長沙理工大學(xué)基因工程試題1

1、長沙理工大學(xué)基因工程試題1作業(yè)一：一、名詞解釋：1、基因：是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，是DNA（兌氧核糖核酸）分子上具有遺傳信息的特定核甘酸序列的總稱，是具有遺傳效應(yīng)的DN吩子片段。2、基因組該指單倍體細(xì)胞中包括編碼序列和非編碼序列在內(nèi)的全部DNAO3、操縱子：原核生物的幾個(gè)功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因往往排列在一起，轉(zhuǎn)錄生成一個(gè)mRNA然后分別翻譯成幾種不同的蛋白質(zhì)。這些蛋白可能是催化某一代謝過程的酶，或共同完成某種功能。這些結(jié)構(gòu)基因與其上游的啟動(dòng)子，操縱基因共同構(gòu)成轉(zhuǎn)錄單位，稱操縱子。4、啟動(dòng)子:是RNAIK合酶結(jié)合位點(diǎn)周圍的一組轉(zhuǎn)錄控制組件，包括至少一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。在真核基因中增強(qiáng)子和啟動(dòng)子常交錯(cuò)覆蓋或連續(xù)

2、。有時(shí)，將結(jié)構(gòu)密切聯(lián)系而無法區(qū)分的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子樣結(jié)構(gòu)統(tǒng)稱啟動(dòng)子。5、增強(qiáng)子：是一種能夠提高轉(zhuǎn)錄效率的順式調(diào)控元件，最早是在SV40病毒中發(fā)現(xiàn)的長約200bp的一段DNA可使旁側(cè)的基因轉(zhuǎn)錄提高100倍，其后在多種真核生物，甚至在原核生物中都發(fā)現(xiàn)了增強(qiáng)子。增強(qiáng)子通常占100,200bp長度，也和啟動(dòng)子一樣由若干組件構(gòu)成，基本核心組件常為8,12bp,可以單拷貝或多拷貝串連形式存在。6、基因表達(dá)：是指細(xì)胞在生命過程中，把儲(chǔ)存在 DNA序中遺傳信息經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯，轉(zhuǎn)變成具有生物活性的蛋白質(zhì)分子。二、簡答題1、說明限制性內(nèi)切核酸酶的命名原則要點(diǎn)。答：限制性內(nèi)切核酸酶采用三字母的命名原則,即屬名+種名十

3、株名的各一個(gè)首字 母,再加上序號(hào).基本原則：3-4個(gè)字母組成，方式是：屬名+種名+株名+序號(hào)；首字 母：取屬名的第一個(gè)字母，且斜體大寫；第二字母：取種名的第一個(gè)字母,斜體小寫； 第三字母：(1)取種名的第二個(gè)字母,斜體小寫；(2)若種名有詞頭，且已命名過限制 酶，則取詞頭后的第一字母代替.第四字母：若有株名，株名則作為第四字母，是否大 小寫，根據(jù)原來的情況而定，但用正體.順序號(hào)：若在同一菌株中分離了幾種限制酶 則按先后順序冠以I,?,?, 等，用正體.2、什么是限制性內(nèi)切核酸酶的星號(hào)活性 受哪些因素影向，答:？類限制酶雖然識(shí)別和切割的序列都具有特異性，但是這種特 異性受特定條件的限制，即在一定

4、環(huán)境條件下表現(xiàn)出來的特異性。條件的改變，限 制酶的特異性就會(huì)松動(dòng)，識(shí)別的序列和切割都有一些改變，改變后的活性通常稱第 二活性，而將這種因條件的改變會(huì)出現(xiàn)第二活性的酶的右上角加一個(gè)星號(hào)表示，因 此第二活性又稱為星號(hào)活性。概括起來，誘發(fā)星活性的因素有如下幾種：(1)高甘油含量(5, v,v);(2)限制性內(nèi)切核酸酶用量過高(100U,ugDNA);(3)低離子強(qiáng)度(t段，然后與待克隆片段兩端連接起來，如果用 EcoRI切割這種 連接片段，就會(huì)產(chǎn)生EcoRI的單鏈末端。這種片段就可以插入到任何 EcoRI的限制 性內(nèi)切酶位點(diǎn)中。三、論述題什么是 Western印跡，它與Southern印跡有什么不同

5、 答：Western印跡是將蛋 白質(zhì)經(jīng)電泳分離后從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物上，然后用特異性的抗體進(jìn)行檢測(cè)。它與Southern的不同在于探針的性質(zhì)不同，在 Western印跡中使用的探針是抗體 （蛋白質(zhì)）。作業(yè)三：一、名詞解釋1、DN儂性:DNA分子由穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)松解為無規(guī)則線性結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。變 性時(shí)維持雙螺旋穩(wěn)定性的氫鍵斷裂，堿基間的堆積力遭到破壞，但不涉及到其一級(jí) 結(jié)構(gòu)的改變。2、DNAfi性：變性DNA在適當(dāng)條件下，二條互補(bǔ)鏈全部或部分恢復(fù)到天然雙螺 旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象，它是變性的一種逆轉(zhuǎn)過程。3、退火：指模板雙鏈DNAg熱變性，螺旋解開成單鏈后，通過緩慢冷卻到 55? 左右，使引物（即具有互

6、補(bǔ)堿基的RNAt段）與該模板DNAI鏈重新配對(duì)，形成新的 雙鏈分子的過程。4、DNA片：是指在固相支持物上原位合成寡核甘酸或者直接將大量的DN琳針以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后與標(biāo)記的樣品雜交，通過對(duì)雜 交信號(hào)的檢測(cè)分析，即可獲得樣品的遺傳信息。由于常用計(jì)算機(jī)硅芯片作為固相支 持物，所以稱為DNA片。5、錯(cuò)義突變：堿基替換的結(jié)果引起氨基酸順序的變 化。6、基因診斷：又稱DNA斷或分子診斷，通過分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技 術(shù)，直接檢測(cè)出分子結(jié)構(gòu)水平和表達(dá)水平是否異常，從而對(duì)疾病做出判斷。二、簡答題1、什么是藍(lán)白斑篩選法，答:這種方法是根據(jù)組織化學(xué)的原理來篩選重組體。主要是在，載體的

7、非必要區(qū) 插入一個(gè)帶有大腸桿菌，一半乳糖甘酶的基因片段，攜帶有l(wèi)ac基因片段的，載體轉(zhuǎn) 入lac的宿主菌后，在含有5一澳4一氯一3一引口朵一,一D一半乳糖甘(X-gal)平 板上形成淺藍(lán)色的噬菌斑。外源基因插人lac(或lac基因部分被取代)后，重組的噬菌體將喪失-分解X-gal的能力，轉(zhuǎn)入lac宿主菌后，在含有5一澳一4一氯一3一引珠一 ，一A半乳糖甘(X-gal)平板上形成白色的噬菌斑，非重組的噬菌體則為藍(lán)色噬菌 斑。2、什么是基因文庫，用重組DN徽術(shù)將某種生物細(xì)胞的總 DNA或染色體DNA勺所有片斷隨機(jī)地連接 到基因載體上，然后轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，通過細(xì)胞增殖而構(gòu)成各個(gè)片段的無 性繁

8、殖系(克隆)，在制備的克隆數(shù)目多到可以把某種生物的全部基因都包含在內(nèi)的 情況下，這一組克隆的總體就被稱為某種生物的基因文庫。3、黏性末端連接法是最常用的連接方法，具有許多優(yōu)點(diǎn)，但是也有一些不 足，請(qǐng)指出這些不足之處。答:黏性末端連接法不足之處有：(1)載體易自身環(huán)化；(2)若是用同一種限制性 內(nèi)切核酸酶產(chǎn)生的黏性末端連接又不易定向克??；(3)難插入特定的基因;(4)再者就 是大片段DNA勺重組率較低，即使用堿性磷酸酶處理了載體，防止了載體的自身環(huán) 化，載體也有成環(huán)的傾向；(5)用這種方法產(chǎn)生的重組體往往含有不止一個(gè)外源片段 或不止一個(gè)載體連接起來的串聯(lián)重組體，增加篩選工作的困難。4、什么是同聚

9、物加尾連接法，用何種方法加尾，具有哪些優(yōu)缺點(diǎn)，答:所謂同聚物加尾法就是利用末 端轉(zhuǎn)移酶在載體及外源雙鏈 DNA勺3端各加上一段寡聚核甘酸，制成人工黏性末 端，外源DNA載體DN6子要分別加上不同的寡聚核甘酸，如 dA(dG)和dT(dC), 然后在DN啦接酶的作用下漣接成為重組的 DNA這種方法的核心是利用末端轉(zhuǎn)移 酶的功能，將核甘酸轉(zhuǎn)移到雙鏈 DN的子的突出或隱蔽的2+3-OH上。以Mg乍為輔助因子，該酶可以在突出的 3-OH端逐個(gè)添2+加單核甘酸，如果用Co作輔助因子則可在隱蔽的或平末端的 3-OH端逐個(gè)添加單個(gè)核甘酸。同聚物加尾法實(shí)際上是一種人工黏性末端連接法，具有很多優(yōu)點(diǎn):(1)首先不

10、易自身環(huán)化，這是因?yàn)橥环N DNA勺兩端的尾巴是相同的，所以不存在自身環(huán)化。 (2)因?yàn)檩d體和外源片段的末端是互補(bǔ)的黏性末端，所以連接效率較高。(3)用任何一種方法制備的DNXB可以用這種方法進(jìn)行連接。同聚物加尾法也有一些不便之 處:(1)方法繁瑣；(2)外源片段難以回收。由于添加了許多同聚物的尾巴，可能會(huì)影 響外源基因的表達(dá)。另外要注意的是，同聚物加尾法同平末端連接法一樣，重組連 接后往往會(huì)產(chǎn)生某種限制性內(nèi)切核酸酶的切點(diǎn)。5、何謂接頭連接法，答:將人工合成的或來源于現(xiàn)有質(zhì)粒的一小段DN6子(在這一小段DN吩子上有某種限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別序列)，加到載體或外源DNA勺分子上，這樣便在 載體D

11、N用口外源DNAk制造出新的酶切點(diǎn)。把這一小段含有酶切點(diǎn)的DN的子稱為連接器分子，這種方法稱為接頭連接法。三、論述題1、什么是基因組文庫(genomic library)?構(gòu)建基因組文庫，涉及哪些基本過程？它同遺傳學(xué)上的基因庫有什么不同？答:基因組文庫是用基因工程的方法，人工構(gòu)建的含有某一生物基因組DNA勺各種片段的克隆群。一般以改造的噬菌體 DNAE黏粒作為載體，包括下列過程:(1) 高分子量染色體DNA勺制備;(2)體外重組連接;(3)包裝蛋白的制備;(4)重組體的體 外包裝;(5)將重組DNA1人寄主細(xì)胞;(6)篩選。基因組文庫同遺傳學(xué)上所講的基因 庫是完全不同的概念。基因庫(gene

12、pool)是指在進(jìn)行有性生殖的某一群體中，能 進(jìn)行生殖的個(gè)體所含總的遺傳信息。在基因組文庫的構(gòu)建中，由于使用的載體不 同，分為噬菌體載體和黏粒載體構(gòu)建的基因組文庫、YACC庫、BACC庫等。作業(yè)四:一、名詞解釋1、DNA組：是由于不同DNA的斷裂和連接而產(chǎn)生 DNAfr段的交換和重新組 合，形成新DNA子的過程。2、克?。嚎茖W(xué)家把人工遺傳操作動(dòng)物繁殖的過程叫克隆，這門生物技術(shù)叫克隆 技術(shù)，其本身的含義是無性繁殖，即由同一個(gè)祖先細(xì)胞分裂繁殖而形成的純細(xì)胞 系，該細(xì)胞系中每個(gè)細(xì)胞的基因彼此相同。3、DN燉?。簯?yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)一一同源或異源、原核或真核、天然或人工的DNAf

13、載體DNAlf結(jié)合成一具有自我復(fù)制能力的 DNA子一一復(fù)制子，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿 主細(xì)胞、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增、提取獲得大量同一DNA分子，即DNM隆。4、目的基因：把需要研究的基因稱為目的基因。(一般把需要分析的基因稱靶 基因，在基因克隆過程中有時(shí)兩者均稱為插入基因，有時(shí)三者含義相近。)5、基因載體：基因載體是把基因?qū)爰?xì)胞的工具，他的作用是 ？運(yùn)載目的基因 進(jìn)入宿主細(xì)胞，？使之能得到復(fù)制和進(jìn)行表達(dá)。6、質(zhì)粒：質(zhì)粒(plasmid)是細(xì)菌擬 核裸露DNA#的遺傳物質(zhì)，為雙股閉合環(huán)形的 DNA存在于細(xì)胞質(zhì)中，質(zhì)粒編碼非 細(xì)菌生命所必須的某些生物學(xué)性狀，如性菌毛、細(xì)菌素、

14、毒素和耐藥性等。質(zhì)粒具 有可自主復(fù)制、傳給子代、也可丟失及在細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移等特性，與細(xì)菌的遺傳變異 有關(guān)。二、簡答題1、常用的工具酶有哪些，其主要用途是什么，答：限制性內(nèi)切核酸 酶,DNA聚合酶和Klenow大片段,DNA連接酶，堿性磷酸酶，末端脫氧核甘酸轉(zhuǎn)移酶. 限制性內(nèi)切核酸酶，能夠識(shí)別特異的DNA1基序列，DNA堿基序列往往呈回文對(duì) 稱結(jié)構(gòu)；DNA聚合酶a位于細(xì)胞核內(nèi)，也許是復(fù)合物，有催化細(xì)胞增生的作用；Klenow大片段它也可以通過基因工程得到，分子量為 76kDa 。 DNA連接酶負(fù)責(zé)雙鏈DNA中相鄰3-OH與5-磷酸基團(tuán)之間的磷酸二酯鍵的形成。堿性磷酸酯酶的作用是從DN頌RNA勺三磷

15、酸核甘酸上除去5磷酸根殘基。 末端轉(zhuǎn)移酶的作用是 將脫氧核糖核甘酸通過磷酸二酯鍵加到 DNA子的3-OH末端。2、重組DNAg術(shù)常包括哪些基本步驟，答:？獲得目的基因；？與克隆載體連接，形成新的重組 DN6子；？用重組DNA 分子轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，并能在受體細(xì)胞中復(fù)制和遺傳 ；？對(duì)轉(zhuǎn)化子篩選和鑒定。在具 體工作中選擇哪條技術(shù)路線；？對(duì)獲得外源基因的細(xì)胞或生物體通過培養(yǎng)，獲得所 需的遺傳性狀或表達(dá)出所需要的產(chǎn)物。主要取決于基因的來源、基因本身的性質(zhì)和 該項(xiàng)遺傳工程的目的。3、常用的目的基因的獲取方法有哪些，答：直接獲取從基因文庫中提取目的基因，使用 PCRT增技術(shù)獲彳#目的基因； 人工合成.4、常用

16、的目的基因與載體的連接方法有哪些，答：外源DNAt段同載體分子連接的方法，即 DN6子體外重組技術(shù)，主要是依賴于核酸內(nèi)切限制酶和 DN啦接酶的作用(一般說來在選擇外源DNA 同載體分子連接反應(yīng)程序時(shí)，需要考慮到下列三個(gè)因素 ：(1)實(shí)驗(yàn)步驟要盡可能地 簡單易行；(2)連接形成的“接點(diǎn)”序列，應(yīng)能被一定的核酸內(nèi)切限制酶重新切割， 以便回收插入的外源DNAt段；(3)對(duì)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯過程中密碼結(jié)構(gòu)的閱讀不發(fā)生干 擾。5、解釋質(zhì)粒，為什么質(zhì)?？勺鳛榛蜉d體。答:質(zhì)粒是細(xì)菌擬核裸露DNA#的遺傳物質(zhì)。 質(zhì)粒:(1)具有較小的分子量。經(jīng) 驗(yàn)表明，為了避免在DNA勺純化過程中發(fā)生鏈的斷裂，克隆載體的分子大小最

17、好不 要超過10Kb pBR322質(zhì)粒這種小分子量的特點(diǎn)，不僅易于自身 DNA勺純化，而且 可容納較大的外源DNAt段；(2)具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào)，能指示載體或重組DN吩子是否進(jìn)入宿主細(xì)胞以及外源 DN的子是否插入載體分子形成了重組子。三、論述題1、何謂限制性核酸內(nèi)切酶，寫出大多數(shù)限制性核酸內(nèi)切酶識(shí) DNA 序列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。答：限制性核酸內(nèi)切酶是一類能識(shí)別雙鏈 DN吩子中特異性核甘酸序列并由此 特異切割DN敬鏈結(jié)構(gòu)白水解酶.是在DNA子內(nèi)部切割，水解磷酸二酯鍵的核酸 內(nèi)切酶。能夠識(shí)別特異的DNA基序列，DNA堿基序列往往呈回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)；并具 有特異切割位點(diǎn)。作業(yè)五：一、

18、名詞解釋1、限制性核酸內(nèi)切酶：是由細(xì)菌產(chǎn)生的一類能特異識(shí)別雙鏈 DNA中的特定堿基 序列，并在識(shí)別位點(diǎn)切割磷酸二酯鍵的核酸內(nèi)切酶 (簡稱限制酶)。2、基因文庫：將所有的重組DN6子都導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，得到分子克隆的混合體，這樣一個(gè)混合體稱為基因文庫。3、cDNAt庫：從組織細(xì)胞中分離得到純化的mRNA然后以mRNM模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成其互補(bǔ) DNA再復(fù)制成雙鏈 cDNAt段，與適當(dāng)載體連接后導(dǎo)入受體菌內(nèi)，擴(kuò)增，構(gòu)建cDNAt庫。4、RFLP：RFLFW記是發(fā)展最早的DNAB記技術(shù)。RFLP是指基因型之間限制性片段長度 的差異，這種差異是由限制性酶切位點(diǎn)上堿基的插入、缺失、重排或點(diǎn)突變所引

19、起 的。5、核酸探針：是指與特定的靶分子發(fā)生特異性相互作用，并可被特殊的方法探 知的分子。抗體-抗原、生物素-抗生物素蛋白、生長因子-受體的相互作用都可以 看作是探針與靶分子的相互作用。6、轉(zhuǎn)錄：轉(zhuǎn)錄是遺傳信息由DNA專換到RNAW過程。作為蛋白質(zhì)生物合成的第一步，轉(zhuǎn)錄是 mRN以及非編碼RNA(tRNA rRNA等) 的合成步驟。二、簡答題：1、試回答影響限制性內(nèi)切核酸酶切割效率的因素，答：外因：是 可以預(yù)見的，如反應(yīng)條件（緩沖液、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、終止酶切的方法 ）、底物 的純度（是否有雜質(zhì)、是否有鹽酚的污染）、何時(shí)加酶、操作是否恰當(dāng)、反應(yīng)體積等等；內(nèi)因：星星活性、末端長度、 位點(diǎn)偏愛、

20、甲基化底物、底物的構(gòu)象。2、何為載體，一個(gè)理想的載體應(yīng)具備那些特點(diǎn)，答:將外源DNAE基因攜帶入宿主細(xì)胞（host cell） 的工具稱為載體 載體具備 的特點(diǎn)：?在宿主細(xì)胞內(nèi)必須能夠自主復(fù)制（具備復(fù)制原點(diǎn)）？必須具備合適的酶切位 點(diǎn)，供外源DNAt段插入，同時(shí)不影響其復(fù)制？有一定的選擇標(biāo)記，用于篩選 ？最 好具有較高的拷貝數(shù)，便于制備。3、什么叫基因工程（Gene Engineering）,試從理論和技術(shù)兩個(gè)方面談?wù)?Gene Engineering 誕生的基礎(chǔ),答:基因工程：在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物 質(zhì)的新組合，并使之參入到原來沒有這類分子的宿主細(xì)胞內(nèi)，而能

21、持續(xù)穩(wěn)定地繁 殖。理論基礎(chǔ)：近幾十年來，由于受到分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)發(fā)展的影響，基因 分子生物學(xué)的研究取得了前所未有的進(jìn)步。而這些學(xué)科的綜合成就，又為基因工程 的誕生奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)：？在40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的 分子載體是DNAW不是蛋白質(zhì)，從而明確了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問題；？在50年代揭 示了 DNA子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)理，解決了基因的自我復(fù)制和傳遞 的問題；？在50年代末期和60年代，相繼提出了 中心法則和操縱子學(xué)說，并成 功地破譯了遺傳密碼，從而闡明了遺傳信息的流向和表達(dá)問題。技術(shù)基礎(chǔ):?60年代-70年代，限制性核酸內(nèi)切酶和 DNA1接酶解決了對(duì)DN砌子進(jìn)行體外的切割和連接；？基因克隆載體的出現(xiàn)？大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立?60年代發(fā)展的 瓊脂糖凝膠電泳和Southern轉(zhuǎn)移雜交技術(shù)對(duì)DNAt段的分離和檢測(cè)十分有用4、抗性基因是目前使用的最廣泛的選擇標(biāo)記，常用的抗生素抗性有哪幾種 ，并 舉兩例說明其原理，答:氨葦青霉素抗性基因ampr、四環(huán)素抗性基因tetr、氯霉素抗性基因 Cmr、卡那霉素和新霉素抗性基因kanr ?氨葦青霉素抗性基因ampr:青霉素可