控制菌檢查彩片僅供參考

1、控制菌檢查藥品控制菌檢查包括：大腸桿菌、沙門菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌。 規(guī)定不得檢出。控制菌的檢查方法須根椐待檢菌的特性進(jìn)行。取供試液（1:10）10ml 相當(dāng)于供試品1g、1ml、10 cm2。直接或處理后接種，經(jīng)增菌培養(yǎng)、分離培養(yǎng)后，進(jìn)行革蘭染色、生化試驗(yàn)與血清學(xué)鑒定等項(xiàng)檢查來確定。1第一章大腸桿菌檢查法 一、 簡述大腸桿菌即大腸埃希菌，是人和溫血?jiǎng)游锬c道內(nèi)的棲居菌隨糞便排出體外。在藥品中檢出大腸桿菌表明該樣品受到人和溫血?jiǎng)游锏募S便污染。大腸埃希菌除普通大腸桿菌外尚有致病性大腸桿菌，可引起嬰幼兒、成人爆發(fā)性腹瀉。為保證人體健康，口服藥品必須檢查大腸桿菌。 2000年版中國藥典規(guī)定檢

2、驗(yàn)大腸桿菌方法為MUGI 法，即用4甲基傘形酮葡糖苷酸（MUG）和靛基質(zhì)試驗(yàn)檢查大腸桿菌。這是一項(xiàng)新技術(shù)。2 原理：實(shí)驗(yàn)證明 96 %的大腸桿菌含-葡糖苷酸酶（-glucuronidase, GUD）， 約10 %的沙門菌屬一些菌種也含此酶。MUG 被GUD 水解，產(chǎn)生熒光，由于熒光反應(yīng)的敏感度較顏色反應(yīng)強(qiáng)千萬倍易于觀察，沒有主觀性，因而用MUG 鑒定大腸桿菌已被廣泛應(yīng)用于臨床、食品、飲水、污水等的檢測。 單一的MUG鑒別大腸桿菌其漏檢率達(dá)6 % ，鑒于98 %的大腸桿菌靛基質(zhì)實(shí)驗(yàn)為陽性，故將MUG-靛基質(zhì)實(shí)驗(yàn)結(jié)合，用EMB 瓊脂平板分離，輔以I MViC實(shí)驗(yàn)，在理論上可使大腸桿菌的檢出率達(dá)9

3、9 % 。本法的檢驗(yàn)周期短。 32、檢驗(yàn)步驟: 供試液 增菌培養(yǎng)接MUG靛基質(zhì)分離培養(yǎng)革蘭染色鏡檢生化鑒定。 4 二、檢驗(yàn)程序 供試品 供試液 1：10 BL增菌培養(yǎng)液 分離培養(yǎng) 361 1824h 無菌落生長 MUG 蛋白胨 EMB或麥康凱瓊脂平板 第二次報(bào)告 361 5、24 h 靛基質(zhì) 361 1824h第一次報(bào)告 MUG 陽性、靛基質(zhì)陽性： 疑似菌落 MUG 陰性、靛基質(zhì)陰性： 純培養(yǎng) ： MUG 陽性、靛基質(zhì)陰性： 361 1824h MUG 陰性、靛基質(zhì)陽性： 革蘭染色、生化試驗(yàn) 361 2448 h 報(bào)告 （10 ml）5 三、對照用菌液的制備 藥典規(guī)定的陽性對照試驗(yàn)是必須做的。

4、陽性對照菌須加入供試液中與供試品檢驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行平行試驗(yàn)。制備：臨用前用接種環(huán)取大腸桿菌 CMCC （B）44102 的營養(yǎng)瓊脂斜面新鮮培養(yǎng)物少許，接種至滅菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中（5ml / 支），36 培養(yǎng)18 24h。（把它定為濃菌液）再按10倍系列稀釋，取1ml營養(yǎng)肉湯菌懸液（濃菌液），加到9ml0.9%無菌氯化鈉溶液混勻，為10-1，再取另一只吸管吸取10-1菌液1 ml加到9ml0.9%無菌氯化鈉溶液混勻，為10-2 以此類推，最終稀釋到含活菌數(shù)在 50 100 個(gè)/ml，同時(shí)用營養(yǎng)瓊脂平板計(jì)數(shù)。6對照菌液的制備在專用的超凈臺7 四、供試液制備 一般性供試品的供試液制備見菌落計(jì)數(shù)：抑菌性供

5、試品的供試液制備： （在試驗(yàn)中，按常規(guī)檢查法加入規(guī)定量的對照菌，不能檢出時(shí)，該項(xiàng)控制菌檢驗(yàn)結(jié)果無效，須認(rèn)真研究原因，重點(diǎn)考慮藥品的抑菌作用并制定滅活處理方法。） 1、稀釋法： 又叫擴(kuò)大培養(yǎng)基法 取規(guī)定量的供試品種入較大體積的培養(yǎng)基中，使該供試液稀釋至不具抑菌作用的濃度。 適用于：抑菌作用不強(qiáng)的各類中西藥品82、離心沉淀集菌法 取規(guī)定量的供試液（1：10取10ml）于無菌刻度離心管中，3000 r / min 離心30 min，移去上清液，留底部集菌液約2 ml ，并稀釋該供試液至原規(guī)定量。如有不溶性藥渣，可先以500r / min 離心5min ，取全部上層液，再按上述方法集菌處理。適用于：抑

6、菌作用不強(qiáng)的各類中西藥品。（固體制劑及液體制劑）9 3、薄膜過濾法 取規(guī)定量的供試液（1：10液20ml）于稀釋劑200ml 中，搖勻，以無菌操作加入裝有直徑約50 mm 、孔徑不大于0.45 0.02 m 微孔濾膜的過濾器內(nèi)，過濾，用稀釋劑沖洗濾膜，每次不少于100 ml,一般沖洗3次，抽干取出濾膜，剪成2半分別加入樣品和陽性對照增菌培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌。適用于：液體、乳劑、或通過離心可除去不溶性藥渣取其溶液的固體制劑。如：大敗毒膠囊含有動物類藥材控制菌檢查大腸桿菌、沙門菌。用離心沉淀集菌法（一次低速離心）加薄膜過濾法，陽性對照正常檢出。 10 薄膜過濾11 4、中和法 又稱滅活法。 在供試液中

7、加入相應(yīng)的中和劑以減除供試品中抑菌成分的作用。如： 含1 % 對氨基苯甲酸約15 ml 的BL增菌液（100 ml）用于磺胺類藥物。 5、 沉降法 取規(guī)定量供試液，自然沉降5min，取上層液于100ml增菌液中。 本法適用于難溶于水的抗菌制劑。12 五、增菌培養(yǎng) 1、增菌培養(yǎng)基： 膽鹽乳糖培養(yǎng)基 （BL） 分裝成100ml / 瓶 121高壓滅菌20min備用。 （藥品中污染的控制菌數(shù)量少、分布不均，且多受藥物影響呈亞致死狀態(tài)，適宜的增菌培養(yǎng)方法和高靈敏度的培養(yǎng)基是提高陽性檢出率的關(guān)鍵。）2、增菌目的： 使細(xì)菌在其生長繁殖，利于進(jìn)一步分離和鑒 定，稱之為增菌培養(yǎng)。13 3、方法： 取滅菌的膽鹽

8、乳糖培養(yǎng)基 3瓶 （100ml / 瓶）第一瓶： 加供試液 10ml+ 對照菌液1ml (約含菌50100個(gè)) (1:10) 為陽性對照. 第二瓶： 加 供試液 10ml (1:10) 為供試品 第三瓶： 加0.9%無菌氯化鈉溶液10ml 為陰性對照.以上三瓶置 37 培養(yǎng) 1824h (必要時(shí)可延至48 h )。陰性對照 應(yīng)無菌生長。14用薄膜過濾法處理后進(jìn)行增菌15 六、接種MUG靛基質(zhì)1、搖勻上述BL 增菌培養(yǎng)液，以滅菌吸管取供試品膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)液、供試品陽性對照培養(yǎng)液、陰性對照培養(yǎng)液各0.2 ml ，分別加入MUG蛋白胨培養(yǎng)基管（5ml / 支）524h后，將各管置365nm紫外燈下

9、觀察有無藍(lán)白色熒光，然后加靛基質(zhì)試液4-5滴，觀察液面顏色。2、觀察標(biāo)準(zhǔn)：(前提是陽性對照陰性對照反應(yīng)正常) MUG 陽性（有熒光）、靛基質(zhì)陽性（玫瑰紅色）, 報(bào)告檢出大腸桿菌。 MUG 陰性（無熒光）、靛基質(zhì)陰性（試劑本色）， 報(bào)告未檢出大腸桿菌。 16 MUG 靛基質(zhì) 陽性 陰性 陰性 陽性17 七、 分離培養(yǎng) （樣品中有時(shí)除致病菌外，尚有正常寄生菌的存在，因此需將樣品接種于固體培養(yǎng)基上，多需用選擇性培養(yǎng)基，適于致病菌生長。經(jīng)培養(yǎng)后，將樣品中致病菌分離出來，稱為分離培養(yǎng)。）1、培養(yǎng)基：曙紅亞甲藍(lán)瓊脂（EMB）平板。2、如供試品MUG 陽性、靛基質(zhì)陰性或MUG陰性、靛基質(zhì)陽性時(shí)，將上述供試品

10、BL 增菌培養(yǎng)液輕輕搖動，以接種環(huán)沾取12環(huán)培養(yǎng)液劃線于EMB 瓊脂平板上，培養(yǎng)18 24 h ，觀察EMB 有無可疑大腸桿菌菌落生長。3、當(dāng)陽性對照的平板呈典型菌落生長時(shí)，供試品分離平板無菌落生長，或有菌落但不同于表1 所列特征，可判為供試品1g或1ml 未檢出大腸桿菌18曙紅亞甲藍(lán)瓊脂（EMB）成分：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、 乳糖、 曙紅鈉指示 劑、亞甲藍(lán)指示劑。用途：分離腸道致病菌 說明：曙紅鈉與亞甲藍(lán)在培養(yǎng)基中起指示劑作用。如大腸桿菌分解乳糖產(chǎn)酸使pH降低，致使曙紅與亞甲藍(lán)相結(jié)合呈紫黑色或紫紅色化合物，故菌落成紫黑色或紫紅色，且有金屬光澤。在堿性環(huán)境中，曙紅、亞甲藍(lán)不能相結(jié)合，（故不分解乳糖的

11、細(xì)菌菌落為無色。） 曙紅鈉與亞甲藍(lán)有抑制革蘭氏陽性菌生長的作用。 19 表1 大腸桿菌菌落形態(tài)培養(yǎng)基 菌 落 形 態(tài) 曙紅亞甲藍(lán)瓊脂（EMB） 典型菌落呈紫黑色，圓形，稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤有金屬光澤。非典型菌落呈淺紫色、粉紅色，或菌落中心紫色或無明顯暗色中心，無金屬光澤 20在曙紅亞甲藍(lán)瓊脂（EMB）平板上菌落形態(tài)21 八、純培養(yǎng)（將分離到的可疑菌落，移種于瓊脂斜面上，以便獲得該菌的純培養(yǎng)。移種時(shí)應(yīng)注意挑選單個(gè)菌落，否則會帶有雜菌而得不到純培養(yǎng)）1、 培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂斜面2、挑選23 個(gè)以上疑似菌落，分別接種營養(yǎng)瓊脂斜面，培養(yǎng)18 24 h 。3、用于：做革蘭染色、鏡檢、IMViC

12、 生化試驗(yàn)。 22 九、革蘭染色、鏡檢1、 以接種環(huán)沾取無菌水于潔凈載玻片上，取上述疑似菌落的營養(yǎng)瓊脂斜面新鮮培養(yǎng)物少許，與載玻片上無菌水混合，制成均勻涂片，自然或微溫干燥，再通過火焰23次（載玻片不燙手）固定。2、 滴加結(jié)晶紫染液，染色1min ，水洗。3、 滴加碘液，染1min ，水洗，以濾紙吸干余水。4、 滴加 95 % 乙醇，脫色 20 30 秒，水洗。5、 滴加沙黃染液，復(fù)染 1 min ，水洗， 待干后， 鏡檢。236、染色結(jié)果：革蘭陽性菌呈藍(lán)紫色；革蘭陰性菌呈紅色。大腸桿菌為革蘭陰性短桿菌，或球桿菌狀，亦有桿菌狀。7、 革蘭染色注意事項(xiàng)（1） 玻片必須潔凈，涂片菌量亦少，菌不可濃

13、，可用接種針取菌。（2） 培養(yǎng)物的菌齡以1624h為宜。培養(yǎng)時(shí)間過長的革蘭陽性菌易染成紅色。（3） 脫色是關(guān)鍵，脫色時(shí)間不足菌細(xì)胞易染成陽性，脫色時(shí)間過長易染成陰性。 24 十、結(jié)果判斷前提： 當(dāng)陰性對照呈陰性，陽性對照 呈陽性：1、供試品MUG陽性、靛基質(zhì)陽性 報(bào)告檢出大腸桿菌。2、供試品MUG陰性、靛基質(zhì)陰性 報(bào)告未檢出大腸桿菌。3、供試品MUG陽性、靛基質(zhì)陰性、或MUG陰性、靛基質(zhì)陽性，EMB平板無菌落生長判未檢出大腸桿菌。254、供試品MUG陽性、靛基質(zhì)陰性、IMViC 試驗(yàn)為 、革蘭陰性桿菌，檢出大腸桿菌。5、供試品MUG陰性、靛基質(zhì)陽性、IMViC 試驗(yàn)為 、革蘭陰性桿菌，檢出大腸

14、桿菌。6、 供試品培養(yǎng)物檢查不符合 4、5 二項(xiàng)中的任一項(xiàng)，報(bào)告1g 或1ml 供試品未檢出大腸桿菌。7、 當(dāng)陰性對照有菌生長或陽性對照未生長或生長菌落不是大腸桿菌，不能出檢驗(yàn)報(bào)告。 26 十一、注意事項(xiàng)結(jié)果觀察：取供試品的MUG試驗(yàn)管、陽性對照管、陰性對照管同時(shí)在365 nm 紫外燈下觀察，陽性對照管應(yīng)有較強(qiáng)藍(lán)白色熒光，陰性對照管無熒光。陽性對照菌液的制備、記數(shù)及加入含供試品的培養(yǎng)基中等操作不能在檢測供試品的無菌室或凈化臺上進(jìn)行，以免污染供試品及操作環(huán)境。在各類供試品中檢測大腸桿菌及其它控制菌，按一次檢出結(jié)果為準(zhǔn)，不再抽樣復(fù)驗(yàn)。檢出的大腸桿菌及其它控制菌培養(yǎng)物須保留1個(gè)月，備用。27 第二章

15、、沙門菌檢查法 一、概述沙門菌屬是腸桿菌科的重要致病菌，包括常見的傷寒、甲型副傷寒、乙型副傷寒、丙型副傷寒、鼠傷寒，豬霍亂等沙門菌在內(nèi)。藥品中的沙門菌，是以鑒定沙門菌屬為準(zhǔn)，即對每g（或ml）藥品中是否檢出沙門菌做出檢驗(yàn)報(bào)告。標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，不得檢出沙門菌。28藥品中污染的沙門菌可受到損傷或呈休眠狀態(tài)，故須在增菌培養(yǎng)前先進(jìn)行預(yù)增菌，然后再進(jìn)行增菌、分離、三糖鐵瓊脂初步鑒別、生化試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)等檢驗(yàn)步驟。本方法適用于：含動物組織來源（包括提取物）及動物類原藥材粉（動物角、蜂蜜、王漿、阿膠除外）的口服制劑 。 如：中成藥制劑中含有麝香、雞內(nèi)金、蜈蚣、牛膽粉、豹骨等等復(fù)方制劑。都要檢沙門菌。 29二、檢

16、驗(yàn)步驟： 供試品 供試液 預(yù)增菌（營養(yǎng)肉湯） 361 1824h 增菌（四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基 361 1824h （強(qiáng)）SS瓊脂 EMB 瓊脂 （弱） 361 1824h 無疑似菌落報(bào)告 30三 糖 鐵 瓊 脂 斜 面營養(yǎng)瓊脂氰化鉀試驗(yàn)血清學(xué)凝集試驗(yàn)靛基質(zhì)試驗(yàn)?zāi)蛩孛冈囼?yàn)賴氨酸脫梭酶半固體營養(yǎng)瓊脂革蘭染色鏡檢報(bào)告361 1824h報(bào)告31 三、預(yù)增菌 1、預(yù)增菌意義：修復(fù)受損的細(xì)菌。 （藥品中污染的沙門菌，因受到加溫、冷凍等加工過程的影響，細(xì)菌受到不同程度的損傷，稱為亞致死損傷，如果將細(xì)菌直接進(jìn)行增菌培養(yǎng)，往往不易得到陽性結(jié)果，故在增菌培養(yǎng)前，將供試品接種在無選擇性增菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使受損的細(xì)菌

17、得以修復(fù)，然后再轉(zhuǎn)種至增菌培養(yǎng)基中。）2、培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。3、方法：操作同大腸埃希氏菌增菌。4、對照菌：乙型副傷寒沙門菌 CMCC（B）50094 5、培養(yǎng)1824 h 后觀察。 32 用薄膜過濾法處理后進(jìn)行預(yù)增菌33 四、增菌培養(yǎng)1、增菌培養(yǎng)目的：使沙門菌屬以外的細(xì)菌（如：大腸埃希氏菌）受到抑制，使沙門菌屬得到一定的增殖。2、增菌培養(yǎng)基： 四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基（TTB）10 ml / 支。3、配制： 各成分混合，加熱溶解、分裝每支10ml 。分裝時(shí)應(yīng)隨時(shí)振搖，使其中碳酸鈣均勻地分裝到各試管中。121滅菌20min。（為基礎(chǔ)液） 備用。臨用前每支基礎(chǔ)液中加入碘溶液 0.2ml約4滴、加

18、0.1%亮綠溶液0.1ml 約2滴，混勻。 344、方法： 輕微搖動供試品增菌培養(yǎng)瓶及陽性對照培養(yǎng)瓶，分別吸取1 ml 接種于各1管已加入碘溶液和亮綠試液的四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824h。 陽性對照管應(yīng)呈現(xiàn)混濁。四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基和基礎(chǔ)液35 四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基 成分： 蛋白胨、硫代硫酸鈉、膽鹽、碳酸鈣。 臨用前每支基礎(chǔ)液中加入碘溶液 0.2ml 約4滴、加0.1%亮綠溶液0.1ml 約2滴， 混勻。 說明：（碘可氧化硫代硫酸鈉而形成四硫磺酸鈉。對大腸桿菌有抑制作用，膽鹽也有抑菌作用，對痢疾桿菌也有一定抑制作用，而有利于沙門氏菌的生長。碳酸鈣有緩沖作用，可使沙門氏菌不至于因培養(yǎng)液酸

19、堿度改變而死亡。亮綠為抑菌劑 （見ss培養(yǎng)基） 36第一步： 碘溶液 0.2m、亮綠試液0.1ml 四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基 (基礎(chǔ)液) 第二步： 供試品預(yù)增菌培養(yǎng)液1 ml （或陽性對照預(yù)增菌培養(yǎng)液）37 五、分離培養(yǎng) 1、分離培養(yǎng)基： 強(qiáng)選擇性的：沙門、志賀菌屬瓊脂（SS） 中等選擇性：膽鹽硫乳瓊脂（DHL） 弱選擇性的：曙紅亞甲藍(lán)瓊脂（EMB）（選擇性培養(yǎng)基中除含有抑制非腸道致病菌的成分外，主要借助于指示系統(tǒng)，使沙門菌等腸道致病菌與其它非致病菌區(qū)別開來。進(jìn)行分離培養(yǎng)時(shí)，常將選擇性強(qiáng)、弱的培養(yǎng)基聯(lián)合使用，有助于提高分離效果。一般強(qiáng)弱各用一個(gè)。）2、 方法： 輕微搖動供試品增菌培養(yǎng)瓶和陽性對照增

20、菌培養(yǎng)瓶，以接種環(huán)分別沾取12 環(huán)培養(yǎng)液劃線于沙門菌志賀菌瓊脂（SS ）平板及曙紅亞甲藍(lán)（EMB）瓊脂平板各1個(gè)，倒置培養(yǎng)2448 h。檢查平板上有無疑似沙門菌菌落 。38沙門菌在SS平板上的菌落形態(tài)39沙門菌在EMB平板上的菌落形態(tài)40SS 瓊脂平板成分：硫代硫酸鈉、牛肉浸出粉、乳糖、中性紅指示劑、 亮綠試液、牛膽鹽、枸櫞酸鈉、枸櫞酸鐵銨、瓊脂、水。用途：分離沙門氏桿菌說明：其作用可分為a 營養(yǎng)物：如牛肉浸出粉、胨。b 抑制劑：如亮綠試液、牛膽鹽、硫代硫酸鈉、枸櫞酸鈉 等抑制病原菌的生長。C 促進(jìn)目的菌生長的物質(zhì)：膽鹽既為抑制劑又能促進(jìn)病原菌的生長。D 鑒別用糖： 乳糖。E 指示劑：中性紅。

21、解釋：為選擇性培養(yǎng)基，借助于指示系統(tǒng)，分離沙門菌。41第一套指示系統(tǒng)為：糖發(fā)酵反應(yīng)區(qū)別大腸桿菌、沙門菌。大腸桿菌能分解乳糖，而多數(shù)病原菌不分解乳糖，本培養(yǎng)基利用這一特性來初步鑒別腸道內(nèi)的病原菌與非病原菌。大腸桿菌分解乳糖產(chǎn)酸，通過中性紅指示劑呈紅色菌落，同時(shí)由于與膽鹽相結(jié)合成膽酸而發(fā)生沉淀，故菌落中心混濁。沙門氏及痢疾桿菌屬不分解乳糖而分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生堿性物質(zhì)，故成現(xiàn)透明微黃色菌落。第二套指示系統(tǒng)為：H2S反應(yīng)：枸櫞酸鐵能使產(chǎn)生硫化氫的細(xì)菌菌落中心成黑色，硫代硫酸鈉有緩和膽鹽對痢疾桿菌及沙門氏菌的有害作用，并能中和亮綠和中性紅染料的毒性。423、沙門菌在分離平板上的菌落特征：（1）沙門菌不發(fā)酵乳

22、糖和蔗糖，不產(chǎn)酸，菌落不著色，一般為無色半透明，（2）多數(shù)沙門菌因產(chǎn)生H2S ，菌落中心呈現(xiàn)黑色甚至全黑色，分離沙門菌，應(yīng)以出現(xiàn)單個(gè)疑似菌落為準(zhǔn)，否則應(yīng)以重新分離。陽性對照平板上，應(yīng)有沙門菌落形態(tài)特征的菌落生長，否則，應(yīng)查明原因。若為供試品抑菌成分所致，須重新制備供試液，消除抑菌成分后再行檢查。43 平 板 沙門菌屬亞屬 沙門菌屬亞屬 沙門、志賀菌屬瓊脂 （S S）無色微帶粉紅色，透明或半透明，邊緣整齊、光滑、中等大小或較小、產(chǎn)H2S的菌落，中心呈黑色。同一平板上帶有多數(shù)菌落無黑色中心 同膽鹽硫乳瓊脂平板，但發(fā)酵乳糖無黑色中心的菌落與大腸埃希菌不能區(qū)別 曙紅亞甲藍(lán)瓊脂 （EMB） 無色或微帶橙

23、色，透明或半透明、中等大小邊緣整齊、光滑、 發(fā)酵乳糖的菌株菌落為紫色。，遲緩發(fā)酵乳糖或不發(fā)酵乳糖的菌株與沙門菌亞屬同。 沙門菌的菌落特征444、第一次判斷： 如陽性對照平板呈現(xiàn)陽性菌落時(shí)，供試品平板無菌落生長或無疑似菌落生長，則可判為未檢出沙門菌。 當(dāng)供試品平板生長有可疑菌落時(shí)進(jìn)行下面試驗(yàn)。 45 六、初步鑒別試驗(yàn)1、鑒別培養(yǎng)基： 三糖鐵瓊脂斜面 TSI （為半固體培養(yǎng)基）（1）成分：胨、 硫酸亞鐵、牛肉浸出粉、硫代硫酸鈉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、氯化鈉、酚磺指示液、瓊脂、水。 （2）配制注意：配制后分裝于11100試管中高壓滅菌后，趁熱取出立即擺成使其斜面底部不少于23，即高底層短斜面。 46（

24、3）三糖鐵瓊脂斜面 TSI本培養(yǎng)基含二套指示系統(tǒng)，檢查糖類發(fā)酵和H2S 產(chǎn)生情況。第一套指示系統(tǒng)乳糖，蔗糖，葡萄糖，以酚紅為指示劑?？梢猿霈F(xiàn)兩種情況：a當(dāng)待檢菌發(fā)酵乳糖、或蔗糖時(shí)，產(chǎn)酸量較多使整個(gè)培養(yǎng)基底層及斜面均呈黃色（乳糖、蔗糖與葡萄糖的比例為10：1） b 當(dāng)代檢菌僅發(fā)酵葡萄糖時(shí)，產(chǎn)酸量較少， 斜面細(xì)菌分解蛋白胨放氨紅色 底層因氧壓低仍保持酸性黃色第二套指示系統(tǒng)：硫酸亞鐵，硫代硫酸鈉與H2S反應(yīng)產(chǎn) H2S的細(xì)菌使硫代硫酸鈉分解，產(chǎn)生的H2S與Fe2形成硫酸亞鐵不溶性黑色沉淀（硫化鐵）。反應(yīng)需在較為厭氧的條件下進(jìn)行，故觀察到的黑色反應(yīng)在培養(yǎng)基底層。472 、接種從每一個(gè)供試品的分離平板上挑

25、取23 個(gè)疑似菌落分別接種于三糖鐵瓊脂斜面。接種時(shí)應(yīng)以接種針輕輕接觸單個(gè)菌落中心部位，沾取培養(yǎng)物劃線于斜面并穿刺到底層或先穿刺底層再劃線斜面，培養(yǎng)242 h ，觀察結(jié)果。（觀察反應(yīng)的時(shí)間不能提前或推遲，否則均可引起判斷錯(cuò)誤）。483、觀察現(xiàn)象： （1）觀察動力：（在瓊脂底層，一般單取一支培養(yǎng)基穿刺作動力）有動力的細(xì)菌生長，由穿刺線擴(kuò)展到整個(gè)底層，使培養(yǎng)基變濁。無動力的細(xì)菌則僅沿穿刺線生長，形成一條清晰的生長線。（2） 觀察氣體：如果產(chǎn)生氣體，可使瓊脂層出現(xiàn)氣泡甚至斷裂現(xiàn)象。（3）觀察顏色：底層和斜面顏色變化。 49產(chǎn)生氣體、顏色的變化504、疑似沙門菌在三糖鐵瓊脂斜面上的反應(yīng)為： 斜面紅色底層

26、黑色（產(chǎn)H2S ）并顯示黃色（產(chǎn)酸）； 斜面紅色，底層黃色； 斜面黃色，底層黑色，并顯示黃色。沙門菌僅發(fā)酵葡萄糖，均不發(fā)酵乳糖及蔗糖，90%以上的沙門菌產(chǎn)生H2S。多數(shù)沙門菌在三糖鐵瓊脂上產(chǎn)生氣體，使底層瓊脂出現(xiàn)氣泡或使瓊脂斷裂 。51525、第二次判斷： 對在三糖鐵瓊脂斜面未見紅色、底層未見黃色，可判未檢出沙門菌。 當(dāng)供試品平板生長有可疑菌落時(shí)進(jìn)行下面試驗(yàn)： 生化試驗(yàn)(靛基質(zhì)試驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)、氰化鉀試驗(yàn)、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)、動力試驗(yàn)) 血清學(xué)凝集試驗(yàn) 革蘭染色，鏡檢沙門菌應(yīng)為革蘭陰性桿菌。53 七、結(jié)果判斷第一次判斷 分離培養(yǎng)后，見五(4)。第二次判斷 初步鑒別試驗(yàn)(三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基)后，見六(

27、5)。第三次判斷 生化試驗(yàn)后按規(guī)定報(bào)告。54反映類型底層斜面氣體H2s可 能 菌 屬1普通變形桿菌，枸櫞酸桿菌屬、亞利桑那沙門菌2埃希菌屬、克雷伯菌屬、腸桿菌屬、枸櫞酸桿菌屬3沙雷菌屬、埃希菌屬腸球菌4普通變形桿菌5產(chǎn)堿桿菌、假單胞菌屬6沙門菌屬7沙門菌屬、奇異變形桿菌，愛德華菌屬、普通變形桿菌枸櫞酸桿菌屬8沙門菌屬、摩根氏變形桿菌、普洛菲登斯菌屬9志賀菌屬、沙門菌屬、雷極變形桿菌、埃希菌屬沙門菌及其它細(xì)菌在TSI斜面上的反應(yīng)55 第三章、銅綠假單胞菌檢查法 一、概述1、銅綠假單胞菌，習(xí)稱綠膿桿菌，為假單胞菌屬種，廣泛分布在土壤，水及空氣，人和動物的皮膚、腸道、呼吸道均有存在，故可通過環(huán)境和生

28、產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)污染藥品。 2、本法適用于外用藥品及一般滴眼劑、眼膏劑的檢查。如軟膏劑、氣霧劑、膜劑等并規(guī)定不得檢出。563、對照用菌銅綠假單胞菌CMCC（B）10104 見大腸桿菌菌液制備。4、供試液制備：見大腸桿菌 外用軟膏、眼膏、取量常為5g,加0.9%無菌氯化鈉溶液至100ml，配制后濃度為1:20, 增菌試驗(yàn)時(shí)要取20ml, (相當(dāng)于供試品1g或1ml)，這一點(diǎn)很重要。5、按增菌分離純培養(yǎng)革蘭染色鏡檢及生化試驗(yàn)等步驟進(jìn)行檢驗(yàn)。57 二、增菌培養(yǎng) 1、增菌培養(yǎng)基：膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）100ml / 瓶2、增菌目的 ：見大腸桿菌3、方法：同大腸桿菌，對照菌液是 銅綠假單胞菌（有抑菌作用的供

29、試品：要采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄏ志饔煤笤僭鼍?以保證檢驗(yàn)。）4、培養(yǎng)現(xiàn)象：在BL 培養(yǎng)基中，如有銅綠假單胞菌生長，培養(yǎng)基液面多有一層薄菌膜，培養(yǎng)液常呈綠色或藍(lán)綠色。58 三、分離培養(yǎng) 1、分離培養(yǎng)基： 溴化十六烷基三甲胺瓊脂平板 2、培養(yǎng)基特點(diǎn)：溴化十六烷基三甲胺瓊脂平板選擇性強(qiáng)，大腸埃希氏菌不能生長，革蘭氏陽性菌生長較差。3、方法：同大腸埃希菌 59 四、菌落形態(tài)： 典型菌落為扁平、圓形或無定形、光滑濕潤，呈灰白色，周邊略呈擴(kuò)散現(xiàn)象，在菌落相鄰處常有融合現(xiàn)象。菌落周圍常有水溶性籃綠色素?cái)U(kuò)散，使培養(yǎng)基顯籃綠色，但亦有不產(chǎn)色素的菌株。菌落還有粗糙型和粘液型等，應(yīng)注意挑選。60 五、第一次報(bào)告 當(dāng)陽

30、性對照平板呈典型菌落生長時(shí)，供試品平板無菌落生長或無疑似菌落生長，可判未檢出銅綠假單胞菌。當(dāng)陽性對照平板無菌落生長或生長菌落經(jīng)檢查不是銅綠假單胞菌，應(yīng)研究原因，重新試驗(yàn)或重新制備供試液。當(dāng)供試品分離平板生長菌落與銅綠假單胞菌特征相似，即典型或呈疑似菌落時(shí)，應(yīng)挑選該菌落純培養(yǎng)。61 六、純 培 養(yǎng) 1、 培養(yǎng)基： 營養(yǎng)瓊脂斜面：2、方法：同大腸埃希菌， 此培養(yǎng)物可以做以下檢查： 1、革蘭染色、鏡檢銅綠假單胞菌為革蘭陰 性無芽孢桿菌。單個(gè)、 成對或呈短鏈排列。 2、生化試驗(yàn)氧化酶試驗(yàn)、綠膿菌素試驗(yàn)、（當(dāng)綠膿菌素試驗(yàn)陰性時(shí)進(jìn)行如下試驗(yàn)：硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)、42生長試驗(yàn)、 明膠液化試驗(yàn))62 氧化酶試

31、驗(yàn)： 未滴試藥之前培養(yǎng)物是黃色 滴試藥后30秒內(nèi)出現(xiàn)粉紅色 陽性反應(yīng)： 63 綠膿菌素試驗(yàn)：綠膿菌素培養(yǎng)基斜面 攪碎的培養(yǎng)基加入氯仿 陽性反應(yīng)64 七、結(jié)果判斷1 見第一次報(bào)告。2 供試品如證實(shí)為非革蘭陰性桿菌，氧化酶試驗(yàn)陰性、均可判為未檢出銅綠假單胞菌。否則應(yīng)進(jìn)行綠膿菌素試驗(yàn)。3 當(dāng)綠膿菌素試驗(yàn)的陰性對照試驗(yàn)呈陰性時(shí)，綠膿菌素試驗(yàn)呈陽性，并為革蘭陰性桿菌，氧化酶試驗(yàn)陽性，可判檢出銅綠假單胞菌。4 當(dāng)綠膿菌素試驗(yàn)陰性時(shí)，應(yīng)取培養(yǎng)物做硝酸 鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)、42生長試驗(yàn)、及明膠液化試驗(yàn)均為陽性時(shí)應(yīng)判檢出銅綠假單胞菌。65分離平板未檢出報(bào)告分離平板可疑G染色、氧化酶試驗(yàn)： 非陰性 陰性未檢出 陰性桿

32、菌 陽性做綠膿菌素試驗(yàn) 陽性報(bào)告檢出 陰性 42 生長、硝酸鹽還原產(chǎn)生 明膠液化 + + + 報(bào)告檢出66第四章、金黃色葡萄球菌檢查法 一、概述1、金黃色葡萄球菌為葡萄球菌屬中的一種，廣泛分布于自然界、空氣、土壤、水及物品上。人和動物皮膚與外界相同的腔道中，也常有本菌存在 。是人類化膿性感染中最重要的病原菌。因此，在外用藥及一般滴眼劑中規(guī)定不得檢出金黃色葡萄球菌。2、本方法適用于：外用藥及一般滴眼劑、眼膏劑、滴鼻劑、氣霧劑、膜劑等的檢查。3、對照用菌液的制備：同大腸桿菌菌液制備。 對照菌：金黃色葡萄球菌 CMCC（B）260034、供試液制備：同銅綠假單胞菌。67 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)流程： 供

33、試品 供試液 增菌 營養(yǎng)肉湯 361 1824h分離 甘露醇高鹽瓊脂平板 361 2472h 有疑似菌落生長 無菌落生長 純培養(yǎng) 營養(yǎng)瓊脂斜面 第一次報(bào)告 361 1824h 革蘭染色、鏡檢 血漿凝固酶試驗(yàn) 報(bào)告 681、增菌培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。分裝成100ml / 瓶 121高壓滅菌20min備用 。2、增菌目的：見大腸桿菌檢驗(yàn)。3、方法：見大腸桿菌檢驗(yàn)。 陽性對照菌：金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003 4、特點(diǎn)：金黃色葡萄球菌在肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)，生長后渾濁，隨之變清，菌體懸浮或沉淀。 二、增菌培養(yǎng)69 三、分離培養(yǎng) 1、分離平板：甘露醇氯化鈉瓊脂平板。 （含鹽7.5%） 2、甘露醇

34、氯化鈉瓊脂平板特點(diǎn)： 多數(shù)致病性葡萄球菌能在含有大量鹽分的培養(yǎng)基中生長，并可分解甘露醇使培養(yǎng)基呈淡橙黃色。血漿凝固酶陰性的葡萄球菌、微球菌及大部分革蘭氏陰性桿菌在此培養(yǎng)基上不生長。703、方法： 將上述供試品增菌液及陽性對照液輕輕搖勻，用接種環(huán)沾取12 環(huán)增菌液劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂平板，置36培養(yǎng)24 72 h。 71培養(yǎng)基菌落形態(tài)特征卵黃氯化瓊脂平板金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，光滑濕潤，外周有分解卵磷脂后產(chǎn)生的乳濁圈，菌落直徑12mm。 甘露醇氯化 鈉瓊脂平板金黃色，圓形凸起，邊緣整齊，光滑濕潤，外周有黃色環(huán)，菌落直徑0.71mm。 4、金黃色葡萄球菌在兩種分離培養(yǎng)基上菌落形態(tài)特征72

35、 5、第一次結(jié)果判斷 當(dāng)陽性對照平板呈典型菌落生長，供試品分離平板無菌落生長或有菌落生長但不同于上表所列特征，可報(bào)告未檢出金黃色葡萄球菌。當(dāng)供試品分離平板生長菌落與上表所列特征相似的典型形態(tài)，應(yīng)挑選該菌落作純培養(yǎng)。當(dāng)陽性對照平板未生長或生長菌落經(jīng)檢查不是金黃色葡萄球菌時(shí)，應(yīng)研究原因，重新制備供試液,以消除供試品抑菌成分的影響。選用適宜的方法進(jìn)行增菌。如薄膜過濾法、離心法、稀釋法等。73 四、純 培 養(yǎng) 1、適用于供試品分離平板生長菌落與上表所列菌落特征相似時(shí)，應(yīng)選取23個(gè)菌落分別用接種針輕輕沾取菌落中的表面培養(yǎng)物接種與營養(yǎng)瓊脂斜面上，于361培養(yǎng)18 24h。2、 此培養(yǎng)物可用于：革蘭染色、鏡

36、檢及血漿凝固酶試驗(yàn)。74 五、革蘭染色、鏡檢革蘭染色：見大腸桿菌檢查法 鏡檢： 金黃色葡萄球菌為革蘭陽性球菌無芽孢、排列呈不規(guī)則的葡萄狀，亦可呈單個(gè)、成雙或鏈狀排列，少數(shù)可散在。75 六、血漿凝固酶試驗(yàn)1、原理：某些細(xì)菌如金黃色葡萄球菌，產(chǎn)生血漿凝固酶。分泌到菌細(xì)胞外，稱為游離血漿凝固酶。它能使血漿中的纖維蛋白原變?yōu)槔w維蛋白。試管法血漿凝固酶試驗(yàn)，陽性是由此酶形成。2、 血漿凝固酶試驗(yàn)過程：取試管3支第一支加血漿氯化鈉液0.5ml 加供試品的營養(yǎng)肉湯液0.5ml 3624h 凝固 為陽性反應(yīng)； 血流自如 不凝固 為陰性反應(yīng)；第二支加血漿氯化鈉液0.5ml 加金黃色葡萄球菌的營養(yǎng)肉湯液0.5ml 3624h 凝固 為陽性對照 第三支加血漿氯化鈉液0.5ml 加氯化鈉溶液 0.5ml 3624h 血流自如 為陰性對照 76 七、結(jié)果判斷當(dāng)陰性對照成陰性、陽性對照成陽性時(shí)按下列報(bào)告： 1 見第一次報(bào)告2 革蘭染色為陽性球菌、血漿凝固酶試