利用參考資料不同的方法篩選和鑒定轉化子

1、生物工程上游技術綜合設計實驗利用不同的方法篩選和鑒定轉化子生命科學學院生揚工程09級1班同紐成員:指導教師:摘要：通過轉化子酈選、苗落直接PCR.重組質粒大小鑒定、重組質粒酶切鑒定、磴紐質粒 的進一步PCR鑒定等一系列步驟，我組成功篩選并鑒定了含有pET32-CaM5轉化子的兩個葡 落，基本掌握了轉基因生物篩選鑒定的基本方法。關鍵詞：轉化子；篩選：鑒定；PCR;凝膠電泳引言：在質粒載體上進行克隆時，由于量少，連接產物沒有也不可能再經過分離純化而獲得 純的重組質粒，連接產物中混有載體自連而成的空載體.載體與目的片段連接而成的目的重 組質粒和載體與非目的片段連接而成的非目的重組質粒。同吋，細葡（宿

2、主）的轉化效率極 低，即轉化實驗后絕大部分細菌（宿主）是沒有被轉化的，因此有必要對轉化產物進行篩選 和鑒定。首先，通過抗生素抗性從轉化后代中篩選出轉化子。然后，通過菌落直接PCR從轉 化子中弼選出候選轉基因生物。靈后，從候選瑩組子中提取質粒。一. 使用儀器、材料1、材料實驗九裝備好的轉化產物：含pET32-CaM5或pET32的E co DH5 u菌株（R , M , Amp ）2、設備用具PCR儀、恒溫搖床、臺式高速離心機、恒溫水浴鍋、瓊脂糖凝膠電泳裝置、電熱恒 溫培養(yǎng)箱、電泳儀、超凈工作臺、微量移液搶、cppendorf管（1.5mL離心管）等。3、主要試劑大腸桿菌培養(yǎng)試劑、質粒提取試劑.

3、酶切試劑、PCR反應試劑、電泳試劑以及其他 常規(guī)試劑。實驗步驟1、轉化子篩選（已做）（1）每組連接反應轉化原液取100 u L用無菌玻璃棒均勻涂布于篩選培養(yǎng)基上,37C 下培養(yǎng)半小時以上，直至液體被完全吸收。（2）倒置平板于37C繼續(xù)培養(yǎng)1216h，平板上所長出的單菌落即為轉化子。因為不 帶質粒的細胞無Amp抗性，不能在含有Amp的培養(yǎng)基時成活。2、菌落直接PCR 用無菌牙簽分別挑取4個白色轉化子菌落和一個已知的pET32- CaM5菌落,先在編 好號的5支PCR反應管中的底部分別涂搽，然后點在新的含有Amp的篩選平板上, 在其背面編號，置37C過夜后保存于4C。在PCR反應管中加入PCR反應

4、混合液, 進行PCR反應。PCR反應混合液的配制（50 u 1）lOxPCR buffer5uldNTP mixture4 u 1前向引物（Pl）2ul2ul0.5 u 136.5 u 1反向引物（P2） rTaq 酶滅菌蒸憾水（注：dNTP mixtures： dATR dTTR dGTP. dCTP 各 2.5mM前向引物（lOuM）為：5 -CGCGAATTCATGGCAGATCAGCTCACCGATGATC-3，反向引物（lOuM）為:5 -AGAGCGGCCGCCTTTGCCATCATAACTTTGACAAA-3）所有試劑按量仔細添加后，輕輕混勻，稍離心后即可，然后分為5份，每份10

5、ul加 入上述5支PCR反應管。為了防I上反應混合液蒸發(fā)，每份可添加20卩1礦物油覆蓋。（3）PCR儀的參數設置94C94 C62 C72 C72 C2 min30sec30sec30sec5 min（4）瓊脂糖凝膠電泳檢測反應結朿后，取5 u 1 PCR產品，加入21 6或10 x loading buffer,混勻后點樣. 電泳15min,觀察產品的大小。3、-重組質粒大小鑒定（1）用無菌牙簽從上述新的篩選平板上挑取PCR反應陽性菌落、，接種于含 Amp 50 u g/mL的5mLLB液體培養(yǎng)基中，37C下振蕩培養(yǎng)12h。（2）配制試劑：溶液 I： 50mM 葡萄糖，lOmMEDTA, 2

6、5 mMTris-HCl （pH8.0）,用前加溶菌酶 4mg/L；溶液 II： NaOH 溶液（內含 1 %SDS）： 0.2 M：溶液 III （pH4.8） : 60 mL 5 mol/L 醋酸鉀,11.5 mL冰醋酸，2&5 mL H2O：飽和酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）氯仿TE 緩沖液（pH8.0） : lOmMTris-HCb 1 mMEDTA,其中含 RNA 酶（RNascA）:20 pg/ml醋酸鞍（pH75&0） :75 mol/L異丙醇；70%乙醇：無水乙醇。（3）吸取1.4 ml菌液至l5ml離心管中。（4）離心（8 OOOrpm，分鐘）,棄上淸液。（如想提取多一點

7、DNA,再吸取1.4ml菌 液至同一離心管中，離心，棄上淸液）（5）加入150ML溶液I ,用旋渦振蕩器充分懸浮菌體。（6）加入200 pL溶液II,加蓋后溫和顛倒56次，直至呈透明狀。此步驟在5分鐘 內完成。（7）加入150 pL預冷的溶液【II,加蓋后反復顛倒混勻，直至岀現白色絮狀沉淀，冰 浴5分鐘。（8）離心（14OOOrpm, 10分鐘,4 C）,移取上淸液于另一干凈離心管。（9）向上清液中加等體積的苯酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）,振蕩混勻抽提，離心（14 000 rpm, 5分鐘），溶液將出現分層。（10）移取上層水相溶液（約450pL）于另一干凈離心管，加等體積氯仿，振蕩混勻

8、 抽提，離心（14 000 rpm, 5分鐘），溶液將岀現分層。（11）移取上層水相溶液于另一干凈離心管，加入1/10體積的醋酸鈉（pH5.2）和2 倍體積無水乙醇混勻，冰浴30分鐘。（12）離心（14 000rpm, 10分鐘,4C）,倒掉上淸液。（13）力n 0.5 ml預冷的70%灑精振蕩，洗DNA沉淀一次，離心5分鐘，倒掉上淸 液。（14）真空抽干或室溫自然干燥（15）力n 30M0pLTE緩沖液使DNA完全溶解,室溫放置10分鐘，降解RNA雜質, 瓊脂糖凝膠電泳或-20C保存?zhèn)溆?。?6）瓊脂糖凝膠電泳（1%）：稱取0.5g瓊脂糖粉末，加入50ml 0.5倍TBE溶液, 加熱熔化，稍

9、降溫后，加入5pL澳化乙錠（EB）,混勻，制備凝膠板，冷卻后 備用。（17）每位同學各取5pL質粒DNA加入lpL6Xloading buffer混勻，進行點樣。（18）電泳條件：120v, 25分鐘：電泳完成后，膠塊通過凝膠成像系統(tǒng)檢測，觀察實 驗結果，并拍照記錄。（19）以pGEM-T作對照，有插入片段的重組質粒電泳時遷移速度較慢。4、-重組質粒酶切鑒定利用CaM5片段上的特異酶切位點旳汕11來檢驗，該片段上兩個位點間的DNA 是 219bp.（1）酶切反應酶切反應液的配制：Wwdlll1 ul10XM buffer2ul質粒5ulddH2012ul酶切反應條件：37C水浴23小時。（2）

10、電泳檢測反應結束后，向反應液中加入2.2 u 1 10Xloading buffer,混勻以停止酶切反應，所 有22.2 U 1樣品均點在同一個點樣孔中。電泳條件：120V.45分鐘左右。電泳后，觀察 酶切結果是否與預期的相符，即觀察產品的大小。5、重組質粒的進一步PCR鑒定（1） PCR反應混合液的配制（10 P1）10 x PCR bufferl.OuldNTP mixture0.8 ul前向引物（Pl）0.4 ul反向引物（P2）0.4 u I質粒0.2 ulrTaq 酶0.1 ul火菌蒸懈水7.1 ul(注：dNTP mixtures： dATR dTTR dGTP. dCTP 各 2

11、.5mM前向引物(lOuM)為:5 -CGCGAATTCATGGCAGATCAGCTCACCGATGATC-3 反向引物(lOuM)為：5 AGAGCGGCCGCCTTTGCCATCATAACTTTGACAAA-3)所有試劑按量仔細添加后，輕輕混勻，稍離心后即可，為了防止反應混合液蒸發(fā)，可 添加20 ul礦物油覆蓋。94C2 min94 C30sec35 cycles 4 62 C30secI 72 C30sec72 C5 min瓊脂糖凝膠電泳檢測(2) PCR儀的參數設置加入1 ul 6或10 x loading buffer混勻后點樣,反應結束后，取5 u 1 PCR產品, 電泳15min

12、,觀察產品的大小。三、結果與分析1、菌落直接PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1。marker 圖1菌落直接PCR的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖1中，為已知的pET32CaM5菌落質粒，對比可知，、 為陽性轉化子，為陰性轉化子，因此，四個菌落(、)中有3 個(、)呈陽性。再對比marker可知，、與的窄條帶大 小均為6130bp,與pET32質粒大小相符：寬條帶大小均為219bp,與CaM5 ) 段大小相符。綜上初步判斷，、所代表的菌落為所需鑒泄的轉化子， 即含pET32CaM5的菌落。2、重組質粒大小鑒定瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖2. *77圖2重組質粒大小鑒定的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果 marke

13、r圖2中，對比marker可知，、條帶大小均為6130bp,符 合pET32-CaM5質粒的理論大小，表明、兩個菌落都是成功 的pET32CaM5轉化子。3、重組質粒酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖3的、。markerI 1【 圖3重組質粒酶切鑒定的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖3中，、均岀現了兩條同步的條帶，對比marker可知，在上而 的條帶大小約為6130bp,在下面（較暗）的條帶大小約為219bp,與預期 的相符，表明、兩個菌落都是成功的pET32-CaM5轉化子，至此，可 認定已篩選出目的重組子。4、重組質粒的進一步PCR鑒定瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖3的I、1【。圖3中，I、II均有條

14、帶，且大小均為443bp,與預期的相符，進一步表明 所對應的.兩個菌落都是成功的pET32-CaM5轉化子。四、結論本實驗中，首先通過抗生素抗性從轉化后代中篩選出編號為、的含 轉化子pET32-CaM5的菌落：然后通過菌落直接PCR從轉化子中篩選岀候選轉基因 生物、：最后從候選重組子、中提取質粒進行重組質粒大小鑒定及重組 質粒酶切鑒左，此兩個鑒左均表明、兩個菌落都是成功的pET32-CaM5轉化子。 另外，為進一步檢驗轉化已成功，對重組質粒進一步進行PCR鑒左，結果亦進一步表 明、兩個菌落都是成功的pET32-CaM5轉化子。五、問題與討論1、做實驗時應有團隊精神，注意分工合作，發(fā)揮最大效率。

15、例如可讓一個同學做輔助 性步驟（如先配好要用的液、調好移液槍等），另一個同學專心做主要的步驟，這 樣可節(jié)省許多時間。2、做實驗前應充分準備，了解實驗原理，弄淸每一個步驟，為實驗能有條不紊地進行 打好基礎。例如有的同學因為沒有弄淸每一個步驟是怎樣的，最終要看我組的預習 報告，否則不知道怎樣具體進行實驗，可見實驗前的充分準備是十分重要的。3、實驗時要細心，注意不要加錯試劑、防止細菌污染樣品、調準儀器等，否則實驗將 不能順利進行甚至失敗。例如重組質粒酶切鑒泄時由于粗心，我把10 x loading buffer 當成10XM buffer用，結果水浴2小時多后才發(fā)現，于是不得不重做。4、應懂得利用身邊的各種資源。例如本次實驗由學生自行設il，難度比較大，但