分子標(biāo)記技術(shù)

1、關(guān)于分子標(biāo)記技術(shù)第一張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月DNA指紋分析研究是一種重要的分子標(biāo)記技術(shù)，它包括RFLP（restriction fragment length polymorphism）、RAPD（randomly amplified polymorphic DNA）、AFLP（amplified fragment length polymorphism）、SSR（simple sequence repeat）和ISSR（inter-simple sequence repeat）等這些在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的檢測(cè)DNA多態(tài)性的分子標(biāo)記技術(shù)。 第二張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于202

2、2年6月 分子標(biāo)記的優(yōu)越性表現(xiàn)為：（1）分子信息是可遺傳的，而只有在遺傳上可傳遞的屬性才能提供評(píng)估系統(tǒng)發(fā)育的信息；（2）數(shù)量極多，遍布整個(gè)基因組，可檢測(cè)座位幾乎無(wú)限；（3）分子標(biāo)記能提供共同的尺度；（4）分子數(shù)據(jù)能將從共同祖先遺傳下來(lái)的同源性和由于趨同進(jìn)化從不同祖先演變而來(lái)的相似性區(qū)分開(kāi)來(lái)表現(xiàn)為中性，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)；（5）任何生物有機(jī)質(zhì)包括動(dòng)物、植物和微生物有許多共同的分子屬性，因此分子數(shù)據(jù)可提供共同尺度來(lái)直接比較任何有機(jī)體任何分類(lèi)層次之間相對(duì)水平的遺傳變異 ；（6）分子標(biāo)記技術(shù)可應(yīng)用于各個(gè)生物門(mén)類(lèi)，并都可用于比較和綜合分析。第三張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月分子標(biāo)記的選擇理想

3、的分子標(biāo)記應(yīng)該符合的標(biāo)準(zhǔn)是：多態(tài)性高；共顯性遺傳，在二倍體生物中能區(qū)分純合與雜合狀態(tài)；在基因組中頻繁出現(xiàn)，甚至貫穿分布于整個(gè)基因組；選擇中性；容易獲得；容易操作，自動(dòng)化程度高；重復(fù)性好；所獲得的數(shù)據(jù)能進(jìn)行交流和比較。 第四張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二、蛋白質(zhì)標(biāo)記在蛋白質(zhì)多態(tài)性研究基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的分子標(biāo)記技術(shù)稱(chēng)為蛋白質(zhì)標(biāo)記，最常用的技術(shù)是蛋白質(zhì)電泳及與其配套的專(zhuān)一性染色，如曾經(jīng)廣為采用的等位酶分析，是通過(guò)同一基因位點(diǎn)上不同等位基因編碼的同種酶的不同分子形式，使得酶譜分析具有相關(guān)的遺傳學(xué)意義，酶譜的變化反應(yīng)了等位基因和位點(diǎn)的變化。等位酶技術(shù)為植物的種群遺傳學(xué)和進(jìn)化研究作出了重要的貢獻(xiàn)

4、。但由于等位酶缺乏足夠的變異，在技術(shù)上存在一定的局限性，如今已逐漸被DNA標(biāo)記所取代。 第五張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三、DNA分子標(biāo)記的種類(lèi) 分子標(biāo)記大多以電泳譜帶的形式表現(xiàn)，大致可分為三大類(lèi)。 第一類(lèi)是以分子雜交為核心的分子標(biāo)記技術(shù)，包括： 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記（Restriction fragment length polymorphism, 簡(jiǎn)稱(chēng)RFLP標(biāo)記）； DNA指紋技術(shù)（DNA Fingerprinting）； 原位雜交（in situ hybridization）等；第六張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 第二類(lèi)是以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase

5、 chain reaction ,簡(jiǎn)稱(chēng)PCR反應(yīng)）為核心的分子標(biāo)記技術(shù)，包括： 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（Random amplification polymorphism DNA, 簡(jiǎn)稱(chēng)RAPD標(biāo)記）； 簡(jiǎn)單序列重復(fù)標(biāo)記（Simple sequence repeat, 簡(jiǎn)稱(chēng)SSR標(biāo)記）或簡(jiǎn)單序列長(zhǎng)度多態(tài)性（Simple sequence length polymorphism, 簡(jiǎn)稱(chēng)SSLP標(biāo)記）； 擴(kuò)展片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記（Amplified fragment length polymorphism, 簡(jiǎn)稱(chēng)AFLP標(biāo)記）； 序列標(biāo)簽位點(diǎn)（Sequence tagged sites, 簡(jiǎn)稱(chēng)ST

6、S標(biāo)記）； 序列特征化擴(kuò)增區(qū)域（Sequence charactered amplified region, 簡(jiǎn)稱(chēng)SCAR標(biāo)記）等；第七張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 第三類(lèi)是一些新型的分子標(biāo)記，如： 單核苷酸多態(tài)性（Single nuleotide polymorphism, 簡(jiǎn)稱(chēng)SNP標(biāo)記）； 表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed sequences tags, 簡(jiǎn)稱(chēng)EST標(biāo)記）等。第八張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月四、分子標(biāo)記的特點(diǎn) （1）直接以DNA的形式表現(xiàn)，在生物體的各個(gè)組織、各個(gè)發(fā)育階段均可檢測(cè)到，不受季節(jié)、環(huán)境限制，不存在表達(dá)與否等問(wèn)題； （2）數(shù)量極多，遍布整

7、個(gè)基因組，可檢測(cè)座位幾乎無(wú)限； （3）多態(tài)性高，自然界存在許多等位變異，無(wú)須人為創(chuàng)造； （4）表現(xiàn)為中性，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)； （5）許多標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性的特點(diǎn)，能區(qū)別純合體和雜合體。第九張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 一）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記（Restriction fragment length polymorphism, RFLP） 該技術(shù)由Grodzicker等于1974年創(chuàng)立。 由于DNA分子中限制性?xún)?nèi)切酶酶切識(shí)別序列中出現(xiàn)堿基的插入、缺失、置換、倒位而導(dǎo)致酶切位點(diǎn)的增減所引起的基因型限制性片段長(zhǎng)度的差異。 五、常用的分子標(biāo)記第一類(lèi)分子標(biāo)記以分子雜交為核心的分子標(biāo)記技

8、術(shù)第十張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月基因組DNA用已知的限制性?xún)?nèi)切酶消化后，產(chǎn)生許多大小不等的DNA片段，電泳分離、Southern印跡轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，用放射性標(biāo)記的探針與膜上變性的酶切DNA進(jìn)行雜交，放射自顯影，即可顯示出不同材料的多態(tài)性圖譜，即顯示出所分析的DNA序列間的RFLP。 基本原理第十一張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月基本步驟： DNA提取用DNA限制性?xún)?nèi)切酶消化 凝膠電泳分離限制性片段 將這些片段按原來(lái)的順序和位置轉(zhuǎn)移到易操作的濾膜上 用放射性同位素或非放射性物質(zhì)標(biāo)記的DNA作探針與膜上的DNA雜交（稱(chēng) Southern雜交） 放射性自顯影或酶學(xué)檢測(cè)顯示出

9、不同材料對(duì)該探針的限制性酶切片段多態(tài)性。 第十二張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 動(dòng)植物生物體由不同的器官和組織構(gòu)成。應(yīng)選用生物體中生長(zhǎng)旺盛的器官、組織和細(xì)胞提取DNA，如植物幼苗或新長(zhǎng)出的葉片、動(dòng)物的血等。DNA提取的效果由DNA的質(zhì)量和得率來(lái)評(píng)價(jià)。選用適當(dāng)?shù)纳锲鞴俸徒M織是獲得高質(zhì)量和高得率DNA的保證。取樣后應(yīng)盡快在低溫中保存，長(zhǎng)時(shí)間保存應(yīng)在超低溫中保存。 生物體樣品的選取第十三張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 作為DNA提取的開(kāi)始，多細(xì)胞的生物體樣品首先需要經(jīng)過(guò)研磨，使樣品破碎。然后樣品粉末再通過(guò)裂解液把細(xì)胞裂解。裂解液通常是由Tris Tris（hydroxymeth

10、yl）aminomethane，即三羥基甲基氨基甲烷 緩沖液加裂解劑組成，如SDS（Sodium dodecyl sulfate）即十二烷基磺酸鈉、CTAB（Hexadecyltrimethyl ammonium bromide）即十六烷基三甲基溴化銨等。 細(xì)胞的裂解第十四張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 通常使用能使蛋白質(zhì)變性的試劑，如醋酸鉀、醋酸鈉、氯仿等。 通常使用RNA酶。 蛋白質(zhì)的沉淀RNA的消化第十五張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 通常使用冰凍的異丙醇（2-ropanol）、70%乙醇等。 通常使用TE緩沖液（10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0，滅菌

11、）。 EDTA（didodium ethylenediaminetetra-acetate）即乙二胺四乙酸。 DNA沉淀DNA溶解第十六張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 電泳用的凝膠由瓊脂糖（agarose）制備，瓊脂糖的濃度通常為0.9-1.0%。 酶切后的DNA樣品通過(guò)電泳，使DNA片段分離,并按分子量的大小排列。 電泳第十七張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 DNA從凝膠轉(zhuǎn)移到特制的雜交膜上，常用Hybond N+（Amersham） 的尼龍膜。 凝膠的處理： 脫嘌呤處理：0.25M HCl 變性處理：0.4M NaOH DNA轉(zhuǎn)移： 轉(zhuǎn)移液：0.4M NaOH。 洗膜：

12、洗膜液：2xSSC緩沖液 雜交膜的制備第十八張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 用于RFLP分析的探針（probe）是DNA片段，長(zhǎng)度約0.5-2.5kb。探針的來(lái)源有：基因組的隨機(jī)片段、cDNA 等。 探針以克隆的方式保存，以質(zhì)粒（plasmid）為載體，如pUC19等，通過(guò)大腸桿菌繁殖。第十九張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 用作載體的質(zhì)粒必須具備三個(gè)特性： 一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)（Ori）； 一個(gè)顯性的選擇標(biāo)記，如氨芐青霉素（ampicillin）抗性基因（Ampr）； 單一的限制性酶切位點(diǎn)。載體第二十張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第二十一張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于202

13、2年6月 利用放射性同位素（32P-dCTP）等對(duì)探針進(jìn)行標(biāo)記，以跟蹤探針。 同位素標(biāo)記：利用DNA聚合酶（Klenow），在DNA復(fù)制的過(guò)程中，把32P-dCTP合成到DNA片段上。 探針的標(biāo)記(labeling)第二十二張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 雜交液 + 鮭精DNA ( sheared salmon sperm DNA, SSS DNA ) 雜交液:20 X SSPE 250 ml100 X Denhardts 50 ml10% (w/v) SDS 50 mlMake up to 1000 ml 65C保溫，2小時(shí)以上。預(yù)雜交第二十三張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6

14、月A. 2X SSC, 0.1% SDS, 65C, 20 min;B. 1X SSC, 0.1% SDS, 65C, 20 min;C. 0.5X SSC, 0.1% SDS, 65C, 20 min 把已標(biāo)記的探針加入到雜交液中，加入經(jīng)預(yù)雜交的雜交膜。 65C保溫，過(guò)夜。雜交洗膜第二十四張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 用塑料薄膜把已雜交的雜交膜包起來(lái)。放入暗盒中。 放入X光片，緊壓。-80 C冷柜中曝光2-4天。 在暗房中取出X光片，顯影、定影、沖冼。包膜照射顯影第二十五張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 A 無(wú)表型效應(yīng)，RFLP標(biāo)記的檢測(cè)不受環(huán)境條件和發(fā)育階段的影響。B

15、RFLP標(biāo)記在等位基因之間是共顯性的，因此在配制雜交組合時(shí)不受雜交方式的影響。C 在非等位的RFLP標(biāo)記之間不存在上位效應(yīng)，因而互不干擾。D RFLP標(biāo)記起源于基因組DNA的自身變異，在數(shù)量上幾乎不受限制。E DNA需要量大，檢測(cè)技術(shù)繁雜，難以用于大規(guī)模的育種實(shí)踐中。在植物分子標(biāo)記輔助育種中需要將RFLP轉(zhuǎn)換成以PCR為基礎(chǔ)的標(biāo)記。RFLP優(yōu)點(diǎn) 第二十六張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 但RFLP分析需要比較完善的包括多種酶切、標(biāo)記、分子雜交等技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室，加上工作量大、成本高以及放射性的問(wèn)題，使其應(yīng)用受到了一定的限制。第二十七張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月ABAB限制性?xún)?nèi)切

16、酶位點(diǎn)與放射性探針結(jié)合部位限制性?xún)?nèi)切酶酶切后；電泳分離DNA片段；轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜；與放射性探針雜交，分析陽(yáng)性條帶第二十八張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 一）隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（random amplified polymorphism DNA，RAPD） RAPD是1990年由美國(guó)杜邦公司的科學(xué)家Williams和加利福尼亞生物研究所Welsh幾乎同時(shí)發(fā)展起來(lái)的建立在PCR基礎(chǔ)上的一種新型的DNA分子標(biāo)記技術(shù)。第二類(lèi)分子標(biāo)記以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR反應(yīng)）為核心的分子標(biāo)記技術(shù)第二十九張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月基本原理 采用隨機(jī)合成的寡核苷酸（通常10bp）作PCR反應(yīng)的

17、引物，對(duì)所研究生物基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)3040個(gè)循環(huán)，即可得到大量的DNA片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、EB染色、紫外下顯示RAPD帶紋。 第三十張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月由于整個(gè)基因組存在眾多反向重復(fù)序列，因此須對(duì)每一隨機(jī)引物單獨(dú)進(jìn)行PCR。單一引物與反向重復(fù)序列結(jié)合。使重復(fù)序列之間的區(qū)域得以擴(kuò)增。引物結(jié)合位點(diǎn)DNA序列的改變以及兩擴(kuò)增位點(diǎn)之間DNA堿基的缺失、插入或置換均可導(dǎo)致擴(kuò)增片段數(shù)目和長(zhǎng)度的差異，導(dǎo)致PCR產(chǎn)物增加、缺少或發(fā)生分子量變化。若PCR產(chǎn)物增加或缺少，則產(chǎn)生RAPD標(biāo)記。 第三十一張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月技術(shù)路線DNA的提取 PC

18、R反應(yīng) 凝膠電泳 選擇隨機(jī)引物 圖譜分析 第三十二張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月與RFLP的比較相同之處：都從瓊脂糖凝膠上DAN條帶的多態(tài)性來(lái)反映基因結(jié)構(gòu)上的多態(tài)性；不同之處：RFLP用限制性?xún)?nèi)切酶消化DNA，通過(guò)分析限制性酶切片端的多態(tài)性，來(lái)顯示DNA的結(jié)構(gòu)的多態(tài)性；而RAPD是利用PCR技術(shù)從擴(kuò)增的DNA片段上分析多態(tài)性。由于片段被引物選擇地?cái)U(kuò)增，并不是所有序列都擴(kuò)增，擴(kuò)增了的片斷能在凝膠上清晰地顯現(xiàn)出來(lái)，這樣就可以通過(guò)同種引物擴(kuò)增條帶的多態(tài)性，反映出模板的多態(tài)性。第三十三張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月與常規(guī)PCR的比較常規(guī)PCR需要兩個(gè)引物，每個(gè)引物分子1530個(gè)核苷

19、酸，引物順序根據(jù)擴(kuò)增的基因兩端的順序設(shè)計(jì)，因而要進(jìn)行PCR時(shí)，必需知道待擴(kuò)增基因的順序；RAPD分析時(shí)，只需一個(gè)引物，長(zhǎng)度10個(gè)核苷酸左右，引物順序是隨機(jī)的，因而可在對(duì)被檢對(duì)象無(wú)任何分子生物學(xué)資料的情況下對(duì)其基因組進(jìn)行分析。第三十四張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月（1）不需DNA探針，設(shè)計(jì)引物也無(wú)須知道序列信息；（2）顯性遺傳（極少數(shù)共顯性），不能鑒別雜合子和純合子；（3）技術(shù)簡(jiǎn)便，不涉及分子雜交和放射性自顯影等技術(shù)；（4）DNA樣品需要量少，引物價(jià)格便宜，成本較低；（5）實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較差，結(jié)果可靠性較低。 RAPD標(biāo)記的主要特點(diǎn)第三十五張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月RAPD的

20、缺點(diǎn) RAPD圖譜中某些弱帶重復(fù)性較差，而且目前該法在引物長(zhǎng)度和序列及應(yīng)用的引物數(shù)目、擴(kuò)增反應(yīng)條件等實(shí)驗(yàn)技術(shù)方面未標(biāo)準(zhǔn)化，影響了不同條件下結(jié)果的可比性；每個(gè)標(biāo)記含有的信息量??；有假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果；顯性標(biāo)記，無(wú)法區(qū)分從一個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增的DNA片段是純合的還是雜合的，無(wú)法進(jìn)行等位基因分析。用在種以上類(lèi)群間的比較時(shí)無(wú)法得到可靠的遺傳距離。第三十六張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二）擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Amplified restriction fragment polymorphism, AFLP）AFLP是1993年由荷蘭科學(xué)家Zabeau等人將PCR與RFLP結(jié)合起來(lái)，創(chuàng)造了AFLP分析技

21、術(shù)。 AFLP標(biāo)記是選擇性擴(kuò)增基因組DNA酶切片段所產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性，其實(shí)質(zhì)也是顯示限制性?xún)?nèi)切酶酶切片段的長(zhǎng)度多態(tài)性，只不過(guò)這種多態(tài)性是以擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度不同被檢測(cè)出來(lái)。 第三十七張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月基本原理首先用限制性?xún)?nèi)切酶酶解基因組DNA，形成許多大小不等的隨機(jī)限制性片段；接著在這些片段的兩端連接上特定的寡聚核苷酸接頭（Oligo nuleotide adapter）；然后根據(jù)接頭序列設(shè)計(jì)引物，由于限制性片段太多，全部擴(kuò)增則產(chǎn)物難以在膠上分開(kāi)，為此在引物的3端加入1-3個(gè)選擇性堿基，這樣只有那些能與選擇性堿基配對(duì)的片段才能與引物結(jié)合，成為模板被擴(kuò)增，從而達(dá)到對(duì)限制性

22、片段進(jìn)行選擇擴(kuò)增的目的；最后通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳，將這些特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物分離開(kāi)來(lái)。 第三十八張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第三十九張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第四十張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月技術(shù)路線（1）首先要制備高分子量(HMW)基因組DNA，選擇6個(gè)堿基識(shí)別位點(diǎn)的限制性?xún)?nèi)切酶(通常是EcoRI或PstI或SacI)。 （2）酶切后的限制性片段在T4連接酶的作用下與特定的接頭相連接，形成帶有接頭的特異性片段。 （3）DNA片段的預(yù)擴(kuò)增。 （4）在Taq聚合酶的作用下，完成AFLP的選擇性擴(kuò)增。 （5）PCR產(chǎn)物變性后在含尿素的聚丙烯酰胺變性膠上電泳。 （

23、6）多態(tài)性比較分析，特異片段回收克隆分析。第四十一張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月AFLP結(jié)合了RFLP與PCR技術(shù)的特點(diǎn)，兼具RFLP和RAPD兩種方法的特長(zhǎng)，既繼承了RFLP的穩(wěn)定性，又具有了PCR反應(yīng)快速、靈敏的特點(diǎn)，同時(shí)克服了RFLP和RAPD的缺點(diǎn)。采用少數(shù)幾對(duì)引物的多種組合即可獲得大量遺傳信息，避免了RAPD分子標(biāo)記重復(fù)性差、假陽(yáng)性反應(yīng)過(guò)高等不利因素的影響，同時(shí)又無(wú)需任何目的基因組DNA的背景資料即可完成模板DNA多態(tài)性檢測(cè)，擺脫了RFLP的轉(zhuǎn)膜、克隆、探針制備、分子雜交等一系列繁重且又有一定難度的工作 。第四十二張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月用AFLP分析的多態(tài)

24、性是典型的孟德?tīng)柺竭z傳和選擇中性。它可以用于遺傳分析的各個(gè)方面：如用于擬南芥屬連鎖圖的構(gòu)建用于馬鈴薯的栽培種的鑒定等。AFLP也適于鑒定遺傳多樣性的物種親緣關(guān)系的研究 。第四十三張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 （1）由于AFLP分析可以采用的限制性?xún)?nèi)切酶及選擇性堿基種類(lèi)、數(shù)目很多，所以該技術(shù)所產(chǎn)生的標(biāo)記數(shù)目是無(wú)限多的；（2）典型的AFLP分析，每次反應(yīng)產(chǎn)物的譜帶在50-100條之間，所以一次分析可以同時(shí)檢測(cè)到多個(gè)座位，且多態(tài)性極高；（3）表現(xiàn)共顯性，呈典型孟德?tīng)柺竭z傳；（4）分辯率高，結(jié)果可靠；（5）目前該技術(shù)受專(zhuān)利保護(hù)，用于分析的試劑盒昂貴，實(shí)驗(yàn)條件要求較高。 AFLP特點(diǎn)第四十四

25、張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月專(zhuān)利技術(shù)，試劑盒價(jià)格貴需要同位素或非同位素標(biāo)記引物，須具特殊防護(hù)措施、配套儀器設(shè)備基因組的不完全酶切會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所以實(shí)驗(yàn)對(duì)DNA純度和內(nèi)切酶的質(zhì)量要求較高。缺點(diǎn)第四十五張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月應(yīng)用 AFLP具有可靠性好，重復(fù)性強(qiáng)，可信度高等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)廣泛應(yīng)用于遺傳育種研究，在動(dòng)物遺傳育種、動(dòng)物基因組研究中有著廣泛的應(yīng)用前景。構(gòu)建遺傳連鎖圖譜 利用AFLP快速鑒別與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記 AFLP輔助的輪回選擇育種 利用AFLP技術(shù)研究基因表達(dá)與調(diào)控 分類(lèi)和進(jìn)化研究 甲基化研究第四十六張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月在AF

26、LP技術(shù)的基礎(chǔ)上又發(fā)展了一種新的分子標(biāo)記TE2AFLP(三內(nèi)切酶擴(kuò)增的限制片段長(zhǎng)度多態(tài)性, three endonuclease amplified fragment length polymorphism) . 該技術(shù)是由荷蘭科學(xué)家Vander Wurff 等在2000 年末發(fā)表的. TE2AFLP也是首先擴(kuò)增限制性?xún)?nèi)切酶片段,然后在高分辨率凝膠(通常為序列分析膠) 上電泳分離這些擴(kuò)增的片段,再根據(jù)這些片段的長(zhǎng)度來(lái)檢測(cè)DNA多態(tài)性。 與AFLP不同的是要用2 種低頻率切點(diǎn)內(nèi)切酶和1 種高頻率切點(diǎn)內(nèi)切酶混合酶切基因組DNA. TE2AFLP保留和發(fā)展了AFLP的優(yōu)點(diǎn),克服了AFLP 常見(jiàn)的缺點(diǎn)

27、,具有可靠、快速和方便的特點(diǎn). 因此,它將廣泛地被應(yīng)用。第四十七張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三）簡(jiǎn)單序列重復(fù)標(biāo)記（simple sequence repeat，SSR）又稱(chēng)微衛(wèi)星DNA(Micro-satellite DNA)標(biāo)記；屬高度重復(fù)序列，重復(fù)單元26bp，如(CA)n、(AT)、(GGC)n等重復(fù)，重復(fù)區(qū)大多幾十幾百bp，分散在基因組中，大多不存在于編碼序列內(nèi)，具有較高的多態(tài)性。呈現(xiàn)孟德?tīng)柺竭z傳。目前微衛(wèi)星DNA已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了萬(wàn)余個(gè)位點(diǎn)。TTCAGCTAGCTCAGCAGCAGCAGCAGCAGAGCTTGCAAGTCGATCGAGTCGTCGTCGTCGTCGTCTCGAA

28、CG第四十八張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 由Moore等于1991年創(chuàng)立。SSR即微衛(wèi)星DNA，廣泛分布于基因組的不同位置，如（CA）n、（AT）n、（GGC）n等重復(fù)。不同遺傳材料重復(fù)次數(shù)的可變性，導(dǎo)致了SSR長(zhǎng)度的高度變異性，這一變異性正是SSR標(biāo)記產(chǎn)生的基礎(chǔ)。盡管微衛(wèi)星DNA分布于整個(gè)基因組的不同位置，但其兩端序列多是保守的單拷貝序列，因此可以根據(jù)這兩端的序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，通過(guò)PCR技術(shù)將其間的核心微衛(wèi)星DNA序列擴(kuò)增出來(lái)，利用電泳分析技術(shù)就可獲得其長(zhǎng)度多態(tài)性，即SSR標(biāo)記。 原理第四十九張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 微衛(wèi)星DNA一般位于內(nèi)含子中，因此它在進(jìn)化

29、過(guò)程中受到選擇壓力較小，與其他分子標(biāo)記相比，微衛(wèi)星在多態(tài)性，群體平均雜合度，以及群體間遺傳距離等方面，微衛(wèi)星位點(diǎn)值均高于蛋白質(zhì)位點(diǎn)，用微衛(wèi)星作為遺傳標(biāo)記更適合于這些方面的分析，同樣也更適于檢測(cè)個(gè)體間的差異，微衛(wèi)星DNA為共顯性遺傳，利用PCR及電泳檢測(cè)相對(duì)容易，也更便于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，可通過(guò)計(jì)算雜合度，較好的進(jìn)行個(gè)體鑒定。第五十張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 建立DNA文庫(kù)，篩選鑒定微衛(wèi)星DNA克隆，然后測(cè)定這些克隆的側(cè)翼序列，設(shè)計(jì)特異性引物來(lái)擴(kuò)增SSR序列。后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳、染色，通過(guò)比較譜帶的相對(duì)遷移距離，便可知不同個(gè)體在某個(gè)SSR座位上的多態(tài)性。 技術(shù)路線第五十一張，PPT共

30、九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 （1）數(shù)量幾乎無(wú)限，檢測(cè)出多態(tài)性的頻率極高； （2）SSR技術(shù)一般檢測(cè)到的是一個(gè)單一的多等位基因位點(diǎn)； （3）SSR標(biāo)記為共顯性標(biāo)記，可鑒別出雜合子和純合子； （ 4）結(jié)果重復(fù)性高，穩(wěn)定可靠。為了提高分辨力，通常使用可檢測(cè)出單拷貝差異的聚丙烯酰胺凝膠電泳； （5）兼具PCR反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)，即所需DNA樣品量少，對(duì)DNA質(zhì)量要求亦不苛刻。優(yōu)點(diǎn) 必須事先知道微衛(wèi)星兩翼序列信息才能設(shè)計(jì)引物，對(duì)于許多物種需要構(gòu)建文庫(kù)。 這將給微衛(wèi)星標(biāo)記的開(kāi)發(fā)帶來(lái)一定的困難。缺點(diǎn)第五十二張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月應(yīng)用SSR標(biāo)記在數(shù)據(jù)上比前述分子標(biāo)記能顯示出更多的多態(tài)性，已在遺傳疾

31、病的診斷、構(gòu)建遺傳圖譜、種質(zhì)資源鑒定、基因定位及分子標(biāo)記輔助育種、植物生態(tài)學(xué)和系統(tǒng)與進(jìn)化研究等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用 。微衛(wèi)星DNA PCR擴(kuò)增結(jié)果（示例）500bp400bp300bp240bp 該結(jié)果顯示在所檢查的人群中，該位點(diǎn)多態(tài)性有四種。第五十三張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月四）微衛(wèi)星間隔（Inter simple sequence repeat，ISSR） Zietkiewicz et al.(1994) 對(duì)SSR技術(shù)進(jìn)行了發(fā)展，他們用加錨微衛(wèi)星寡核苷酸作引物，對(duì)基因組節(jié)段而不是重復(fù)序列本身進(jìn)行擴(kuò)增。在SSR的5端或3端加上24個(gè)隨機(jī)選擇的核苷酸，這可引起特點(diǎn)位點(diǎn)退火。這樣就

32、能導(dǎo)致位于反向排列的間隔不太大的重復(fù)序列間的基因組節(jié)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。這類(lèi)標(biāo)記又被稱(chēng)為ISSR (inter-simple sequence repeat)。 第五十四張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月基本原理用錨定的微衛(wèi)星DNA為引物，即在SSR序列的3端或5端加上2-4個(gè)隨機(jī)核昔酸，在PCR反應(yīng)中，錨定引物可引起特定位點(diǎn)退火，導(dǎo)致與錨定引物互補(bǔ)的間隔不太大的重復(fù)序列間DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所擴(kuò)增的inter SSR區(qū)域的多個(gè)條帶通過(guò)聚丙烯酞胺凝膠電泳得以分辨，擴(kuò)增譜帶多為顯性表現(xiàn)。第五十五張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月ISSR引物的開(kāi)發(fā)不像SSR引物那樣需測(cè)序獲得SSR

33、兩側(cè)的單拷貝序列，開(kāi)發(fā)費(fèi)用降低。與SSR標(biāo)記相比，ISSR引物可以在不同的物種間通用，不像SSR標(biāo)記一樣具有較強(qiáng)的種特異性;與RAPD和RFLP相比，ISSR揭示的多態(tài)性較高，可獲得幾倍于RAPD的信息量，精確度幾乎可與RFLP相媲美，檢測(cè)非常方便，因而是一種非常有發(fā)展前途的分子標(biāo)記。 第五十六張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月目前，ISSR標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于植物品種鑒定、遺傳作圖、基因定位、遺傳多樣性、進(jìn)化及分子生態(tài)學(xué)研究中。但是由于不知道目的基因組DNA的背景資料，有一些ISSR引物可能在特定基因組DNA中沒(méi)有配對(duì)區(qū)域而無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物。而且ISSR也是一種顯性標(biāo)記，模板濃度需要較一致，最適

34、反應(yīng)條件需要一定時(shí)間摸索。 第五十七張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月ISSR與RAPD技術(shù)很相似，引物和鎂離子濃度以及退火溫度明顯地影響擴(kuò)增帶的式樣，Taq聚合酶的活性也會(huì)影響PCR擴(kuò)增結(jié)果。一般來(lái)講所研究的基因組DNA越復(fù)雜，重復(fù)序列的密度越高，對(duì)引物的專(zhuān)一性要求就越高，運(yùn)行PCR的條件也越嚴(yán)格。ISSR引物對(duì)Mg2+ 濃度的敏感度大于RAPD，由于引物與模板的雙鏈雜交體的解鏈與退火溫度受二價(jià)陽(yáng)離子的影響；游離的Mg2+ 用來(lái)增強(qiáng)DNA聚合酶的活性，它也可與dNTP中磷酸基結(jié)合，而Mg2+ 和dNTP在PCR擴(kuò)增過(guò)程中相互作用，只有Mg2+ 和dNTP的濃度在合適范圍內(nèi)，才能得到好的

35、PCR擴(kuò)增結(jié)果。 第五十八張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，退火溫度的影響最大。一般在運(yùn)行ISSRPCR時(shí)，采用4852退火溫度都能得到好的擴(kuò)增帶。Virk et al的研究中退火溫度控制在3959之間也能擴(kuò)增出好的帶譜。但不同的引物在不同的物種中所需的退火溫度是不同的，對(duì)ISSR引物來(lái)說(shuō)，可適當(dāng)提高其退火溫度得到穩(wěn)定清晰的帶譜。第五十九張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 a.引物 PCR結(jié)果的特異性取決于引物的特異性，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小也是由特異引物限定的。因此，PCR所用引物質(zhì)量要高，且需純化。PCR反應(yīng)中引物的量也影響PCR擴(kuò)增效果，當(dāng)PCR引物量太低，則產(chǎn)物

36、量降低，會(huì)出現(xiàn)假陰性。引物濃度過(guò)高會(huì)促進(jìn)引物的錯(cuò)誤引導(dǎo)非特異產(chǎn)物合成，還會(huì)增加引物二聚體的形成。 PCR反應(yīng)條件PCR反應(yīng)五要素： 參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+第六十張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 b. 酶 該酶的最適溫度很高（79），使引物在高溫下進(jìn)行退火和延伸，這樣便增加了反應(yīng)的總強(qiáng)度并減少了與錯(cuò)配引物的延伸。在PCR反應(yīng)中，每100l反應(yīng)液中含1-2.5u Taq DNA聚合酶為佳，酶的濃度太低會(huì)使擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量降低，如果酶的濃度太高則會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。Taq DNA聚合酶保存不當(dāng)而失活是PCR實(shí)驗(yàn)失敗的常見(jiàn)原因。 第六十一張，PPT共九十

37、頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 c. d NTP 四種脫氧核苷三磷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）是DNA合成的基本原料，PCR反應(yīng)中dNTP含量太低，PCR擴(kuò)增產(chǎn)量太少、易出現(xiàn)假陰性。過(guò)高的dNTP濃度會(huì)導(dǎo)致聚合將其錯(cuò)誤摻入，因此應(yīng)當(dāng)避免。 第六十二張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 d. 模板 PCR可以以DNA或RNA為模板進(jìn)行核酸的體外擴(kuò)增。不過(guò)RNA的擴(kuò)增首先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后才能進(jìn)行PCR循環(huán)。不同來(lái)源的核酸標(biāo)本必須經(jīng)處理后才能用于PCR的擴(kuò)增，處理不當(dāng)或處理過(guò)程中DNA掉失都會(huì)導(dǎo)致PCR擴(kuò)增失敗。采集標(biāo)本方法不當(dāng)，未能獲得所要檢測(cè)的靶DNA都會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性。但是如果

38、待擴(kuò)增標(biāo)本中模板DNA濃度太高也會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。 第六十三張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 e. Mg2+ Mg2+濃度直接影響著酶的活性與忠實(shí)性，這是Taq DNA聚合酶活性所必需的。另外它還影響著引物的退火，模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度，產(chǎn)物的特異性，引物二聚體的形成等。Mg2+濃度過(guò)低時(shí)，酶活力顯著降低；過(guò)高時(shí)，通常會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的累積。 第六十四張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 1. 分子遺傳圖譜的構(gòu)建 目前幾乎所有重要農(nóng)作物，如擬南芥、番茄、玉米、水稻、甜菜、小麥、大豆、馬鈴薯、棉花、油菜等的RFLP圖譜均已構(gòu)成，隨著多種標(biāo)記的不斷添加與定位，分子遺傳圖譜正日漸

39、趨于飽和。 遺傳圖譜對(duì)于基因定位至關(guān)重要，圖譜上包括的標(biāo)記數(shù)越多，分布越均勻，則基因定位就越精細(xì)。高密度分子遺傳圖譜的繪制使一些植物的遺傳學(xué)研究取得了重大進(jìn)展，并對(duì)分子標(biāo)記輔助育種選擇技術(shù)和基因圖位克隆技術(shù)的發(fā)展產(chǎn)生了巨大的推動(dòng)作用。 第一、二類(lèi)分子標(biāo)記的應(yīng)用第六十五張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 2. 遺傳多樣性與種質(zhì)鑒定 分子標(biāo)記廣泛存在于基因組DNA的各個(gè)區(qū)域，數(shù)量巨大，通過(guò)對(duì)隨機(jī)分布于整個(gè)基因組的分子標(biāo)記的多態(tài)性進(jìn)行比較，就能夠全面評(píng)估研究對(duì)象的多樣性，并揭示其遺傳本質(zhì)。利用遺傳多樣性的結(jié)果可以對(duì)種質(zhì)進(jìn)行聚類(lèi)分析，進(jìn)而了解其系統(tǒng)發(fā)育與親緣關(guān)系。而以分子標(biāo)記為基礎(chǔ)的比較基因組研

40、究則有利于探明近緣物種間的遺傳同源性以及物種起源等生命科學(xué)領(lǐng)域中的重要問(wèn)題。 第六十六張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月微衛(wèi)星標(biāo)記等具有很高的多態(tài)性，可以用于鑒別同一物種的不同基因型，如Olufowote等選擇4個(gè)SSR標(biāo)記即可有效地評(píng)估栽培稻內(nèi)不同品種間的異質(zhì)性；Guifford等用3個(gè)SSR標(biāo)記就能區(qū)分21個(gè)蘋(píng)果品種。分子標(biāo)記的這一特點(diǎn)還可用于鑒別品種的混雜情況和真假雜種的判斷等。 第六十七張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 3.重要農(nóng)藝性狀相關(guān)基因的定位 基因定位就是確定基因在染色體上的位置及與之相連鎖的分子標(biāo)記，高密度分子遺傳圖譜的構(gòu)建使基因定位工作變得相對(duì)容易。 目前已完

41、成了重要作物大量控制農(nóng)藝性狀表現(xiàn)如抗病性、抗蟲(chóng)性、育性等的主基因的定位工作，為開(kāi)展這些基因的分子育種奠定了基礎(chǔ)。 第六十八張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月尤為重要的是分子標(biāo)記技術(shù)為呈數(shù)量遺傳、易受環(huán)境條件影響的重要農(nóng)藝性狀的QTL定位提供了有效手段，目前涉及到QTL圖譜繪制及大量復(fù)雜的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、分析、運(yùn)算工作已有多個(gè)配套的計(jì)算機(jī)軟件被開(kāi)發(fā)出來(lái)。QTL的定位使得控制數(shù)量性狀的多基因被轉(zhuǎn)變成一個(gè)個(gè)獨(dú)立的“主基因”，便于進(jìn)行遺傳操作，這無(wú)疑有利于對(duì)產(chǎn)量、生育期等性狀的定向改良。 第六十九張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 4.分子標(biāo)記輔助選擇 選擇是育種的重要環(huán)節(jié)，傳統(tǒng)育種對(duì)目標(biāo)性狀多

42、采用直接選擇的方法，但作物的許多農(nóng)藝性狀不容易觀測(cè)或易受環(huán)境影響、表現(xiàn)不穩(wěn)定，直接選擇比較困難。而在完成基因的分子標(biāo)記定位后，就可以通過(guò)連鎖標(biāo)記對(duì)這些性狀進(jìn)行間接選擇，從而提高它們的選擇效率。 第七十張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月與傳統(tǒng)選擇相比，分子標(biāo)記輔助選擇有許多顯著的優(yōu)點(diǎn)，主要體現(xiàn)在：（1）可以清除同一座位不同等位基因間或不同座位間互作的干擾，消除環(huán)境的影響；（2）在幼苗階段就可以對(duì)在成熟期表達(dá)的性狀進(jìn)行鑒定，如果實(shí)性狀、雄性不育等；（3）可有效地對(duì)表型鑒定十分困難的性狀進(jìn)行鑒定，如抗病性、根部性狀等；（4）共顯性標(biāo)記可區(qū)分純合體和雜合體，不需下代再鑒定；（5）可同時(shí)對(duì)多個(gè)性狀

43、進(jìn)行選擇，開(kāi)展聚合育種，快速完成對(duì)多個(gè)目標(biāo)性狀的同時(shí)改良；（6）加速回交育種進(jìn)程，克服不良性狀連鎖，有利于導(dǎo)入遠(yuǎn)緣優(yōu)良基因。 第七十一張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月將分子標(biāo)記輔助選擇應(yīng)用于作物改良的實(shí)踐中，已取得一些實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。如國(guó)際水稻所利用與Xa-4，xa-5，xa-13和Xa-21四個(gè)抗白葉枯病基因連鎖的STS標(biāo)記輔助選擇，成功地將這四個(gè)基因以不同組合方式聚合在一起，育成了高抗、多抗白葉枯病水稻新品種。 第七十二張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 5.重要農(nóng)藝性狀的圖位克隆 圖位克?。∕ap-based cloning）是近幾年隨著植物分子標(biāo)記遺傳圖譜的相繼建立和基因分子

44、定位而發(fā)展起來(lái)的一種新的基因克隆技術(shù)。利用分子標(biāo)記輔助的圖位克隆無(wú)須事先知道基因的DNA序列，也不用了解基因的表達(dá)產(chǎn)物是什么就可以直接克隆基因。 第七十三張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一）單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism， SNP)1. 定義單核苷酸多態(tài)性(SNP)主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。 不同個(gè)體間，基因組DNA某部位的單核苷酸的變異。 1996年，Lander報(bào)道了用單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（single nucleotid polymorphism SNP）。是第三代遺傳標(biāo)記。第三類(lèi)分子標(biāo)記技術(shù)以D

45、NA序列分析為核心第七十四張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 SNP在人類(lèi)基因組中廣泛存在，平均每5001000個(gè)堿基對(duì)中就有1個(gè)，估計(jì)其總數(shù)可達(dá)1700萬(wàn)個(gè)甚至更多。 在基因組DNA中，任何堿基均有可能發(fā)生變異，因此SNP既有可能在基因序列內(nèi)，也有可能在基因以外的非編碼序列上?？偟膩?lái)說(shuō)，位于編碼區(qū)內(nèi)的SNP(coding sNP,cSNP)比較少，因?yàn)樵谕怙@子內(nèi)，其變異率僅及周?chē)蛄械?/5。但它在遺傳性疾病研究中卻具有重要意義，因此cSNP的研究更受關(guān)注。第七十五張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 SNP與RFLP和STR標(biāo)記的主要不同之處在于，它不再以DNA片段的長(zhǎng)度變化作為

46、檢測(cè)手段，而直接以序列變異作為標(biāo)記。第七十六張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月第七十七張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月SNP的優(yōu)點(diǎn)(1) SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因頻率都可估計(jì)出來(lái)。(2)它在基因組中的分布較微衛(wèi)星標(biāo)記廣泛得多。(3)與串聯(lián)重復(fù)的微衛(wèi)星位點(diǎn)相比，SNP是高度穩(wěn)定的，尤其是處于編碼區(qū)的SNP(cSNP),而前者的高突變率容易引起對(duì)人群的遺傳分析出現(xiàn)困難。(4)部分位于基因內(nèi)部的SNP可能會(huì)直接影響產(chǎn)物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或基因表達(dá)水平，因此，它們本身可能就是疾病遺傳機(jī)制的候選改變位點(diǎn)。(5)易于進(jìn)行自動(dòng)化分析，縮短了研究時(shí)間。第七十八張，PPT共

47、九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 日本研究人員最近經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，與糖尿病有關(guān)的基因并不是千篇一律，它們之間存在著個(gè)人差別，即“單核苷酸多態(tài)性”（SNP）。 第七十九張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 EST是cDNA的部分序列，平均長(zhǎng)度為300500bp，由大規(guī)模cDNA克隆一次測(cè)序得到，因此稱(chēng)作表達(dá)序列標(biāo)簽。通常是從已有的cDNA文庫(kù)中隨機(jī)取出幾百到幾千個(gè)克隆一次測(cè)序產(chǎn)生。一般使用載體多克隆位點(diǎn)互補(bǔ)序列作為通用引物。一個(gè)EST代表生物體某種組織某一時(shí)期的一個(gè)表達(dá)基因。 EST目前主要被用于尋找新基因和了解基因表達(dá)概況。 二）表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tag， ES

48、T ）第八十張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 一般步驟如下： 建立組織或細(xì)胞的cDNA文庫(kù)從文庫(kù)中隨機(jī)取出足夠量的cDNA克隆進(jìn)行自動(dòng)測(cè)序生物信息學(xué)分析（即將所得的EST數(shù)據(jù)與dbEST等數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)比較，確定哪些代表已知基因、哪些代表未知基因） 進(jìn)一步分析未知基因或歸類(lèi)分析全部EST以獲得組織或細(xì)胞的基因表達(dá)概況。 第八十一張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 SRAP是一種新型的基于PCR的標(biāo)記系統(tǒng)，由美國(guó)加州大學(xué)蔬菜作物系Li與Quiros博士于2001年提出，又叫基于序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence-based amplified polymorphism，SBAP）。 三）相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism, SRAP)第八十二張，PPT共九十頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 引物設(shè)計(jì)是SRAP分析的核心。SRAP標(biāo)記分析共有兩套引物。在一組正向SRAP引物中使用“CCGG”序列，其目的是使之特異結(jié)合可譯框（ORFs）區(qū)域中的外顯子。運(yùn)用CCGG序列就可特異擴(kuò)增出包含這些組分的序列。 由于外顯子序列在不同個(gè)體中通常是保守的，這種低水平多態(tài)性限制了將它們做為標(biāo)記的來(lái)源。由于內(nèi)含子、啟動(dòng)子和間隔序列在不同物種甚至不同個(gè)體間變異很大，富含AT的區(qū)域序列通常見(jiàn)于啟動(dòng)子和內(nèi)