP2005USP29BP2002檢驗條件規(guī)定總體10000級、局部100級無具體規(guī)定無具體規(guī)定人員要求無具體規(guī)定正確培訓(xùn)和認(rèn)可細(xì)菌檢查培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基

11、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基真菌檢查培養(yǎng)基改良馬丁培養(yǎng)基大豆胰酪胨培養(yǎng)基 大豆胰酪胨培養(yǎng)基 培養(yǎng)基靈敏度檢查與方法驗證用菌株金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌；生孢梭菌；白色念珠菌、黑曲霉檢驗方法只要供試品性狀允許，應(yīng)采用薄膜過濾法性狀允許的樣品均可采用薄膜過濾，利于抗菌影響去除稀釋劑與薄膜過濾沖洗液0.1蛋白胨水溶液；pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液供試品處理中的其他內(nèi)容A、D、K0.1蛋白胨水溶液（ 0.1（聚乙氧基乙醇、0.1吐溫-80）；十四烷酸異丙酯培養(yǎng)條件與時間14天（+2；3天）不少于14天（+不少于4天）14天（7天）結(jié)果判斷與復(fù)試規(guī)定一次結(jié)果為準(zhǔn) (設(shè)備及環(huán)

12、境不符合要求、實驗過程有可能引起污染的因素、陰性對照有菌生長、分離微生物可明確歸因于無菌實驗過程中所用的材料或技術(shù)錯誤造成的。單倍量重試)微生物限度檢查法中國藥典與英美藥典比較比較項目ChP2005USP29BP2002檢驗條件規(guī)定總體10000級、局部100級無具體規(guī)定無具體規(guī)定計數(shù)測定方法平皿法、薄膜過濾法、MPN平皿法、MPN平皿法、薄膜過濾法、MPN控制大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌(10)、銅綠假單胞菌、金葡球菌、梭菌、其他致病菌大腸埃希菌、沙門菌、銅綠假單胞菌、金葡球菌、大腸菌群、腸道菌、腸桿菌科大腸埃希菌、沙門菌(10)、銅綠假單胞菌、金葡球菌；腸桿菌科及某些革蘭陰性菌稀釋液pH7

13、.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液；pH6.8/7.6PBS；0.9%NaClpH7.2PBS；大豆酪蛋白消化培養(yǎng)基/乳糖肉湯培養(yǎng)基pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液；乳糖肉湯/其他培養(yǎng)基培養(yǎng)條件與時間細(xì)菌數(shù)：營養(yǎng)瓊脂，48hrs霉菌及酵母：玫瑰紅鈉瓊脂，72hrs,57天需氣菌總數(shù)：大豆酪蛋白消化物瓊脂，4872hrs霉菌及酵母：沙氏葡萄糖瓊脂或馬鈴薯葡萄糖瓊脂，57天需氣菌總數(shù)：大豆酪蛋白消化物瓊脂，5天霉菌及酵母：含抗生素的沙氏葡萄糖瓊脂、大豆酪蛋白消化物瓊脂，5天控制菌檢查結(jié)果判斷與復(fù)試規(guī)定一次檢出為準(zhǔn)不符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，取大于25g的樣品復(fù)試一次檢出為準(zhǔn)計數(shù)結(jié)果判斷與復(fù)試規(guī)定第一次結(jié)果超過規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，復(fù)

14、試兩次，三次結(jié)果平均報告不符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，取大于25g的樣品復(fù)試測定結(jié)果在規(guī)定的限度標(biāo)準(zhǔn)5倍以內(nèi)均為合格與國外藥典的差異藥典USP33/EP6.0中國藥典2010分類依據(jù)按營養(yǎng)條件分按微生物類別分質(zhì)控分類需氣、厭氣菌細(xì)菌、真菌檢驗體系直接與培養(yǎng)條件對應(yīng)選擇培養(yǎng)，或者人為區(qū)分評價簡便、嚴(yán)謹(jǐn)難以操作硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基藥典USP29EP-2001中國藥典-2010名稱Fluid Thioglycollate Medium硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基Fluid Thioglycollate Medium硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基Fluid Thioglycollate Medium硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基目的培養(yǎng)需氧、

15、厭氧和微需氧微生物（主要是厭氧菌）培養(yǎng)需氧、厭氧和微需氧微生物（主要是厭氧菌）培養(yǎng)需氧、厭氧微生物培養(yǎng)條件14天于30-35 C及20-25 C配方Pancreatic Digest of Casein(胰酪蛋白胨). .15.0 gYeast Extract(酵母浸出粉) . 5.0 gDextrose(葡萄糖). 5.5 gSodium Chloride(氯化鈉). 2.5 gL-Cystine( L-胱氨酸) . 0.5 gSodium Thioglycollate (硫乙醇酸鈉). 0.5 gAgar( 瓊脂). 0.75 gResazurin( 刃天青). .1.0 mg大豆胰酪胨培

16、養(yǎng)基(TSB)與改良馬丁培養(yǎng)基比較藥典USP29EP-2001中國藥典2010版名稱Tryptic Soy Broth (Soybean casein digest medium)大豆胰酪胨培養(yǎng)基改良馬丁培養(yǎng)基配方Pancreatic digest of Casein (胰酪蛋白胨).7.0gPapaic Digest of Soybean Meal.3.0gSoldium Chloride.5.0gDibasic Potassium Phosphate.2.5gDextrose monohydrate.2.5g蛋白胨.5.0g酵母浸出粉.2.0g葡萄糖.20.0g磷酸氫二鉀.1.0g硫酸鎂(

17、MgSO4.7H2O).0.5g目的支持廣泛微生物的生長,包括需氧菌、專性和兼性厭氧菌、真菌（主要是需氧菌）用于培養(yǎng)真菌培養(yǎng)條件14天于30-35 C及20-25 C14天于20-25 C樣品編號細(xì)菌數(shù)（cfu/g）霉菌及酵母菌總數(shù)（cfu/g）普通營養(yǎng)瓊脂TSA玫瑰紅鈉瓊脂沙氏葡萄糖瓊脂六味地黃丸156001160010102109010103110450010104101101010510101010微生物限度檢查法培養(yǎng)基的比較普通營養(yǎng)瓊脂,中國藥典細(xì)菌計數(shù)培養(yǎng)基；TSA，國外藥典細(xì)菌計數(shù)培養(yǎng)基。培養(yǎng)基體系的差異使得中國藥典結(jié)果與國外藥典結(jié)果之間不具有可比性。中國藥典培養(yǎng)基體系的靈敏度較國

18、外藥典低。藥品微生物檢驗實驗室需要解決哪些問題？是否有污染何種菌污染從那兒被污染結(jié)果判斷-欣弗事件 編號鑒定結(jié)果0206L1、肺炎克雷伯（K.pneumoniae ）；2、粘質(zhì)沙雷菌（S.marcescens）0206G1、肺炎克雷伯（K.pneumoniae ）；2、粘質(zhì)沙雷菌（S.marcescens）298L；298G1、肺炎克雷伯（K. pneumoniae ）；2、粘質(zhì)沙雷菌（S.marcescens）303L；303G1、肺炎克雷伯（K.pneumoniae ）；2、陰溝腸桿菌（Enter.cloacae）305L；305G1、肺炎克雷伯（K. pneumoniae ）；2、粘質(zhì)沙

19、雷菌（S.marcescens）306L/6G肺炎克雷伯（K.pneumoniae ）307G肺炎克雷伯（K.pneumoniae ）308L（Al.faecalis）309L（Al.faecalis）304G嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（S.maltophilia） 欣弗培養(yǎng)物潔凈環(huán)境常見菌：頭狀葡萄球菌（Staphylococcuscapitis）溶血葡萄球菌（Staphylococcushaemolyticus）緩癥鏈球菌（Streptococcusmitis）科氏葡萄球菌（Staphylococcuscohnii）藤黃微球菌（Micrococcusluteus）山羊葡萄球菌（Staphylococ

20、cuscaprae）肺炎克雷伯 巨大芽孢桿菌 粘質(zhì)沙雷菌 奪命的欣弗結(jié)果判斷-刺五加事件 云南樣品BD鑒定菌株1016-9196-D-L-1Enterobacter cloacae 1016-9196-D-L-3Enterobacter cloacae1016-9196-D-L-4Enterobacter cloacae1016-9196-1Enterobacter cloacae1016-9196-2Enterobacter cloacae1016-9196-3Enterobacter cloacae1016-9196-4Enterobacter cloacae1016-TSA-9196-D

21、-L-1Enterobacter cloacae1016-TSA-9196-D-L-2Enterobacter cloacae1016-TSA-EDM-1Enterobacter cloacae1016-TSA-EDM-2Enterobacter cloacae9196-dEnterobacter cloacae培養(yǎng)物革蘭氏染色 培養(yǎng)物革蘭氏染色 直接涂片革蘭氏染色 問題刺五加完達(dá)山樣品BD鑒定菌株H3-SSI-1Enterobacter cloacaeH3-TSA-4-1Enterobacter cloacaeH6-TSA-3-1Enterobacter cloacaeH3-SSI-2Ent

22、erobacter cloacaeH3-TSA-4-2Enterobacter cloacaeH6-TSA-3-2Enterobacter cloacae脈沖場電泳分析 藥品微生物檢驗重點實驗室建設(shè)2009年4月23日中檢所會同北京、天津、上海、黑龍江、江蘇、浙江、廣州、四川、總后等九家藥檢所的主管業(yè)務(wù)所長及微生物檢驗部門負(fù)責(zé)人在浙江省杭州市首次對藥品檢驗所微生物檢驗重點實驗室的建設(shè)問題開展研討。 增強(qiáng)系統(tǒng)能力應(yīng)對應(yīng)急檢驗第一階段：保證檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確可靠加強(qiáng)微生物實驗室建設(shè)，建立FTIR細(xì)菌譜庫，增加檢驗結(jié)果的可信度；建立應(yīng)急檢驗SOP，提升實驗室的快速檢驗?zāi)芰?；開展細(xì)菌的鑒別研究，實現(xiàn)對污染

23、菌的鑒別。第二階段：實現(xiàn)對污染菌的溯源追蹤開展分子生物學(xué)方面的工作：細(xì)菌基因物理圖譜的分析（脈沖場電泳分析技術(shù)）16S RNA鑒別分析（RCP分析技術(shù)）形成能獨立應(yīng)對突發(fā)應(yīng)急事件的能力微生物IR圖譜測定基本步驟固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)取樣并在水中制成均勻混懸液點樣真空減壓干燥制成菌膜液體培養(yǎng)基培養(yǎng)離心、鹽水洗、水洗掃描圖譜培養(yǎng)制樣FT-IR分析 標(biāo) 示 譜段(cm-1) 振動類型 代表的細(xì)胞組分 3000-2800 CH伸縮振動區(qū) 細(xì)胞膜脂肪酸 1800-1500 酰氨（、）區(qū) 細(xì)胞蛋白和肽類，DNA、RNA結(jié)構(gòu) 1500-1200 混合區(qū) 蛋白質(zhì)和脂肪酸，磷酯 1500-1400 二級脂肪酸區(qū) 兩

24、性細(xì)胞質(zhì)膜成分（蛋白質(zhì)和類脂） 1200-900 C-O伸縮振動區(qū) 細(xì)胞壁多聚糖 900-700 指紋區(qū) 長鏈脂肪酸不同來源的陰溝腸桿菌的FT-IR一階導(dǎo)數(shù)光譜（1180-900cm-1）的比較藍(lán)色來自實驗室無菌陽性樣品中的分離菌 綠色其它來源的無菌陽性樣品中的分離菌 中檢所判斷藥品污染的方案定期采集環(huán)境菌FTIR圖譜測定外環(huán)境菌譜庫內(nèi)環(huán)境菌譜庫藥品微生物檢測FTIR圖譜測定相似不相似藥品污染實驗環(huán)境污染相似不相似操作失誤進(jìn)一步比較重試藥品微生物實驗環(huán)境微生物的監(jiān)測藥品的微生物檢測環(huán)境細(xì)菌與藥品細(xì)菌的比較結(jié)論保證藥品微生物檢驗結(jié)果可靠的有效途徑藥品微生物實驗室的現(xiàn)狀具有微生物檢驗資質(zhì)的人員注：

25、上海1上海所抗生素室微生物實驗室；上海2上海所生檢室微生物實驗室。碩士包含在職研究生及已取得學(xué)位人員?？?cè)藬?shù)（人）按職稱分按學(xué)歷分主任藥師副主任藥師主管藥師藥師藥士高級工程師博士碩士本科其它黑龍江103133/127/北京5113/上海19/1215/351上海25/1121/311江蘇74人從事日常檢驗，09年擬招2名微生物專業(yè)碩士浙江9/12/四川8/341/35/總后6主任藥師以上本科以上廣州52/41天津6/321無菌室微生物實驗室面積(無菌室+其他)無菌室面積無菌微生物限度陽性操作間驗證實驗室BLS-2其他 面積黑龍江160502間1間1間/110北京/1001間2間1間 / 61間/ 20/95上海1/4間1間120上海2/68331間/江蘇501間 / 101間 / 101間/浙江200601間2間1間140四川/451間 / 121間 / 121間 / 6/總后514間1間/ 31廣州140/2間1間1間/天津381間 / 271間 / 111間 / 6注：上海1上海所抗生素室微生物實驗室；上海2上海所生檢室微生物實驗室。實驗室設(shè)備配置1注：上海1上海所抗生素室微生物實驗室；上海