哺乳動物細胞表達系統(tǒng)

1、哺乳動物細胞表達系統(tǒng)按照宿主細胞的類型，可將基因表達系統(tǒng)大致分為原核、酵母、植物、昆蟲和哺乳動物細胞表達系統(tǒng)。與其它系統(tǒng)相比，哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的優(yōu)勢在于能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊，提供復(fù)雜的N型糖基化和準確的O型糖基化等多種翻譯后加工功能，因而表達產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然的高等生物蛋白質(zhì)分子。從最開始以裸露DNA直接轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞至今的30余年間，哺乳動物細胞表達系統(tǒng)不僅已成為多種基因工程藥物的生產(chǎn)平臺，在新基因的發(fā)現(xiàn)、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能研究中亦起了極為重要的作用。本文主要從表達系統(tǒng)及其兩個組成部分表達載體和宿主細胞等方面，簡要介紹哺乳動物細胞表達系統(tǒng)和相關(guān)的研

2、究進展。研究現(xiàn)狀部分蛋白在哺乳動物細胞中的表達已從實驗室研究邁向生產(chǎn)或中試生產(chǎn)階段。已有許多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳動物細胞系統(tǒng)表達和大量制備、生產(chǎn)。如人組織型血纖蛋白酶原激活因子、凝血因子哪、干擾素、乙肝表面抗原、紅血球生成激素、人生長激素、人抗凝血素III,集落刺激因子等。有些產(chǎn)品已投入臨床應(yīng)用或試用。雖然經(jīng)過多年努力，哺乳動物細胞表達系統(tǒng)的表達水平有大幅度增高，但從整個水平上看仍偏低，一般處在雜交瘤細胞單克隆抗體蛋白產(chǎn)率的下限，即l-30ug/108細胞/24小時。有人認為其限速步驟可囂是在工程細胞中(對于重組蛋白來講，常是異源的)，重組蛋白的分泌效率較低。表達載體ll表達栽體的類型哺

3、乳動物細胞表達外源重組蛋白可利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和病毒載體的感染。利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細胞需幾周甚至幾個月時間，而利用病毒表達系統(tǒng)則可快速感染細胞，在幾天內(nèi)使外源基因整合到病毒載體中，尤其適用于從大量表達產(chǎn)物中檢測出目的蛋白。根據(jù)進入宿主細胞的方式，可將表達載體分為病毒載體與質(zhì)粒載體。病毒載體是以病毒顆粒的方式，通過病毒包膜蛋白與宿主細胞膜的相互作用使外源基因進入到細胞內(nèi)。常用的病毒載體有腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、semliki森林病毒(sFv)載體等。另外，桿狀病毒載體應(yīng)用于哺乳動物細胞的表達在近幾年頗受重視，這是因為它與其它病毒載體相比有特有優(yōu)勢，如可通過昆蟲細胞大量制備病毒顆粒；可感

4、染多種哺乳動物細胞，但在細胞內(nèi)無復(fù)制能力，生物安全度高；可插入高達38kb的外源基因等。質(zhì)粒載體則是借助于物理或化學(xué)的作用導(dǎo)人細胞內(nèi)。依據(jù)質(zhì)粒在宿主細胞內(nèi)是否具有自我復(fù)制能力，可將質(zhì)粒載體分為整合型和附加體型載體兩類。整合型載體無復(fù)制能力，需整合于宿主細胞染色體內(nèi)方能穩(wěn)定存在，如SV40病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體和游離型如痘苗病毒、腺病毒載體。利用Sindbisvirus(SV)、ScmlikiForestvirus(sFV)和痘苗病毒載體感染哺乳動物細胞表達的蛋白在結(jié)構(gòu)與功能上與天然哺乳動物來源的蛋白更相似。Liljestrom等利用SFV病毒載體感染哺乳動物細胞獲得的外源蛋白占細胞總蛋白的；

5、而附加體型載體則是在細胞內(nèi)以染色體外可自我復(fù)制的附加體形式存在。整合型載體一般是隨機整合入染色體，其外源基因的表達受插入位點的影響，同時還可能會改變宿主細胞的生長特性。相比之下，附加體型載體不存在這方面的問題，但載體DNA在復(fù)制中容易發(fā)生突變或重排。附加體型載體在胞內(nèi)的復(fù)制需要兩種病毒成分：病毒DNA的復(fù)制起始點(ori)及復(fù)制相關(guān)蛋白。根據(jù)病毒成分的來源不同，附加體型表達載體主要分為4大類，表2對這幾類附加體載體進行了簡要的概括。載體的選擇取決于外源基因的導(dǎo)人方式和其調(diào)控元件是否有利于轉(zhuǎn)錄和翻譯。真核生物基因高表達載體必須具有如下調(diào)控元件：原核DNA序列，包括能在大腸桿菌中自身復(fù)制的復(fù)制子，

6、便于篩選含螢組細菌的抗生素抗性基躅，以及便于目的基因插入的限制性酶切位點。目前采州的哺乳動物細胞表達戟體大都帶有來自pBR322的衍生質(zhì)粒如pX3、pBRd和pM的原核序列；啟動子和增強子；剪接信號；終止信號和poIyA加尾信號。為了將含目的基因的載體導(dǎo)入哺乳動物功物細胞還必須加入遺傳選擇標記。常用的標記基因有胸腺激酶(tk)基因、二氫葉酸還原酶(dhr)基因、新霉素(neo)抗性基因、氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(cat)基因等dhfr還可作為共擴增基因使外源基因的表達產(chǎn)物增加。當(dāng)培養(yǎng)基中逐新增加氨甲蝶吟(MTX)的濃度時，隨著細胞對MTX抗體的增加。dhfr基因與外源基因均明顯擴增。據(jù)文獻報道，在不

7、斷提高的選擇壓力下，dhfr及側(cè)翼序列能擴增至上千個拷貝，大大增加目的基因的表達水平。12表達載體的結(jié)構(gòu)元件哺乳動物細胞表達載體的必要元件包括：一個高活性的啟動子、轉(zhuǎn)錄終止序列和一個有效的mRNA翻譯信號。可視實驗需要加入標志基因、復(fù)制起始點序列、內(nèi)部核糖體進入位點等?；趩幼釉鰪娮邮潜磉_載體中最重要的元件，我們這里僅對它做簡要介紹。外源基因在哺乳動物細胞中的表達與多種因素有關(guān)，主要是啟動子和增強子的強弱以及它們之間的搭配。啟動子需包含兩個識別序列：mRNA轉(zhuǎn)錄起始點和TATA盒。TATA盒位于轉(zhuǎn)錄起始值點上游25-30bp處，是引導(dǎo)RNA聚合酶在正確起始位點轉(zhuǎn)錄所必需的序列，即保證轉(zhuǎn)錄的精

8、確起始。其他上游啟動子元件常位于TATA盒上游100200bp之間。其功能是調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的起始頻率和提高轉(zhuǎn)錄效率。啟動于和增強子受細胞類型的限制，在不同的細胞系中有很大不同，因此需根據(jù)宿主細胞的婁型選擇不同的啟動子和增強子以便于目的基因的高效表達。目前常用的強啟動子包括人巨細胞病毒早期啟動子(CMV-IE)、人延伸因子1-亞基啟動子和Rous肉瘤長末端重復(fù)序列；Invitrogen公司開發(fā)的pcDNA、pEF和pRL三種系列載體即分別是以這三種啟動子驅(qū)動目的基因的表達。近年來又發(fā)現(xiàn)了一些新的強啟動子：如人leukosialin基因同和鼠3-磷酸甘油激酶l(PGKI)基因啟動子，活性與CMV-IE相

9、當(dāng)；人編在蛋白(ubiquitin)C基因啟動子不僅具有較高的活性，而且比CMV-IE、PGK1等啟動子有更廣泛的宿主細胞范圍，幾乎在轉(zhuǎn)基因小鼠的所有組織細胞中都具有較高活性。核內(nèi)小RNA(snRNA)啟動子亦具有與CMV-IE相近的活性，此前認為該啟動子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不具有正常mRNA的修飾過程和功能，雖然轉(zhuǎn)錄同樣是由RNA聚合酶II完成；但Bartlett等的研究顯示，UlsnRNA啟動子合成的lacZ基因RNA可被正確地在5端加帽和3端加polyA尾，并與核糖體結(jié)合引導(dǎo)Iacz蛋白的翻譯。常用的增強子有Rous肉癯病毒基因長末端重復(fù)序列和人巨細胞病毒增強子。james等利用糖皮質(zhì)類周醇誘導(dǎo)的

10、鼠乳房瘤病毒(MMTV)啟動子和鼠乳房痛病毒長末端重復(fù)序列(MMTV-LTR)，在CHO細胞中表達分泌的堿性磷酸酶，產(chǎn)量為利用常規(guī)的SV40和CMV啟動子的10倍，超過0.4mg/ml。構(gòu)建雜合的啟動子是獲得新啟動子的一個重要途徑，比如由人ubiquitinC啟動區(qū)序列與CMV增強子組成的雜合啟動子、由SV40早期啟動子和人I型T淋巴細胞病毒LTR中的增強子序列(R-U5片段)組成的SR-a啟動子的活性均與CMV-IE相當(dāng)；而由雞B-肌動蛋白啟動子和CMV增強子序列構(gòu)成的雜合啟動子不僅活性比CMVIE高，而且具有更為廣譜的宿主細胞范圍。Novagen公司的pBacMam表達系統(tǒng)即是以該雜合啟動

11、子驅(qū)動目的基因的轉(zhuǎn)錄。另一類雜合啟動子是由活性很低的啟動子與數(shù)個轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合位點串聯(lián)而成，這些位點與轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)合受細胞外小分子藥物的調(diào)控；這類啟動子主要用作基因的誘導(dǎo)表達。如Invitrogen公司的ecdysone誘導(dǎo)表達系統(tǒng)，其負責(zé)目的基因轉(zhuǎn)錄的啟動子是由熱休克蛋白啟動子核心序列(minimalpromotor)和5個E/GRE元件組成；Clontech公司開發(fā)的Tet-off系統(tǒng)中的啟動子則由CMV啟動子的核心序列和7個Tet阻遏蛋白結(jié)合位點組成。這些啟動子在誘導(dǎo)前后活性可相差4個數(shù)量級。另外，在哺乳動物細胞中已發(fā)現(xiàn)存在大量在低氧環(huán)境中可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的基因，如編碼紅細胞生成素(EP

12、O)轉(zhuǎn)鐵蛋白、血紅素加氧酶-1等的基因，它們都有一個共同的順式作用元件(CGTG)，有利于在5或3側(cè)翼區(qū)的低氧誘導(dǎo)低氧誘導(dǎo)作用因子-1(HIF-1)和低氧反應(yīng)增強子(HRE)結(jié)合，激活靶基因的轉(zhuǎn)錄，在低氧濃度下可使重組蛋白大量表達。據(jù)報道紅細胞生成素啟動子在1%氧濃度比在21%氧濃度下活陛增強100倍。這又是一種新的提高表達量的作用機制。宿主細胞哺乳動物細胞表達外源蛋白最初是將抗體基因重新導(dǎo)人淋巴細胞中由病毒(如SV40)或lgG的啟動子增強子引導(dǎo)。產(chǎn)生的抗體具有相應(yīng)的結(jié)合能力和數(shù)應(yīng)功能，但表達量很低。常用的非淋巴細胞類有中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、小倉鼠腎(BHK)細胞、COS細胞、小鼠NS

13、O胸腺瘤細胞和小鼠骨髓瘤SP2/0細胞等。不同宿主細胞表達的重組蛋白其穩(wěn)定性和蛋白糖基化類型不同，需根據(jù)要表達的目的蛋白選擇最佳的宿主細胞。COS細胞是進行外源基因瞬時表達時用途最廣的宿主，其重組載件易于組建，便于使用，而且對插入DNA的量或者采用基因組DNA序列的情況都沒有什么限制，便于通過檢測表達情況來確證cDNA的陽性克隆，也利于快速分析引入克隆化cDNA序列中的突變。CHO細胞則利于外源基目的穩(wěn)定整合，易于大規(guī)模培養(yǎng)，能在無血清和蛋白的條件下生比，是用于真核生物基因表達軟為成功的宿主細胞。已用于多種復(fù)雜的重組蛋白的生產(chǎn)，但其產(chǎn)量較低，一般僅占細胞蛋白的2.5%，而用細菌表達可獲得占總蛋

14、白50%的蛋白表達水平，但大腸桿菌表達的動物蛋白能進行正確的翻譯后加工如糖基化和三維結(jié)構(gòu)的形成，不具有與天然抗體相似的功能活性，且在人體內(nèi)易于清除。如果需要表達具有生物學(xué)功能的膜蛋白或分泌型蛋白，例如細胞表面的受體或細胞外的激素和酶，則不能在原棱細胞中表達。而哺乳動物細胞表達的蛋白則具有天然蛋白的生物學(xué)活性。為提高哺乳動物細胞的蛋白表達量，需選擇合適的表達載體和有效的啟動子和增強子。近幾年也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了幾種新的有較大應(yīng)用價值的細胞株：如來源于MadIin-Darby犬腎的高分化內(nèi)皮細胞株(MDCK)，Pei等用該細胞株表達分泌型的基質(zhì)金屬蛋白酶MMPI3，發(fā)現(xiàn)高表達的陽性細胞克隆可占轉(zhuǎn)染細胞的5

15、%lO%，其中一個克隆的表達量可占細胞上清總蛋白的15%20%，在細胞單層貼壁培養(yǎng)情況下表達量達10ms/L。作者認為如此高的表達量可能與MDCK細胞的特性有關(guān)，因為同樣的載體在CH0細胞中僅得到低水平的表達。在球蛋白基因簇上游50kb處發(fā)現(xiàn)有一區(qū)域在紅細胞系的細胞中起調(diào)控基因表達的作用，稱為位點控制區(qū)域(LCR),LCR可調(diào)整附近區(qū)域染色體的結(jié)構(gòu)并增強球蛋白的轉(zhuǎn)錄活性。一些外源基因如thy-1和TK基因與LCR相連后均可在紅系細胞中高表達，而且表達水平與載體的插入位點無關(guān)，這一特性使得紅系細胞頗受關(guān)注。MELE9是目前常用于重組蛋白表達的紅系細胞株，它來源于感染了SSF病毒(spleenfo

16、cusformingvirus)的N小鼠的脾細胞。對現(xiàn)有細胞株選擇性地進行遺傳改造是提高重組蛋白表達水平的重要手段。BHK/vl6細胞株是穩(wěn)定表達單純皰疹病毒(HSV)VPI6蛋白的BHK細胞，由于VPI6的轉(zhuǎn)錄激活作用，載體中的HSV早期啟動子在該工程細胞中有很高的活性；已用該細胞株獲得了包括人組織纖溶酶原激活劑、生長因子等在內(nèi)的多種蛋白的高效穩(wěn)定表達?；谙俨《綞IA蛋白可反式激活CMV啟動子，Cockett等建立了穩(wěn)定表達EIA的CHO細胞株，在該細胞中重組前膠原酶的產(chǎn)量與CHO細胞相比增加了12倍；該細胞在多種抗體的表達中亦取得滿意的結(jié)果。對細胞其它特性的遺傳改造，包括細胞生長周期的調(diào)

17、控、細胞的抗凋亡能力、細胞貼壁能力、蛋白糖基化的模式及細胞乳酸的合成等方面，亦有相關(guān)報道，其實際應(yīng)用價值有待得到更多實驗數(shù)據(jù)的支持。表達系統(tǒng)根據(jù)目的蛋白表達的時空差異，可將表達系統(tǒng)分為瞬時、穩(wěn)定和誘導(dǎo)表達系統(tǒng)。瞬時表達系統(tǒng)是指宿主細胞在導(dǎo)入表達載體后不經(jīng)選擇培養(yǎng)，載體DNA隨細胞分裂而逐漸丟失，目的蛋白的表達時限短暫；瞬時表達系統(tǒng)的優(yōu)點是簡捷，實驗周期短。大規(guī)模的瞬時表達技術(shù)是近年來的一個研究熱點。已有報道能放大到100L反應(yīng)器中生產(chǎn)重組蛋白，產(chǎn)量（分泌型蛋白）可達110mg/L。不過該方法技術(shù)條件要求高，如質(zhì)粒的純度、轉(zhuǎn)染的效率等。穩(wěn)定表達系統(tǒng)是指載體進入宿主細胞并經(jīng)選擇培養(yǎng)，載體DNA穩(wěn)定

18、存在于細胞內(nèi)，目的蛋白的表達持久、穩(wěn)定。由于需抗性選擇甚至加壓擴增等步驟，穩(wěn)定表達相對耗時耗力。Geisse等以白血病抑制因子的制備為例，比較了幾種不同穩(wěn)定表達體系在產(chǎn)量及時間上的差異（表3），把目的基因定點整合入染色體高活性位點有望能在較短時間內(nèi)獲得高表達細胞株。如通過Cre或Flp重組酶的作用，將帶有相應(yīng)同源臂的目的基因替換出插入在高活性位點的報告基因。Koduri等甚至證實還可直接通過同源重組作用將目的基因插入至已知的高活性位點區(qū)（即體細胞打靶技術(shù)）。另外，近年來還報道了一些篩選高表達克隆的新方法，如影印法、固相篩選技術(shù)等，對縮短實驗時間甚有幫助。誘導(dǎo)表達系統(tǒng)是指目的基因的轉(zhuǎn)錄受外源小分

19、子誘導(dǎo)后才得以開放。早期實驗常使用糖皮質(zhì)激素、重金屬離子等誘導(dǎo)體系來調(diào)控基因表達，但存在特異性低和毒性高等諸多缺點；近幾年以突變的或非哺乳動物細胞來源的調(diào)控蛋白為平臺建立了一些新的誘導(dǎo)表達系統(tǒng)（表4），在這些系統(tǒng)中外源基因的表達本底低，誘導(dǎo)倍增效應(yīng)高，藥物誘導(dǎo)后目的基因的表達可提高數(shù)萬倍。而且，參與誘導(dǎo)調(diào)控的因子與細胞內(nèi)源性的因子間無相互作用，因此一方面目的基因的表達本身不受細胞內(nèi)環(huán)境改變的影響，另一方面誘導(dǎo)藥物對內(nèi)源基因的表達無作用，因而具有很好的嚴謹性和特異性。當(dāng)然，這些系統(tǒng)也存在有待改進的問題，如ecdysone系統(tǒng)的誘導(dǎo)倍增效應(yīng)偏低，Tet-On或Tet-0FF系統(tǒng)中的調(diào)控蛋白VP16

20、有一定的細胞毒性，誘導(dǎo)藥物四環(huán)素還可能影響某些細胞的生長、分裂期。表達系統(tǒng)的選擇對于一個表達實驗，選擇何種表達系統(tǒng)應(yīng)根據(jù)實際需要來決定，如表達蛋白的需求量、用途、實驗所需時間及對細胞的毒性。選定表達系統(tǒng)之后，還需考慮表達載體與宿主細胞的合理搭配問題：比如若以BHl/VP16為宿主細胞，則表達載體最好選用HSV早期啟動子驅(qū)動目的基因的表達，因為該啟動子受VP16的轉(zhuǎn)錄激活；LCR元件只有在紅系細胞中才有消除整合位點的位置效應(yīng)的功能，因此如果要發(fā)揮載體中LCR的功能，則可考慮選擇IVlEL-E9細胞；在肝細胞中CMV啟動子活性低，此時可考慮選用其它的啟動子；使用附加體型表達載體時，應(yīng)選擇其對應(yīng)的復(fù)

21、制允許細胞，等等。哺乳動物細胞表達系統(tǒng)中，重組蛋白的表達水平與許多因素相關(guān)，如轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控元件、RNA剪接過程、mRNA穩(wěn)定性、基因在染色體上的整合位點、重組蛋白對細胞的毒性作用以及宿主細胞的遺傳特性等；而且某些理論上可信的設(shè)計在實驗中不一定可行，比如含LCr的載體在MEI，E9細胞中有時并不能消除整合位點的位置效應(yīng)嗍，外源基因在染色體高活性位點的定點整合也不一定能獲得高表達御，等等。因此如果需獲得一個基因的高表達。最好多試用幾種不同的載體及宿主細胞。提高蛋白表達產(chǎn)量的措施哺乳動物細胞對培養(yǎng)環(huán)境十分敏感，營養(yǎng)和生長因子缺乏、缺氧、病毒感染、毒性代謝物的積累、機械攪動以及培養(yǎng)壓力的增加等很多固

22、素都可誘導(dǎo)細胞凋亡。大量細胞的死亡嚴重影響蛋白的表達產(chǎn)量?，F(xiàn)已證實，有些基因能抑制細胞凋亡，如Bcl-12和BcI-x能抑制許多因素誘發(fā)的細胞凋亡，以及某腫瘤細胞從貼壁培養(yǎng)轉(zhuǎn)入懸浮培養(yǎng)而誘發(fā)的細膽凋亡。Alison等報道，感染dSsVCAT病毒載體的BHKBcl-12和CHOBcI-x細胞生存期均延長數(shù)倍。BHKBel2、HHKBcI-x均使感染SFVII1!的細胞恢復(fù)生長到對數(shù)生長期的細胞感染后可存活達9d，LL12的產(chǎn)量提高一倍。有些化學(xué)制劑也能抑制不同階段的細胞凋亡，如乙酰半胱氨酸t(yī)NAC、吡咯烷二硫氨基甲酸酯（PDTC）等以及caspase抑制劑Z-VADfmk、YVAD，cmk等，從

23、而大大增加表達蛋白的產(chǎn)量。如利用NAC和z-VADfmk的細胞培養(yǎng)，表達蛋白的產(chǎn)量分別提高2.2和3.9倍。細胞凋亡的抑制不僅延長細胞的存活期，提高蛋白的產(chǎn)量，而且有利于下游的純化過程。在細胞大規(guī)模培育過程，細胞的持續(xù)大量增殖使蛋白表達很快進入衰退期。同時由于營養(yǎng)缺乏，細胞大量死亡使細胞產(chǎn)品的產(chǎn)量下降，死亡的細胞釋放蛋白酶和糖苷酶使表達產(chǎn)物降解，產(chǎn)品質(zhì)量下降。為獲得產(chǎn)物的大量有效表達，必須控制細胞在達到最適表達產(chǎn)物期停止增殖。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)四環(huán)素抑制表達系統(tǒng)（Tctoff）可嚴格控制細胞增殖過程。外源基因和抑制細胞生長的基因（如P27）在同一個雙順反子表逸單位，在可稠節(jié)的啟動子（Totoff）作用下

24、使細胞增殖期與增殖抑制產(chǎn)物表達期分開。細胞生長和產(chǎn)物表達都能達到最大程度。Totoff基因表達系統(tǒng)的優(yōu)點在于毒性低，作用快，不影響哺乳動物細胞的代謝過程。由于四環(huán)素很不穩(wěn)定，易于氧化脫水、芳香基化和表易構(gòu)化作用，使Tot基因表達系統(tǒng)成為一個高效、無毒、具有嚴密開關(guān)功能（Trtswitch）的可誘導(dǎo)性基因表達系統(tǒng)，僅受四環(huán)素初濃度的影響，終產(chǎn)物中四環(huán)素自發(fā)降解，有利于下游的純化過程。這種Tel基因表達系統(tǒng)控制的蛋白表達方式，因使細胞生長期和產(chǎn)物袁達期分開而適用于生產(chǎn)使細胞具有代謝負擔(dān)或毒性的蛋白產(chǎn)物。mazur等報道利用該系統(tǒng)，在作用于細胞周期的激酶抑制子p27誘導(dǎo)下，使CHO細胞成功地達到持續(xù)

25、生長抑制期，表達分泌型堿性磷酸酶SEAP（種典型的外源糖蛋白）水平提高1015倍。在孵育批量培養(yǎng)中，通過減少葡萄糖和谷胱甘肽的量，使細胞代謝發(fā)生改變，以減少代謝產(chǎn)物乳酸、胺的形成，使細胞培養(yǎng)達到一種穩(wěn)定狀態(tài)，細胞濃度和蛋白產(chǎn)物大大增加。目前的生物工程要求使用第三代無血清培養(yǎng)基，即無血清無蛋白（或含量極低）的雙無培養(yǎng)基，使細胞培養(yǎng)很容易做到恒定，細胞分泌的的蛋白更易分離純化，培養(yǎng)基的成本大為下降。隨著基工程技術(shù)研究的深人，利用哺乳動物細胞表達蛋白產(chǎn)物的有效方式必將得到進一步發(fā)展，其在工業(yè)生產(chǎn)中的開發(fā)應(yīng)用必將促進基因工程藥物的大量生產(chǎn)。發(fā)展趨勢在目前和今后若干年內(nèi)（至少到本世紀末），以下兩種系統(tǒng)沒有根本解決之前，哺乳動物細胞作為一種日趨成熟的表達系統(tǒng)，仍然會受到研究人員和產(chǎn)業(yè)家的重視，并將成為基因工程研究中十分活躍的領(lǐng)域，眾多的產(chǎn)物必須