齊魯醫(yī)學(xué)胃癌細胞表面-唾液酸糖鏈的表達與其侵襲

1、精品醫(yī)學(xué)文檔 精品醫(yī)學(xué)文檔 精品醫(yī)學(xué)文檔 胃癌細胞表面,唾液酸糖鏈的表達與其與侵染、轉(zhuǎn)移相關(guān)性的研究 PAGE 2 摘 要本設(shè)計為了研究唾液酸在胃癌發(fā)病過程中的相關(guān)作用，探討,唾液酸糖鏈結(jié)構(gòu)在胃癌發(fā)生中所造成的影響。設(shè)計內(nèi)容主要分為兩部分：,唾液酸糖鏈結(jié)構(gòu)在不同分化程度的胃癌細胞表面的表達對胃癌細胞侵染能力相關(guān)性的研究；,唾液酸糖鏈結(jié)構(gòu)對胃癌細胞的轉(zhuǎn)移能力相關(guān)性的研究；第一部分分為兩個實驗設(shè)計用MAL細胞化學(xué)染色法選出陽性細胞計算出MAL胃癌細胞的陽性率和體外細胞粘附試驗測得吸光度測試唾液酸跟細胞粘度的關(guān)系；第二部分通過重組基底膜實驗來計數(shù)胃癌細胞的穿膜細胞數(shù)，確定,唾液酸對胃癌細胞的侵染、轉(zhuǎn)

2、移的影響。為胃癌疾病的研究和治療提供一定的理論及實驗基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：,唾液酸；表達；胃癌細胞；侵染；轉(zhuǎn)移目 錄第一部分： 文獻綜述TOC o 1-3 h u HYPERLINK l _Toc21174 1 唾液酸 PAGEREF _Toc21174 1 HYPERLINK l _Toc29309 1.1簡介 PAGEREF _Toc29309 1 HYPERLINK l _Toc29242 1.2唾液酸的生物學(xué)功能 PAGEREF _Toc29242 1 HYPERLINK l _Toc5628 2 胃癌 PAGEREF _Toc5628 2 HYPERLINK l _Toc16697 2.1胃

3、癌發(fā)生的過程 PAGEREF _Toc16697 2 HYPERLINK l _Toc15781 2.2胃癌的侵染、轉(zhuǎn)移 PAGEREF _Toc15781 2 HYPERLINK l _Toc18668 3 唾液酸與腫瘤作用 PAGEREF _Toc18668 3 HYPERLINK l _Toc29864 3.1唾液酸與惡性腫瘤 PAGEREF _Toc29864 3 HYPERLINK l _Toc23341 3.2唾液酸與胃癌 PAGEREF _Toc23341 4 HYPERLINK l _Toc13087 4凝集素 PAGEREF _Toc13087 5 HYPERLINK l _

4、Toc28344 4.1簡介 PAGEREF _Toc28344 5 HYPERLINK l _Toc32723 4.2 MAL簡介 PAGEREF _Toc32723 5 HYPERLINK l _Toc5694 4.3 MAL對胃癌細胞表面糖鏈的標記 PAGEREF _Toc5694 6第二部分 課程設(shè)計部分 HYPERLINK l _Toc30072 1材料 PAGEREF _Toc30072 7 HYPERLINK l _Toc12615 1.1細胞株及細胞培養(yǎng) PAGEREF _Toc12615 8 HYPERLINK l _Toc28306 1.2試劑 PAGEREF _Toc28

5、306 8 HYPERLINK l _Toc11514 1.3試劑配制 PAGEREF _Toc11514 9 HYPERLINK l _Toc30101 1.4儀器設(shè)備 PAGEREF _Toc30101 9 HYPERLINK l _Toc7231 2方法 PAGEREF _Toc7231 10 HYPERLINK l _Toc17156 2.1 MAL細胞化學(xué)染色 PAGEREF _Toc17156 10 HYPERLINK l _Toc27096 2.2 體外細胞粘附試驗 PAGEREF _Toc27096 11 HYPERLINK l _Toc8609 2.3 重組基底膜侵襲實驗 P

6、AGEREF _Toc8609 11 HYPERLINK l _Toc15463 3 設(shè)計 PAGEREF _Toc15463 12 HYPERLINK l _Toc4323 3.1 胃癌細胞表面,唾液酸糖鏈結(jié)構(gòu)與其轉(zhuǎn)移能力的相關(guān)性 PAGEREF _Toc4323 12 HYPERLINK l _Toc9081 3.2 胃癌細胞表面,唾液酸糖鏈結(jié)構(gòu)與其侵染能力的相關(guān)性 PAGEREF _Toc9081 12 HYPERLINK l _Toc74 4 總結(jié) PAGEREF _Toc74 12 HYPERLINK l _Toc7692 5 設(shè)計體會 PAGEREF _Toc7692 13 HYP

7、ERLINK l _Toc4696 參考文獻 PAGEREF _Toc4696 15PAGE 15第一部分 文獻綜述1 唾液酸1.1簡介 唾液酸是一種神經(jīng)氨酸乙酰衍生物，廣泛分布于體內(nèi)各組織中，被認為是重要的腫瘤標志物，并在檢測療效、復(fù)發(fā)和預(yù)后判斷等方面都有一定的價值。唾液酸是一類含個碳原子的羧基化單糖?；苌锏目偡Q，在人體的唾液酸主要為N-乙酰神經(jīng)氨酸和N-羥乙酰神經(jīng)氨酸兩種，大多由葡萄糖代謝生成。唾液酸廣泛分布于真核細胞表面糖蛋白或糖脂的寡糖鏈的最末端，是細胞膜上糖蛋白、糖脂的重要成分1。體內(nèi)大多是葡萄糖代謝生成，在血清中以糖結(jié)合和脂結(jié)合兩種形式存在。根據(jù)唾液酸與糖殘基的連接方式可將其分

8、為, 2,3-、 2,6-或 2,8-三大類。1.2唾液酸的生物學(xué)功能唾液酸具有的末端定位性及帶負電荷兩大特性，使他們對調(diào)節(jié)細胞間、細胞與間質(zhì)、細胞與分子的相互作用有特殊意義，在機體生理、病理過程中發(fā)揮重要的作用。唾液酸化修飾屏蔽了與之相連的糖蛋白及糖脂結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定細胞膜結(jié)構(gòu)，提高了熱穩(wěn)定性，并保護細胞和大分子不受酶及免疫系統(tǒng)的攻擊，從而起保護細胞的作用。很多惡性腫瘤細胞和一些病原體則利用唾液酸修飾，逃避機體免疫監(jiān)視和攻擊。唾液酸作為識別為點，參與細胞識別及信息傳遞。唾液酸可被選凝素、唾液酸結(jié)合性免疫球蛋白樣凝集素家族等粘附分子識別。也是一些信號分子、病原體如流感病毒的作用位點。表面唾液酸話使得

9、細胞外表面帶負電荷，有利于與帶正電荷的物質(zhì)結(jié)合，從而參與細胞水鹽代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運等生理過程。帶負電荷的唾液酸具有親水性，在周圍形成很大的水合半徑，造成細胞間距離的增加，并通過電荷排斥阻止分子間相互作用，所以說唾液酸對分子間甚至細胞間的相互作用都有潛在的抑制作用2 。這種特性可阻止血紅細胞的凝聚、粘附，有利于細胞的遷移，對于人體的生理活動、生長發(fā)育有重要意義。唾液酸化修飾是生命活動所必需的，有實驗證實抑制唾液酸的生物合成對幼鼠是致命的3。唾液酸在腦中的含量很高，它能夠促進神經(jīng)細胞的分化、發(fā)育和再生，參與突出的傳遞，參與記憶和學(xué)習(xí)功能，機體發(fā)育階段各種組織唾液酸表達水平較高。而在成年人的組織中則為低

10、表達，如成年人組織中出現(xiàn)唾液酸化水平升高，則提示發(fā)生病變的可能。2 胃癌2.1胃癌發(fā)生的過程胃癌是最常見的惡性腫瘤，我國的病人主要以進展性胃癌為主，確診時絕大多數(shù)已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，這是造成治療失敗的主要原因之一。因此，研究胃癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移機制，早期發(fā)現(xiàn)和預(yù)測癌的轉(zhuǎn)移、觀察治療效果和評價預(yù)后是胃癌研究的重要內(nèi)容。與大多數(shù)腫瘤相類似的是，胃癌的侵襲與轉(zhuǎn)移機制也極其復(fù)雜，參入的因素非常多，包括與細胞質(zhì)/核有關(guān)的因素，細胞膜及表面結(jié)構(gòu)的改變等，是一個多步級聯(lián)過程。其中主要包括以下步驟：癌細胞從原發(fā)灶脫落；與細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)、基底膜(Basement memb

11、rance，BM)發(fā)生粘附并降解；穿越血管壁進入循環(huán)并到達遠處部位；腫瘤血管形成；在繼發(fā)部位不斷增殖形成轉(zhuǎn)移灶。在這些多步驟的動態(tài)、連續(xù)的侵襲轉(zhuǎn)移過程中，癌細胞由原發(fā)灶脫落，是腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的始動因素4。2.2胃癌的侵染、轉(zhuǎn)移腫瘤細胞游走性增加，即腫瘤細胞之間及與周圍組織粘附作用的減低是腫瘤細胞由原發(fā)灶脫落的主要原因。而粘附作用的減低又主要與腫瘤細胞表面糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)的改變有密切關(guān)系5。細胞膜糖蛋白是蛋白質(zhì)和寡糖鏈(糖鏈)的共價復(fù)合物，其糖鏈在維持細胞分化、功能和形態(tài)方面起著非常重要的作用。一旦細胞膜表面糖鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生異常變化，就預(yù)示著其基本的生物學(xué)行為發(fā)生了改變6-9，尤其在細胞的粘附、運動

12、、分子識別及細胞識別等基本功能方面的改變，與腫瘤細胞的惡性增殖和轉(zhuǎn)移有直接關(guān)系陋10。因此，研究細胞膜表面糖蛋白及糖鏈結(jié)構(gòu)變化對于揭示腫瘤細胞的侵襲與轉(zhuǎn)移是非常重要的。胃癌致死率高的兩個重要因素是胃癌患者確診時多數(shù)處于中晚期以及缺乏有效的治療手段。胃癌患者治療失敗和致死的主要原因就是腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。胃癌發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移是一個多基因、多階段、連續(xù)復(fù)雜的過程，這一過程包括腫瘤細胞從原發(fā)灶脫離，穿越基膜及細胞外基質(zhì)浸潤遷移并進入血管，黏附于血管內(nèi)皮，進入循環(huán)系統(tǒng)并隨血流到達遠處，穿出血管侵入細胞外基質(zhì)并形成轉(zhuǎn)移灶。癌細胞脫離原發(fā)灶后，穿越組織屏障是轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。細胞外基質(zhì)和基膜(BM)是腫瘤生長和

13、擴散的自然屏障，細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)主要成份由膠原、糖蛋白、蛋白多糖和氨基葡聚糖組成。ECM在上皮或內(nèi)皮細胞的基底部，即以基底膜2usememmembranes，BM)的形式存在，在細胞間結(jié)構(gòu)以間質(zhì)結(jié)締組織形式存在11。腫瘤細胞的侵襲是需要與細胞增殖、分化、移動的相關(guān)基因及其表達調(diào)控模式的改變和促進細胞移動的外界因素兩者的共同作用。雖然腫瘤細胞侵襲的分子機制還不是十分清楚，但已發(fā)現(xiàn)許多調(diào)控細胞侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子及其信號通路。腫瘤細胞通過其表面受體與ECM中的各種成分粘附后激活或分泌蛋白降解酶類來降解基質(zhì)，從而形成局部溶解區(qū)，構(gòu)成了腫瘤細胞轉(zhuǎn)移運行通道。一

14、般惡性程度高的腫瘤細胞具有較強的蛋白水解作用，可侵蝕破壞包膜，促進轉(zhuǎn)移。目前研究認為，MMPs不但介導(dǎo)腫瘤細胞對宿主細胞外基質(zhì)的降解，還控制腫瘤新生血管的生成，影響細胞黏附分子的功能及調(diào)控腫瘤細胞的生長等。而腫瘤血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移所必須的，被認為是很重要的預(yù)后因素11。3 唾液酸與腫瘤作用3.1唾液酸與惡性腫瘤有關(guān)惡性腫瘤與唾液酸關(guān)系的研究是從發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤血清唾液酸升高開始的。早在1955年，Winzle等首次報道，惡性腫瘤患者血清唾液酸升高。上世紀七十年代，國外學(xué)者們通過動物實驗及人體腫瘤研究，證實一些惡性腫瘤個體血清唾液酸水平異常升高。到上世紀九十年代，唾液酸開始作為血清腫瘤標志物用

15、于臨床。盡管血清唾液酸水平升高的機制尚未完全明確，但目前的研究普遍認為這是由癌變細胞過表達的唾液酸大量脫落入血所致。在一些非腫瘤性病變中，血清唾液酸也可能會升高，如：感染、炎癥等，但一般而言，其升高幅度遠較惡性腫瘤的為小，而且作有效抗感染治療后可下降至正常。眾多的研究提示惡性腫瘤患者血清唾液酸升高程度較非腫瘤性病變的大，所以盡管血清唾液酸對惡性腫瘤的診斷并非特異性，但具有較高的敏感性，聯(lián)合檢測血清唾液酸及其他腫瘤標記物對惡性腫瘤的篩查、早期診斷有很大的臨床意義。有文獻報道,血清唾液酸水平與腫瘤惡性程度、腫瘤臨床分期相關(guān),分化越低、分期越晚血清SA水平越高;作有效治療后血清唾液酸可下降，腫瘤復(fù)發(fā)

16、、轉(zhuǎn)移后又上升，提示血清唾液酸不但可作為惡性腫瘤輔助診斷的指標，還可作為病情發(fā)展、腫瘤消長的監(jiān)測指標。然而，血清唾液酸檢測并不是直接檢測細胞表面的唾液酸表達情況，不能深入了解腫瘤細胞唾液酸表達的具體情況12。3.2唾液酸與胃癌細胞癌變過程中常伴有細胞膜表面糖蛋白N-糖鏈結(jié)構(gòu)的異常改變，其中腫瘤細胞表面唾液酸化水平增加與腫瘤的惡性進展及早期轉(zhuǎn)移有密切聯(lián)系。有關(guān)唾液酸在人胃癌細胞表面表達的特異性及其臨床意義的研究，國內(nèi)外相關(guān)報道較少。唾液酸在胃癌細胞表面的表達與胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移潛能之間的相關(guān)性，尚有待進一步研究與探討。利用能夠特異性識別、結(jié)合NeuAc 2,3Gal1,4GlcNAc/Glc唾液酸結(jié)

17、構(gòu)的朝鮮槐凝集素，檢測2,3唾液酸在胃癌組織及其轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)以及大腸癌組織中的表達?；瘜W(xué)上，當(dāng)糖鏈結(jié)構(gòu)的末端連接上唾液酸便意味著糖鏈延伸的終止。因此，唾液酸一般是糖鏈末端結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，SA是血清糖蛋白與糖脂生物效應(yīng)的重要成分，在細胞的惡性轉(zhuǎn)化中起特殊作用。而血清中存在一種新蛋白脂質(zhì)，是含唾液酸的糖脂，是神經(jīng)節(jié)甘脂的衍生物，而正常人缺少這種糖脂或含量甚微。這類糖脂結(jié)合唾液酸的異常升高與惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和細胞表面糖復(fù)合物的異常表達特別是糖復(fù)合物末端的唾液酸化改變密切相關(guān)。由于它位于糖鏈末端并攜帶負電荷，唾液酸對分子之間甚至細胞間的相互作用都有潛在作用。一方面唾液酸可通過增加

18、腫瘤表面負電荷和掩蓋其表面抗原，從而有利于腫瘤細胞在血液循環(huán)中逃避宿主免疫細胞的殺傷；此外，唾液酸的聚積，能夠直接影響糖鏈分子的連接，增加細胞之間排斥性，可使得腫瘤細胞之間及與周圍組織的粘附性降低，細胞容易由原發(fā)灶脫落而發(fā)生轉(zhuǎn)移。胃癌細胞表面異常唾液酸化的發(fā)生可能是由于,唾液酸轉(zhuǎn)移酶表達水平增加或活性增強，導(dǎo)致這種帶負電荷的,唾液酸糖鏈結(jié)構(gòu)在腫瘤表面增加，從而使得腫瘤細胞之間的粘附力減弱，轉(zhuǎn)移能力增強。因此研究其細胞表面糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)特點，將有助于從新的角度探討胃癌發(fā)病機制，為臨床診斷及預(yù)測預(yù)后提供實驗和理論依據(jù)。研究胃癌細胞表面MAL特異性識別、結(jié)合的糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)特點，有可能利用這些特異性

19、糖蛋白作為靶點或抗原，研制、開發(fā)其抑制劑或單抗，通過對末端糖鏈的修飾作用，消除或降低腫瘤細胞的惡性轉(zhuǎn)移或侵襲性能，為臨床提供新的治療方法13。4凝集素4.1簡介凝集素是一類糖結(jié)合蛋白，廣泛分布于各種有機體中。凝集素的最大特點是能專一的識別糖蛋白或糖脂中某一特定的單糖或寡聚糖中特定的糖基序列而與之結(jié)合14。細胞膜及細胞漿內(nèi)存在凝集素受體，正常情況下這種凝集素受體相對穩(wěn)定，當(dāng)細胞惡變時，受體的數(shù)量和性質(zhì)隨機改變。利用凝集素具有與特定糖基轉(zhuǎn)移性結(jié)合的特性，將其作為分子探針檢測腫瘤細胞表面及細胞內(nèi)糖基受體的分布，研究腫瘤細胞的惡性進展和侵襲、轉(zhuǎn)移情況，對于腫瘤的早期診斷、監(jiān)控腫瘤進展及評價預(yù)后具有重要

20、的臨床價值13。4.2 MAL簡介植物凝集素MAL是從植物朝鮮槐的種子中提取的一種糖結(jié)合蛋白，是一種有效的淋巴細胞有絲分裂促進劑。研究發(fā)現(xiàn)MAL對NeuAc 2,3Gal1,4GlcNAc/Glc這一完整的三糖結(jié)構(gòu)具有特異性識別與結(jié)合作用，且MAL僅能夠識別N-型糖鏈的末端唾液酸，MAL僅對胃癌細胞表面糖鏈結(jié)構(gòu)有特異性結(jié)合反應(yīng)，而在正常胃粘膜細胞表面無MAL識別的糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)NeuAc 2,3Gal1,4GlcNAc/Glc的表達15、16。近年來被廣泛的應(yīng)用于檢測和分析腫瘤細胞表面唾液酸水平的改變。4.3 MAL對胃癌細胞表面糖鏈的標記胃癌細胞表面存在MAL特異性識別并結(jié)合的NeuAc 2

21、,3Gal1,4NAc/Glc糖鏈結(jié)構(gòu)，且這一糖鏈結(jié)構(gòu)僅存在于胃癌組織的細胞表面，在正常胃粘膜細胞表面無表達。此外，2,3唾液酸與胃癌的侵襲深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性。胃癌細胞表面出現(xiàn)的這一唾液酸水平的改變以及這種改變與胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移潛能之間的相關(guān)性，其生物學(xué)機制迄今仍然未知，國內(nèi)外文獻對其亦鮮有報道。在目前研究中，檢測了幾種胃癌細胞表面2,3唾液酸的表達水平，并對其表達與胃癌細胞的侵襲、遷移潛能之間的相關(guān)性做了進一步研究。2,3唾液酸在三種不同胃癌細胞表面的表達存在差異，且均顯著高于正常胃粘膜細胞。此外，細胞表面唾液酸化水平最高的C-7901表現(xiàn)出更強的與人工基膜Matrigel的粘附能力

22、和侵襲、遷移能力。第二部分 課程設(shè)計部分 胃癌細胞表面,唾液酸糖鏈表達與其 侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)性的研究胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，具有起病隱匿、發(fā)展迅速、死亡率高的特點。在我國許多地區(qū)的惡性腫瘤死亡統(tǒng)計中，胃癌多居前位，往往一經(jīng)發(fā)現(xiàn)已經(jīng)處于中晚期，失去了手術(shù)根治的機會。因此，早期發(fā)現(xiàn)和科學(xué)診斷胃癌的發(fā)生是胃癌研究的重要內(nèi)容。胃癌的的侵染、轉(zhuǎn)移成為胃癌疾病研究的一個重要方向。研究表明胃癌細胞的轉(zhuǎn)移主要是因為腫瘤細胞游走性增加，即腫瘤細胞之間及與周圍組織粘附作用的減低是腫瘤細胞由原發(fā)灶脫落的主要原因。而粘附作用的減低又主要與腫瘤細胞表面糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)的改變有密切關(guān)系5。其中腫瘤細胞表面唾液酸化水

23、平增加與腫瘤的惡性進展及早期轉(zhuǎn)移有密切聯(lián)系。有關(guān)唾液酸在人胃癌細胞表面表達的特異性及其臨床意義的研究，國內(nèi)外相關(guān)報道較少。所以本實驗通過用凝集素對胃癌細胞表面唾液酸的檢測，細胞粘附性檢測和胃癌細胞在重組基底膜中的轉(zhuǎn)染來研究唾液酸與胃癌細胞侵染、轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，為研究胃癌藥物研究提供理論基礎(chǔ)。1材料1.1細胞株及細胞培養(yǎng)人中分化胃腺癌細胞SGC-7901以及人低分化胃腺癌細胞BGC-823由中科院上海細胞生物研究所提供。人高分化胃腺癌細胞MKN-28和人正常胃粘膜細胞GES-1由北大醫(yī)學(xué)部細胞生物學(xué)教研室提供。SGC-7901、BGC-823和MKN-28生長于含1096小牛血清的RPMI一164

24、0培養(yǎng)液中，GES-1生長于含1096胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中。1.2試劑 藥品廠家 生物素標記MAL(Biotin-MAL)Vector，美國 小牛血清白蛋白北京中山生物科技有限公司 辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)標記鏈霉卵白素 北京中山生物科技有限公司 蘇木素福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司 DMEM培養(yǎng)基Gibco，美國 RPMI 1640培養(yǎng)基Gibco，美國 胰蛋白酶Gibco，美國 , sialyllactoseSigma，美國 新生小牛血清蘭州民海生物技術(shù)有限公司 胎牛血清JRH bioscience，澳大利亞 異硫氰酸熒光素標記MAL

25、laboratori es，美國 DAB顯色試劑盒北京中山生物科技有限公司 MatrigelBecton Dickinson，美國 纖粘連蛋白(Fibronection，F(xiàn)N)北大醫(yī)學(xué)部病理學(xué)教研室 結(jié)晶紫中國遠航試劑廠 Transwell小室Corning Costar，美國 96孔、24孔培養(yǎng)板Corning Costar，美國 1.3試劑配制1.3.1 D-HankS液配制NaCl 8.0gKCl 0.4gNa2HP0412H20 0.12gKH2P04 0.06g無水葡萄糖 1.0g雙蒸水加至 1000ml將上述溶液用NaHCO3。調(diào)節(jié)pH至7.2-7.4，分裝，于121高壓蒸汽滅菌3

26、0，-20以下冰凍保存。1.3.2 0.25%胰蛋白酶溶液配制胰蛋白酶粉 2.5gD-HankS液加至 1000ml將上述溶液用NaHCO2。調(diào)節(jié)pH至7.2.-7.4，用0.22um微孔濾膜濾過除菌，無菌分裝，-20以下冰凍保存。1.3.3 0.4%臺盼藍溶液配制臺盼藍粉 0.4gPBS液加至 l00ml 將上述溶液加熱使之完全溶解，用濾紙過濾除渣，裝入瓶內(nèi)室溫保存。1.3.4 0.1%結(jié)晶紫溶液配制結(jié)晶紫粉 0.1g20%甲醇溶液加至 l00ml將結(jié)晶紫粉完全溶解，用濾紙過濾除渣，裝入瓶內(nèi)室溫保存。1.4儀器設(shè)備儀器 廠家 型號倒置顯微鏡 NIKON，日本 ECLIPSE TE2000一S

27、倒置生物顯微鏡 重慶光學(xué)儀器廠 XDS-1B二氧化碳培養(yǎng)箱 美國SHELLAB 2406-2 多功能酶標儀 HYPERLINK /netshow/SH101173/廣州云星科學(xué)儀器有限公司 LB940電子恒溫水浴鍋 黃驊市卸甲儀器廠 DZKW-C電熱干燥箱 青島鐵器二廠 Te202-1凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備廠 SW-CJ一2F立式壓力蒸汽滅菌器 上海中安醫(yī)療器械廠 LDZX-50KBS電子分析天平 Shimadzu，日本 AWl20托盤式扭力天平 上海第二天平儀器 TN-IOOB濕盒 北京中山生物科技有限公司2方法2.1 MAL細胞化學(xué)染色2.1.1 細胞玻片的處理將蓋玻片置清潔液中浸泡過夜

28、，自來水沖洗20遍，雙蒸水沖洗3遍，烘干后高壓消毒，然后放入24孔培養(yǎng)板內(nèi)備用。2.1.2 細胞消化取指數(shù)生長期細胞，PBS洗細胞兩次，用0.25%胰蛋白酶消化，加入含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液或含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，輕輕吹打成單細胞懸液。2.1.3 接種、染色調(diào)整各細胞濃度為1105/m1，接種于載有蓋玻片的24孔板內(nèi)，每孔接種lml，每種細胞設(shè)3個復(fù)孔，置370C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。待細胞爬滿蓋玻片后，從培養(yǎng)箱內(nèi)取出培養(yǎng)板，PBS洗3次，每次3分鐘，4%多聚甲醛固定30min。將蓋玻片浸入到0.75%H202/PBS溶液中，370C孵育3分鐘，以阻斷

29、內(nèi)源性過氧化物酶。PBS洗，每張蓋玻片滴加1%BSA 50 ul，370C孵育30min以消除非特異性染色。棄去BSA溶液，每張蓋玻片滴加50 ul Biotin-MAL(4 pg/m1)，370C孵育1h。PBS液振洗，每張蓋玻片滴加HRP標記的鏈霉卵白素，室溫孵育30min。滴加DAB顯色劑，顯微鏡下觀察顯色情況。水洗，蘇木素復(fù)染，流水沖洗3min，以洗去未與組織結(jié)合的染液。蓋玻片經(jīng)梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片。陰性對照：用PBS緩沖液代替Biotin-MAL，其余步驟不變。2.2.4 結(jié)果判斷及分析顯微鏡下觀察并拍照(400)，以細胞膜或細胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃染色者判斷為陽性。按

30、照上、下、左、右、中五個視野分別計數(shù)總細胞數(shù)和陽性細胞數(shù)，計算不同細胞株MAL的陽性率。. 體外細胞粘附試驗在96孔板中分別加入含Matrigel 2ug的RPMll640培養(yǎng)液50u1，抽氣干燥備用。每孔加入含3%BSA的無血清培養(yǎng)液20u1，370C孵育1h。每孔加入200u1PBS，振搖沖洗10min。棄去PBS，每孔加入50u1 0.04%結(jié)晶紫染液，靜置20min。棄去結(jié)晶紫染液，PBS洗三次以去除剩余染液，顯微鏡觀察并成像(200)。每孔加入10%冰醋酸100u1抽取結(jié)晶紫染液10min，于多標記分析儀560nm處檢測吸光度值。. 重組基底膜侵襲實驗2.3.1 包被基底膜Trans

31、well 小室上室面包被Matrigel 5ug，在下室面鋪10u1FN，4風(fēng)干。2.3.2 水化基底膜每個小室加入250u1預(yù)溫的含1%BSA的無血清培養(yǎng)液，37孵育30min，使基質(zhì)膠水化，棄去剩余培養(yǎng)液。2.3.3 接種細胞制備細胞懸液前先將細胞撤血清饑餓12d,時，進一步去除血清的影響。取胃癌細胞,臺盼藍染色,檢查活細胞比例為95%以上。將細胞懸浮于含0.1%BSA-RPMI 1640培養(yǎng)液中。調(diào)整細胞濃度為1106/ml。將細胞懸液加到Transwell小室，每小室100ul，每種細胞設(shè)三個復(fù)室。將24孔板各孔內(nèi)加入600ul含0.1%BSA的RPMll640培養(yǎng)液，將小室浸入含有培

32、養(yǎng)液的24孔板中，置于5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，37常規(guī)培養(yǎng)8d時。2.3.4 細胞染色取出小室，用棉簽仔細擦去Matrigel基質(zhì)膠和上室面未侵襲的細胞。以4%多聚甲醛固定20min ，0.1%結(jié)晶紫染10min ，水洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，用中性樹膠將膜封于載玻片上。2.3.5 穿膜細胞計數(shù)顯微鏡觀察并成像(400)，計數(shù)10個視野侵襲細胞的數(shù)量，取其平均值為每種細胞的侵襲轉(zhuǎn)移數(shù)量。2.3.6 統(tǒng)計學(xué)分析采用單向方差分析評價體外細胞粘附實驗及重組基底膜侵襲實驗結(jié)果，SPSSl1.O統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。3 設(shè)計3.1 胃癌細胞表面,唾液酸糖鏈結(jié)構(gòu)與其轉(zhuǎn)移能力的相關(guān)性 胃癌細胞表面,唾液酸的檢

33、測。高度分化、中度分化、低度分化的胃癌細胞和正常胃癌細胞進行實驗，將實驗分為4組，每種細胞作為一組，用Biotin-MAL對細胞進行侵染，在顯微鏡下進行觀察。用PBS液代替Biotin-MAL對細胞進行侵染，作為陰性對照組，其他條件不變，統(tǒng)計出各種細胞的MAL陽性細胞數(shù)，計算出各種細胞的MAL陽性細胞率。 實驗分為4組，將四種細胞在RPMll640培養(yǎng)液培養(yǎng)一定時間，用結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下進行觀察，并用分光光度計檢測出各種細胞的吸光度，來區(qū)分他們與EMC的粘附能力。粘附能力強的轉(zhuǎn)移能力強，通過兩個實驗的結(jié)果對比分析，看,唾液酸在不同胃癌細胞表面的表達與ECM粘附能力是否有關(guān)。3.2 胃癌細胞

34、表面,唾液酸糖鏈結(jié)構(gòu)與其侵染能力的相關(guān)性 實驗分為四組，用重組基底膜接種四種細胞，將重組基底膜放到培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)一段時間，在顯微鏡下進行觀察，統(tǒng)計出細胞的轉(zhuǎn)移數(shù)目。用不同種細胞的轉(zhuǎn)移數(shù)同上述MAL細胞化學(xué)染色的結(jié)論進行對比分析，看,唾液酸與胃癌細胞侵襲是否有關(guān)。4 總結(jié)胃癌細胞表面唾液酸的檢測選用MAL凝集素是因為MAL對NeuAc ,Gal1,4GlcNAc/Glc這一完整的三糖結(jié)構(gòu)具有特異性識別與結(jié)合作用，且MAL僅能夠識別N-型糖鏈的末端唾液酸，MAL僅對胃癌細胞表面糖鏈結(jié)構(gòu)有特異性結(jié)合反應(yīng)，而在正常胃粘膜細胞表面無MAL識別的糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)NeuAc , Gal 1,4 GlcNAc

35、/Glc的表達，能夠明顯的區(qū)分出胃癌細胞和正常細胞。所以凝集素的選用非常重要。此結(jié)果還可以通過用流式細胞儀進行檢測。唾液酸在胃癌細胞表面特異性表達，對胃癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移非常重要。通過用體外粘附能力的測定來測定細胞的轉(zhuǎn)移的能力。體外細胞粘附實驗測定的為細胞和之間的粘性，粘性越大細胞隨的流動能力強，細胞的轉(zhuǎn)移能力就會增加。胃癌細胞的侵染是侵染其它細胞，穿過其它的細胞膜，所以細胞的侵染能力的測定過程中模擬細胞的生理環(huán)境非常的重要，因此選用基底膜的包被，此實驗對基底膜的選用和處理非常重要。5 設(shè)計體會本次課程設(shè)計我選擇的設(shè)計題目是胃癌細胞表面2,3唾液酸糖鏈結(jié)構(gòu)的高表達及其與胃癌細胞的轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究

36、 ，課程設(shè)計期間，緊張而充實，我們查閱資料文獻、閱讀文獻、提出自己的設(shè)計方案、撰寫設(shè)計論文、修改實驗論文在此期間雖然遇到很多的問題，但是我們從中也學(xué)習(xí)到了很多關(guān)于癌癥的相關(guān)知識。我之所以選擇胃癌細胞的相關(guān)問題為這一設(shè)計課題是因為現(xiàn)在胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一。在我國許多地區(qū)的惡性腫瘤死亡統(tǒng)計中，胃癌多居前位，我們周圍就有很多胃癌患者，而胃癌之所以很難治愈是因為胃癌的起病隱匿，一般發(fā)現(xiàn)癥狀很多都是胃癌晚期不再適合做手術(shù)，無法醫(yī)治，而且胃癌的發(fā)展非常迅速，死亡率高，而癌癥的最大問題所在是因為胃癌細胞的擴散問題。通過查閱資料，我了解到胃癌細胞的侵染、轉(zhuǎn)移的研究是一個潛在的研究方向。在設(shè)計過程中

37、我遇到了幾個難題，目前國內(nèi)有關(guān)癌癥轉(zhuǎn)移的為題研究還不是很明確，參考資料還不是很多。后來隨著參考資料的進一步閱讀和理解，還有和同學(xué)的討論，最終提出和完成了自己的設(shè)計方案，此外在設(shè)計過程中和設(shè)計方案的書寫過程中也遇到了問題，在什么是方法什么是設(shè)計，方法和設(shè)計之間有什么區(qū)別，該如何書寫方法和設(shè)計，這一問題讓我很傷腦筋，最終通過和同學(xué)的討論決定用本設(shè)計的書寫方式。在書寫論文的時候在排版格式和內(nèi)容上和老師所給模板有所出入，經(jīng)過再三的修訂最終定稿。如今，這門課程馬上要接近尾聲了，看著自己這些天通過奮斗設(shè)計的成果，在欣慰的同時也認識到自己的不足。這門課程設(shè)計對我來說是一次學(xué)習(xí)和提高的經(jīng)歷，他將會激勵我今后更

38、加努力得學(xué)習(xí)和豐富自己。在此次學(xué)習(xí)課程中，我將以往那些學(xué)到的專業(yè)知識得意加強和綜合，更有助于我們下一步的學(xué)習(xí)。這次課程設(shè)計不僅提高了我的專業(yè)知識，提高自己的思維動手能力，同時也提高了我的計算機水平。這次課設(shè)對我來說是一個非常難得的學(xué)習(xí)機會，對此我非常感謝學(xué)校給我們開設(shè)了這門課程和趙紅衛(wèi)老師對我們的悉心指導(dǎo)，讓我受益匪淺。也感謝我的同學(xué)在我設(shè)計過程中給予的幫助和支持，在此對他們表達我真摯的謝意！參考文獻1 Varki A. Glycan-based interactions involving vertebrate sialic-acid-recognizing proteinsJ. Natur

39、e, 2007, 446: 1023-1026.2 Varki A. Sialic acids as ligands in recognition phenomenaJ. FASEBJ, 1997, 11(4):248-255.3 Fukuda M. Possible roles of tumor-associated carbohydrate antigensJ. Cancer Res,1996, 56(5): 672-679. 4 崔淑香. 胃癌細胞表面,唾液酸糖鏈結(jié)構(gòu)高表達與胃癌襲相關(guān)性研究D. 山東: 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院, 2008.5 Fan X, She YM, Bagshaw RG, Callahan JW eta1. Identification of the hydrophobic