骨髓腔內(nèi)注射造血干細(xì)胞移植的研究和應(yīng)用進(jìn)展

1、骨髓腔內(nèi)注射造血干細(xì)胞移植的研究和應(yīng)用進(jìn)展【摘要】骨髓腔內(nèi)注射造血干細(xì)胞移植旨在促進(jìn)HS的歸巢。近年來已有大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)肯定了不同來源供體細(xì)胞通過骨髓腔內(nèi)注射能有效地歸巢并植入骨髓、迅速重建受體造血和免疫功能、減少GVHD，誘導(dǎo)同種異基因器官移植免疫耐受，進(jìn)步受體生存率。本文主要對該技術(shù)在骨髓移植、臍血移植、研究HS生物學(xué)特性等方面的作用以及臨床應(yīng)用前景進(jìn)展綜述?！娟P(guān)鍵詞】骨髓腔內(nèi)注射PrgressfResearhandAppliatinnHeatpietiSteellTransplantatinbyIntra-bnearrInjetinRevieAbstratThepurpsefheatpi

2、etisteelltransplantatinbyintra-bnearrinjetin(IB-HST)istfailitatethehingfHS.IthasbeenreentlyprveninanyanialexperientsthatdifferentkindsfdnrellsuldeffiientlyheandengraftintthebnearrbyIB-HST，hihledttherapidhepietiandiunereveryfreipients，preventingthedevelpentfGVHD，induingthednr-speifitleraneinallgenEir

3、gantransplantatin，andprtingthesurvivalratefreipients.Inthisrevie，theeffetfIB-BTandIB-UBT，theappliatinfIBinjetintehniqueinthestudynHSsbilgialharateristis，anditsprspetfrlinialHSTeresuarized.Keyrdsintra-bnearrinjetin；heatpietisteelltransplantatin；bnearrtransplantatin；rdbldtransplantatin造血干細(xì)胞移植(heatpiet

4、isteelltransplantatin，HST)經(jīng)過40余年的臨床應(yīng)用，已成為可以治愈血液并實(shí)體瘤、遺傳代謝性疾并自身免疫性疾病等多種疾患的平安有效的治療手段，其進(jìn)一步開展尚依賴于諸多因素，如探究HS的最正確來源和輸注途徑，對HS及其相關(guān)細(xì)胞因子生物學(xué)特性的進(jìn)一步研究，預(yù)處理方案的優(yōu)化以及對移植相關(guān)并發(fā)癥的預(yù)防和處理等等。新的理論和移植技術(shù)層出不窮，其中旨在促進(jìn)HS歸巢的骨髓腔內(nèi)注射intra-bnearrinjetin，IBI技術(shù)，自2001年Kushida等1首次提出后，隨著動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有效性的報(bào)道不斷增多，已向我們展示出它對HST的重要作用和廣闊的臨床應(yīng)用前景。經(jīng)外周靜脈輸注HS的歸巢以

5、及對HST的影響傳統(tǒng)HS輸入途徑為經(jīng)外周靜脈輸注，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床HST與相關(guān)根底研究中。以此法輸注的HS須先經(jīng)右心房、右心室、肺部進(jìn)入體循環(huán)，在4小時(shí)內(nèi)根據(jù)血流量的不同進(jìn)入骨髓、肝、脾、肺、骨骼肌及其它組織中，但絕大部分滯留于肺部，僅有少量HS能在某些細(xì)胞因子如SDF-1及其受體XR4等的影響下識別相應(yīng)的血管位點(diǎn)并穿越基底層到達(dá)骨髓腔。這一特異且迅速的過程稱為HS“歸巢hing，一般在移植后12-36小時(shí)內(nèi)完成。只有歸巢并定居于骨髓微環(huán)境中適宜“龕位nihe的HS才能進(jìn)一步增殖、分化和重建造血2。有研究發(fā)現(xiàn)移植后3小時(shí)僅有5.60.7%的供體細(xì)胞到達(dá)骨髓腔3。Yahata等2將PKH-

6、26標(biāo)記的人臍血D34+細(xì)胞經(jīng)尾靜脈輸入經(jīng)60亞致死量照射后的ND/SID小鼠，發(fā)現(xiàn)移植后20小時(shí)受體骨髓腔中的供體細(xì)胞只占其骨髓細(xì)胞總數(shù)的1.560.32%。經(jīng)外周靜脈輸注的HS如此低的歸巢比例無疑將明顯影響其植入效率。由van-der-L等4所進(jìn)展的小鼠同種異基因HST中，骨髓和脾臟的種植效率分別為18%-20%和8%-10%。在異種移植中該比例更低，據(jù)ashan等5報(bào)道，人臍血HS植入亞致死量輻照的ND/SID小鼠的效率為7%。中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志JExpHeatl2022；14(1)骨髓腔內(nèi)注射造血干細(xì)胞移植的研究和應(yīng)用進(jìn)展為減少HS在受體骨髓外器官組織的滯留而造成的損失，國內(nèi)外學(xué)者曾嘗

7、試HS的其他注射途徑。如劉英等6將人臍血N直接注入胚胎卵黃囊內(nèi)進(jìn)展SD大鼠宮內(nèi)移植，植入率為89.7%，未發(fā)生GVHD。這一結(jié)果提示胚胎對異體抗原的反響表現(xiàn)為免疫耐受，外源性HS卵黃囊內(nèi)移植能更早地與受體HS競爭，產(chǎn)生更高的嵌合比例；Fan等7發(fā)現(xiàn)，經(jīng)門靜脈注射prtalveininjetin，PVinjetin的HS在7天內(nèi)遷移至造血、免疫器官，移植后第3天和第7天肝臟、骨髓和胸腺中供體源細(xì)胞明顯高于尾靜脈注射組i.v組。PV組67%的小鼠可存活40天以上，i.v組小鼠那么在23天內(nèi)全部死亡，提示HST門靜脈注射途徑可有效地重建造血和免疫，進(jìn)步受體存活率。顯然以上方法都因技術(shù)操作難度大、設(shè)備

8、條件限制不易于臨床的應(yīng)用和推廣。近年來的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究提示，具有較長臨床應(yīng)用歷史的骨髓腔內(nèi)輸注技術(shù)可能是一種平安、有效的HS輸注手段。骨髓腔內(nèi)輸注的理論根底與臨床應(yīng)用位于長骨骨髓腔和扁骨松質(zhì)骨骨小梁中的骨髓含有豐富的血管，某些小血管的管壁變雹管腔擴(kuò)大成為血竇，骨髓腔內(nèi)充滿網(wǎng)狀的海綿狀靜脈竇。長骨和扁骨骨髓腔中的靜脈竇聚集成一至數(shù)條大的靜脈沿動(dòng)脈徑路出骨后匯入靜脈干。骨髓腔內(nèi)靜脈竇一定程度的開放狀態(tài)和高通透性是骨內(nèi)輸液的解剖學(xué)根底，控制輸注速度和濃度既能進(jìn)步部分藥物濃度又能使輸入的藥物和液體有效地進(jìn)入全身血液循環(huán)，成人輸液速度可達(dá)20-50l/in。骨穿刺部位宜選四肢長骨尤其是脛骨近端，骨質(zhì)較硬者

9、可采用脛骨中部稍上方處。髂骨、胸骨、鎖骨均不如四肢長骨操作方便和成功率高。并發(fā)癥少見，多為液體滲漏皮下或骨膜下、繼發(fā)感染、骨筋膜室綜合征、脂肪栓塞等8。由于靜脈輸液導(dǎo)管類型和質(zhì)量的改良，20世紀(jì)40年代后期骨髓腔輸液已很少用于常規(guī)治療，而多用于急癥搶救時(shí)建立輸液通路和某些疾病的特殊治療。傅美珍等9單用超小劑量阿糖胞苷8-10毫克/次，每周1次骨髓腔內(nèi)注射治療2例成人急性非淋巴細(xì)胞白血病(2型)，分別于51天、57天獲得完全緩解。Sesay等10在脊椎整形術(shù)中以利多卡因椎骨腔注射結(jié)合納布啡、丙帕他莫靜脈推注，麻醉有效率與單純靜脈用藥組相當(dāng)85%vs84%，但副作用的發(fā)生率少75%，利多卡因血漿濃

10、度僅為中毒劑量的1/4。還有骨髓腔內(nèi)用藥成功治療再生障礙性貧血、創(chuàng)傷性骨髓炎等疾病的報(bào)道，但至今尚無骨髓腔內(nèi)注射HST的臨床研究資料。骨髓腔內(nèi)注射HST的實(shí)驗(yàn)研究現(xiàn)狀骨髓腔內(nèi)注射HST的直接目的是增加HS的歸巢。但已有研究證實(shí)，經(jīng)骨髓腔內(nèi)輸注的藥物可迅速地彌漫到靜脈竇，從骨髓到動(dòng)脈與從靜脈到動(dòng)脈的循環(huán)時(shí)間一致。但直接注射入骨髓腔中的HS是否能及時(shí)、有效地植入“龕位nihe并增殖分化、重建受體造血免疫功能，IB輸注途徑對受體免疫功能的恢復(fù)及GVHD有何影響，鑒于骨髓腔穿刺可能增加病人的痛苦和繼發(fā)感染的時(shí)機(jī)，該方法是否有肯定的臨床應(yīng)用價(jià)值等問題都需要深化討論。目前對這一技術(shù)的研究成果主要是在動(dòng)物實(shí)

11、驗(yàn)的根底上改良和完善其詳細(xì)操作方法，并已通過一系列的動(dòng)物模型驗(yàn)證其有效性。骨髓腔內(nèi)注射骨髓移植IBI-BT雖然IBI在臨床上是非常成熟、平安的技術(shù)，但對于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，尤其是嚙齒類小動(dòng)物那么不易操作，從而限制了對此技術(shù)的深化研究。近年來，日本關(guān)西醫(yī)科大學(xué)Ikehara指導(dǎo)的研究小組對動(dòng)物骨髓液的采集、IBI的方法做了部分改良，其可操作性大為進(jìn)步。Ikehara小組以長骨灌流法perfusine-thd采集骨髓，IBI那么以受鼠長骨如脛骨、股骨為穿刺部位，行約5皮膚切口，持50l或1l微量注射器以26-29G針頭自膝關(guān)節(jié)外表穿過膝腱插入骨髓腔。每只受鼠注射供體細(xì)胞數(shù)為5106-3107B，注射液容量

12、為3.5-40微升/每側(cè)脛骨腔。Ikehara小組已建立了小鼠、大鼠、家兔及食蟹猴等多種移植動(dòng)物模型?，F(xiàn)有研究資料說明，IBI-BT單獨(dú)或與其它方法結(jié)合運(yùn)用能明顯進(jìn)步供體細(xì)胞植入效率，促進(jìn)受體造血、免疫功能的重建。Kushida等1應(yīng)用IBI技術(shù)，以正常57BL/6小鼠為供體對狼瘡性腎炎RL/lpr小鼠行異基因骨髓移植，發(fā)現(xiàn)IBI組移植后3天供體源性骨髓細(xì)胞在受體注射側(cè)及非注射側(cè)脛骨骨髓中均占60%，脾臟中占40%，移植后10天在上述部位幾乎到達(dá)100%，而i.v組移植后3天供體源性細(xì)胞在骨髓中10%，移植后10天為70%。IBI組所有受鼠的無病生存期超過1年，原有的異常T細(xì)胞Thy1.2+/

13、B220+/D4-/D8-消失，混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)及抗綿羊紅細(xì)胞抗體生成實(shí)驗(yàn)證實(shí)受體具有正常的免疫功能；2022年Nakaura等11報(bào)道，將骨髓腔內(nèi)注射細(xì)胞濃度進(jìn)步至5106/3.5l，行雙側(cè)脛骨注射并結(jié)合供體外周血單個(gè)核細(xì)胞PBN靜脈輸注DLI，平均于BT后7天植入并成為完全供體型，受鼠到達(dá)長期存活120天；Zhang等12那么進(jìn)一步比擬骨髓造血細(xì)胞結(jié)合基質(zhì)細(xì)胞骨髓腔內(nèi)輸注或靜脈輸注及單純骨髓造血細(xì)胞骨髓腔內(nèi)輸注的移植效果，發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞同時(shí)骨髓腔內(nèi)注射可以更好地促進(jìn)供體細(xì)胞在受體內(nèi)的造血、免疫重建。在本質(zhì)器官移植中，IBI-BT亦起到良好的誘導(dǎo)免疫耐受的作用。Esui等13將受體BN大鼠予氟

14、達(dá)拉賓+亞致死量60輻照預(yù)處理，24小時(shí)后移植F344大鼠后肢并承受其骨髓細(xì)胞IBI。在不予免疫抑制劑的情況下觀察一年，全部受鼠存活，移植肢體均未出現(xiàn)排擠反響，而且供體細(xì)胞能完全重建造血。Ikehara14認(rèn)為IBI-BT有以下優(yōu)勢：GVHD罕見，即使供體細(xì)胞中含有一定量的T細(xì)胞6%亦無GVHD發(fā)生；植入率高，即使預(yù)處理照射劑量低于亞致死量也可移植成功；造血重建快；T細(xì)胞的功能可以完全恢復(fù)。IBI-BT的有效性與其促進(jìn)骨髓HS與基質(zhì)細(xì)胞的歸巢親密相關(guān)：經(jīng)骨髓腔注射的HS可在注射及非注射部位的骨髓和其它造血器官中迅速到達(dá)最正確的分布。IBI-BT可以有效地使供體骨髓基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)入受體受損的骨髓微環(huán)

15、境中支持造血。同時(shí)這些基質(zhì)細(xì)胞可通過直接包繞HS或分泌具免疫抑制作用的肝細(xì)胞生長因子HGF、轉(zhuǎn)化生長因子TGF-等細(xì)胞因子使HS免受免疫活性細(xì)胞的攻擊，還可經(jīng)血循環(huán)進(jìn)入胸腺參與T細(xì)胞的陽性選擇而促進(jìn)T細(xì)胞免疫功能的恢復(fù)。灌流法P能防止傳統(tǒng)髂骨多點(diǎn)穿刺抽取法所造成的外周血如D4+、D8+T淋巴細(xì)胞混入，因此減少甚至防止了GVHD的發(fā)生，而P法采集的HS活性亦高于傳統(tǒng)方法。骨髓腔內(nèi)注射臍血移植IBI-UBT臍血移植UBtransplantatin，UBT已經(jīng)成為可替代B-HST的重要治療手段。但由于單份UB所含HS數(shù)量有限并更為幼稚，免疫效應(yīng)細(xì)胞功能不成熟，以致UBT后造血、免疫重建延遲，感染率、

16、移植相關(guān)死亡率較高，在一定程度上影響和限制了UBT的開展應(yīng)用。有希望解決UBT造血恢復(fù)延遲的策略包括通過體外擴(kuò)增、混合臍血移植等方法增加UB中HS的數(shù)量，以間充質(zhì)干細(xì)胞esenhyalsteell，S與造血干細(xì)胞結(jié)合移植以促進(jìn)供體HS歸巢骨髓并迅速增殖等。其中，促進(jìn)UB中有限的HS歸巢并植入骨髓是目前研究的熱點(diǎn)之一。已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)IBI-UBT同樣能促進(jìn)HS歸巢，進(jìn)步植入效率。ang等15將人臍血D34+細(xì)胞2104-2105/40l注入ND/SID小鼠脛骨骨髓腔中并做限制性稀釋法分析供體細(xì)胞的植入頻率，發(fā)現(xiàn)IB組人臍血Lin-/lD34+D38-細(xì)胞的植入頻率為1/44，而i.v組僅為1/

17、660。移植后在外周血、脾臟及非注射側(cè)脛骨骨髓腔內(nèi)均檢出該供體細(xì)胞并可以分化，提示骨髓內(nèi)移植有正常的歸巢和種植機(jī)制。取出移植后6周的小鼠骨髓內(nèi)人D45+細(xì)胞進(jìn)展第2次靜脈或骨髓內(nèi)注射，IBI組與i.v組的供體嵌和比例分別為0.5460.268、0.0310.018P0.01；astell等16報(bào)道，將IBI組輸注的人臍血細(xì)胞數(shù)減少1/2，于移植后30、60、90天與i.v組比擬受體內(nèi)人D45+細(xì)胞和D45+/D34+細(xì)胞含量，兩組無明顯差異。可見IBI法具有更高的移植效率，尤其在UBT輸注細(xì)胞數(shù)有限的情況下更具有應(yīng)用價(jià)值。對于其它來源的HS，如小鼠胚胎干細(xì)胞R1誘導(dǎo)分化的HS，骨髓腔內(nèi)注射亦較

18、靜脈輸注有明顯的優(yōu)勢。骨髓腔內(nèi)注射在HS生物學(xué)特性研究中的作用IBI技術(shù)除了可應(yīng)用于不同來源造血干細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)，還可廣泛用于有關(guān)HS的根底研究。例如D34-HS由于歸巢相關(guān)受體表達(dá)程度較低而缺乏SDF-1/XR4介導(dǎo)的歸巢才能，以傳統(tǒng)靜脈輸注途徑移植無法重建受體的造血免疫功能，因此難以研究其生物學(xué)特性。為排除歸巢的影響，Kiura等17將人臍血Lin-D34-細(xì)胞直接注射入經(jīng)60亞致死量照射的ND/SID鼠脛骨骨髓腔中，可使供體細(xì)胞成功植入。與D34+細(xì)胞相比，該群細(xì)胞在受體內(nèi)的分化、造血重建雖較緩慢，但具更高的增殖和遷移潛能，屬于原始的HS，有更好的同質(zhì)性hgenusnature；Zhng等

19、18那么以股骨骨髓腔內(nèi)注射的方法比擬供體骨髓細(xì)胞在清髓或非清髓受鼠體內(nèi)的再分布和增殖情況，結(jié)果顯示預(yù)處理方式對移植細(xì)胞的骨髓內(nèi)再分布無明顯影響，供體細(xì)胞在非清髓受體中植入率低的主要原因是無法有效擴(kuò)增，而不僅僅是“龕位的缺乏。骨髓腔內(nèi)注射HST的臨床應(yīng)用前景以上的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了骨髓腔內(nèi)注射可以通過促進(jìn)HS迅速有效的歸巢和植入骨髓來進(jìn)步HS的移植效率，因此有可能應(yīng)用于臨床HST。但有關(guān)于IB-HST的臨床研究資料卻極少。1998年Hagglund等19曾報(bào)道38例年齡18歲承受HLA全相合或1個(gè)位點(diǎn)不合的血緣相關(guān)骨髓移植，骨髓腔滴注(IB-drpinfusin，IB-drp)、i.v+IB-drp

20、和i.v組分別有8、10、20例，結(jié)果AN0.5109中位時(shí)間分別是20、19、18.5天，IB-drp組依賴靜脈營養(yǎng)和使用抗生素的時(shí)間明顯少于i.v組，而3組病例在急性和慢性GVHD發(fā)病率、移植相關(guān)死亡率、復(fù)發(fā)率及生存率方面無明顯差異。2022年Ikehara等14對此結(jié)果進(jìn)展回憶分析，認(rèn)為除了骨髓采集方法的影響外，Hagglund等19采用的髂骨骨髓腔滴注法容易使供體細(xì)胞過快地進(jìn)入外周血循環(huán)而不是停留于骨髓內(nèi)，因此不能到達(dá)最正確的注射效果。而目前的研究仍缺乏從臨床角度討論骨髓腔內(nèi)注射的最正確治療策略，如注射劑量、部位、速度等。綜上所述，大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)肯定了不同來源供體細(xì)胞通過骨髓腔內(nèi)注射途

21、徑能有效地歸巢并植入骨髓，到達(dá)迅速重建受體造血和免疫功能，減少GVHD，誘導(dǎo)同種異基因器官移植免疫耐受，進(jìn)步受體生存率的目的。這一技術(shù)值得進(jìn)一步進(jìn)入臨床移植研究和深化討論?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1KushidaT，Inaba，HishaH，etal.Intra-bnearrinjetinfallgenEibnearrells:aperfulnestrategyfrtreatentfintratableautiunediseasesinRL/lprie.Bld，2001；97:3292-32992YahataT，AndK，SatT，etal.AhighlysensitivestrategyfrSID-re

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