農(nóng)藥對桑樹葉斑病的防治畢業(yè)論文

1、PAGE PAGE 21科類 農(nóng)學(xué) 編號（學(xué)號） 20080463 本科生畢業(yè)論文云南桑樹病菌初步鑒定及其對咪酰胺的敏感性測定The Identification of Mulberry Fungus and The Sensitivity of Prochloraz in Yunnan 陳文智指導(dǎo)教師： 杜飛 職稱 講師 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 昆明 黑龍?zhí)?650201 學(xué) 院： 園林園藝學(xué)院 專 業(yè)： 蠶學(xué) 年級： 2008級 論文（設(shè)計）提交日期： 2012年5月 答辯日期： 2012年6月 答辯委員會主任： 李文祥 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)2010年 5 月云南桑樹病菌初步鑒定及其對咪酰胺的敏感性測定陳文

2、智（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院,昆明650201）摘 要 云南桑樹病害的發(fā)生逐年嚴(yán)重，嚴(yán)重阻礙了蠶桑產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。本文以8株從云南主要桑樹產(chǎn)區(qū)分離到的菌株為材料，采用菌落直徑法對咪酰胺EC50進(jìn)行測定。結(jié)果表明，咪酰胺對所分離的8個菌株中的三個菌株抑制率高：細(xì)極鏈格孢（3號）、甘藍(lán)長尾交鏈孢霉（4號）和禾赤霉菌（5號）的EC500.1，桑牙枯菌（6號）的0.1EC500.5，蔓枯病菌（7號）0.5EC500.1，細(xì)極鏈格孢（8號）的1EC502，桑干枯病（2號）和天竺葵鏈格孢(9號)的EC5017。說明咪酰胺對桑樹病菌的抑制作用顯著，可有效防治桑樹真菌病害。關(guān)鍵詞：咪酰胺；桑樹病害；EC50

3、；敏感性；抑制率。The Identification of Mulberry Fungus and The Sensitivity of Prochloraz in Yunnan Chen wen zhi(Yunnan agriculture university landscape gardening college)ABSTRACT Mulberry (Morus alba L.) was always infected by many fungus, which had embarrassed the sustainable development of sericicultural

4、industry severely. In this paper, there were 8 isolates from the main mulberry growing areas in Yunnan for prochloraz was tested using colony diameter measurement. The EC50 were also determined. There were 3 isolates with higher inhibition rare. EC50 for Alternaria tenuissima (NO.3), Alternaria bras

5、sicae (NO.4) and Gibberella zeae (NO.5) lower than 0.1, while Fusarium cerealis (NO.6) from 0.1 to 0.5, Didymella bryoniae (NO.7) from 0.5 to 1, Alternaria tenuissima (NO.8) from 1 to 2 ，Phomopsis sp (No.2) and Alternaria porri (No.9) higher than 17. The results showed that prochloraz could inhibit

6、mulberry diseases.Key word: microphones amide; mulberry disease; EC50; sensitivity; inhibition rate云南桑樹病菌初步鑒定及其對咪酰胺的敏感性測定1 前言1.1 桑樹基本情況我國是世界上種桑養(yǎng)蠶最早的國家，也是中華民族對人類文明的偉大貢獻(xiàn)之一。桑樹的栽培已有七千多年的歷史。在商代，甲骨文中已出現(xiàn)桑、蠶、絲、帛等字形。到了周代，采桑養(yǎng)蠶已是常見農(nóng)活。春秋戰(zhàn)國時期，桑樹已成片栽植。我國收集保存的桑樹種質(zhì)分屬15個桑種3個變種，是世界上桑種最多的國家。其中栽培種有魯桑、白桑、廣東桑、瑞穗桑；野生桑種有長穗

7、桑、長果桑、黑桑、華桑、細(xì)齒桑、蒙桑、山桑、川桑、唐鬼桑、滇桑、雞桑；變種有鬼桑(蒙桑的變種)、大葉桑(白桑的變種)、垂枝桑(白桑的變種)1。原產(chǎn)我國中部，有約四千年的栽培史，栽培范圍廣泛，東北自哈爾濱以南；西北從內(nèi)蒙古南部至新疆、青海、甘肅、陜西；南至廣東、廣西，東至臺灣；西至四川、云南；以長江中下游各地栽培最多。垂直分布大都在海拔1200m以下。1.2 云南省桑樹主要病害桑樹的病害很多，按危害桑樹的部位可分為全株性病害、桑葉病害、枝干病害和根部病害。云南省危害較多有以下幾種。1.2.1 桑萎縮病 病原：由病毒引起。 癥狀：萎縮病有花葉型、黃化型和萎縮型三種。桑樹發(fā)病，葉片縮小，葉色轉(zhuǎn)黃，病

8、葉變成圓形或半圓形。枝葉叢生矮化、細(xì)小，側(cè)枝簇生成團(tuán)，病枝無花椹。黃化型葉緣向葉背卷曲；花葉型葉緣略向葉面卷縮；萎縮型皺縮，但葉不卷曲。葉肉部分斑塊狀 褪綠，形成黃綠相間的花葉，葉脈有小瘤狀突起2。1.2.2 桑白粉病病原：為球針殼屬的真菌。它利用附著器附著在葉子表皮上，部分組織能從氣孔進(jìn)入葉肉組織的細(xì)胞間隙，產(chǎn)生吸收器，攝取營養(yǎng)。癥狀：本病多發(fā)生于枝條中下部的葉片。病葉背面產(chǎn)生白粉狀圓形霉斑，后期病斑顏色由黃變黑，連成一片，最后出現(xiàn)小黑點。桑白粉病多發(fā)生在秋季濕潤的環(huán)境中，病菌發(fā)芽適應(yīng)的溫度為23，桑葉硬化早的品種更易發(fā)生。嚴(yán)重時布滿葉背面3。1.2.3 桑褐斑病 病原：病原菌屬黑盤孢科粘隔

9、孢屬，初生于葉表皮下，形成分生孢子盤，分生孢子盤成熟后突破葉表皮。一般在未腐爛的病葉上越冬。 癥狀：初期為褐色病斑，水漬狀，呈芝麻大小的斑點，后逐漸擴(kuò)大成近圓形或三角形。病斑周圍綠色減退變黃，同一病斑在正背面葉面均有，遇到陰濕連綿的天氣，吸收膨脹，有爛葉情況4。嚴(yán)重時，病斑相互連接，葉片枯黃易脫落。1.2.4 桑赤銹病 病原：為銹孢屬的真菌。往往在病組織皮下形成菌絲體團(tuán)塊，以后發(fā)育成球形的銹子器，隆起泡泡紗狀。由淡黃轉(zhuǎn)深，逐漸成熟，最后突破寄生表皮，露出皮面。 癥狀：本病在溫度13-18，濕度80%以上易發(fā)生，高干桑較多，發(fā)病后桑葉局部變得臃腫，彎曲表現(xiàn)為畸形，葉面出現(xiàn)橙黃色的病斑，病斑上密布

10、桔紅色的孢子，孢子隨風(fēng)雨傳播，引起再次侵染1。1.2.5 桑干枯病病原：野村間座殼菌，球殼目，間座殼科，間座殼屬，其無性世代是擬莖點屬(Phomopsis sp)。癥狀：35月桑樹發(fā)芽前后，距地面4050cm以下枝于上出現(xiàn)橢圓形至不規(guī)則形淺黃色病斑，后成赤褐色，病斑擴(kuò)展環(huán)繞枝干一周后，病部以上枝條枯死。56月份病健組織交界處稍凹陷，橙黃色，上生鯊魚皮狀小疹，6、7月后小疹外皮破裂，露出黑點2。1.2.6 桑紫紋羽病 病原：為卷擔(dān)子綱的真菌，菌絲體寄生在細(xì)胞間或緊貼在根部細(xì)胞外面，靠滲透壓的不同，吸取養(yǎng)分，真菌適應(yīng)條件范圍廣，很易生長。 癥狀：發(fā)病后根部失去光澤，根外包一層紫色的細(xì)絲狀菌絲，在靠

11、近地面的根上有紫紅色的菌絲膜，嚴(yán)重時變成黑褐色而腐爛，僅剩下木質(zhì)部，病株很容易拔起。栓部不腐爛象管套一樣留在土中，地上部分生長緩慢，枝葉細(xì)小，葉色變黃，下部葉片脫落，枝梢停止生長，芽葉枯萎，最后整株枯死。苗圃發(fā)病嚴(yán)重時，短期內(nèi)成片死亡5。1.3 咪酰胺防治作物病害的基本原理咪酰胺是一種廣譜性殺菌劑，其系抑制麥角甾醇生物合成，具有保護(hù)和鏟除作用，對多種作物子囊菌和半知菌病害有顯著防效。可用于防治禾谷類作物莖、葉、穗上的許多病害，如白粉病、葉斑病，葉面噴灑為0.31.0 kg/hm。咪酰胺可用于果樹、蔬菜、蘑菇、草皮和觀賞植物的許多病原菌，可與多種殺菌劑、殺蟲劑、除草劑混配6。1.4 咪酰胺對其他

12、作物病害的防治情況20咪酰胺三環(huán)唑可濕性粉劑對水稻穗瘟病具有較好的防效，且對水稻生長安全，具有一定的增產(chǎn)作用7。以20戊唑醇井岡霉素咪酰胺750g/h m2 處理增產(chǎn)效果最顯著，達(dá)到91，其增產(chǎn)作用主要通過增加稻谷結(jié)實率來實現(xiàn)8。防治器苗病的關(guān)鍵措施是搞好水稻種子藥劑處理，咪酰胺對早稻惡苗病具有很好的防治效果。溫度在10l8 ，咪酰胺用量為60 mlhm ，浸種72 h，不淘洗直接播種，防效達(dá)9889。咪酰胺不同用藥量處理對水稻出芽進(jìn)度和芽率都有一定的影響，咪酰胺浸種后淘洗與否，對種子出芽進(jìn)度影響較大而對總體芽率影響小10。咪酰胺不同用藥量對水稻最終成穗率、每穗實粒數(shù)、千粒重和水稻產(chǎn)量都有一定

13、的影響。隨著用藥量的增加和浸種時間的加長，成穗數(shù)呈減少趨勢。綜合考慮咪酰胺不同用藥量的防病和增產(chǎn)效果，經(jīng)濟(jì)有效地使用咪酰胺以60mlhm 浸種72 h，不淘洗處理增產(chǎn)效果最好，咪酰胺的用藥量過高反而導(dǎo)致水稻減產(chǎn)，降低經(jīng)濟(jì)效益11。目前云南省的桑樹病害的控制多用藥劑，但是沒有用到咪酰胺，而咪酰胺對其他作物的病害防治效果顯著，因此我做這方面的實驗，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)證明咪酰胺是否對桑樹病害有防治效果。1.5 目的意義咪酰胺是目前新興的一種農(nóng)藥6，把其應(yīng)用在桑樹病害上，觀察其是否對桑樹病害有防治效果，以期為云南省桑樹病害的防治提供理論依據(jù)。1.6 試驗流程 技術(shù)路線圖5%NaClo處理植物保護(hù)學(xué)院何永紅老

14、師提供編號為SHB的病原菌病原菌分離病原菌活化曲靖、保山采集新鮮帶病桑葉 病原菌純化 單孢分離 鑒定形態(tài)鑒定分子鑒定 農(nóng)藥測定常溫培養(yǎng)35天常溫培養(yǎng)35天顯微鏡下 2 材料與方法2.1 實驗儀器 培養(yǎng)皿、500ml錐形瓶、200ml錐形瓶、酒精燈、接種針、打孔器、電子天平、培養(yǎng)箱、顯微鏡、PCR儀、搖菌箱、烘菌箱、超凈工作臺。藥品：滅菌水、咪酰胺。2.2 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯220g；瓊脂粉22g；葡萄糖22g；蒸餾水定容至1L。2.3 病樣保山、曲靖桑樹上采摘下病葉2.4 病菌分離與培養(yǎng)2.4.1 病菌分離病葉置于超凈工作臺分離。取病部和沒病部交界處組織，5%次氯酸鈉溶液消毒3分

15、鐘，無菌水沖洗3次后置于PDA平板上，常溫暗培養(yǎng)三到五天。2.4.2 病菌純化挑取單菌落置于PDA平板上，常溫暗培養(yǎng)五天。2.4.3 單孢分離病菌純化后培養(yǎng)5-7天使其長出分生孢子；把顯微鏡置于超凈工作臺上，打開紫外燈滅菌30分鐘左右；把槍頭放在PDA平板的菌絲上掛一下，使其附著菌株的孢子；把帶有孢子的槍頭放到裝有蒸餾水的小試管中稀釋；取稀釋好的孢子溶液滴1滴到載玻片的水瓊脂上，把小液滴碾開放到顯微鏡載物臺上；調(diào)好焦距左右移動載玻片找到菌株的孢子；若在水瓊脂的小片區(qū)域內(nèi)只有一個孢子，小心切下水瓊脂放到PDA平板上培養(yǎng)。2.4.4 病菌活化 桑樹病原菌的活化，按照以下步驟進(jìn)行：培養(yǎng)皿準(zhǔn)備：將培養(yǎng)

16、皿滅菌備用；培養(yǎng)皿平板制備：往熔化而冷至45左右的馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA）中加入一定量的青霉素，充分搖動混勻后，倒入滅菌后的培養(yǎng)皿中，靜止冷卻；用無菌操作法將保存的桑樹病菌移至PDA平板上，放入25恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)5日，備用。2.5 病菌鑒定2.5.1 形態(tài)鑒定 將待測菌株分別接種于PDA培養(yǎng)基上，25黑暗條件培養(yǎng)7天后觀察菌落性狀。菌落顏色參照Raynor的方法進(jìn)行劃分。菌株產(chǎn)孢后用無菌水將孢子洗脫并配制成孢子懸浮液，于顯微鏡下隨機(jī)挑選20個孢子測量孢子的長、寬、孢子和中間色孢的顏色、頂部附屬絲和基部附屬絲的多少及長度等指標(biāo)。然后參照真菌志進(jìn)行鑒定。2.6 分子鑒定2.6.1 搖菌 搖菌按一下

17、步驟進(jìn)行：做液體培養(yǎng)基，在200ml的錐形瓶中裝入1/3的液體培養(yǎng)基，放到高壓滅菌鍋中滅菌備用；把單胞分離培養(yǎng)后的菌株在超凈工作臺中接種到錐形瓶中；把錐形瓶放到搖菌箱中固定好，在常溫條件下，設(shè)置好搖菌箱進(jìn)行搖菌。5到7天后取出錐形瓶。2.6.2 烘菌把搖好的菌株從錐形瓶中倒入培養(yǎng)皿取出接種時的固體培養(yǎng)基，把菌落中的水吸干，放到培養(yǎng)皿中在烘菌箱中把菌絲烘干，用濾紙包好備用。2.6.3 制備DNA在液氮中把烘干的菌絲磨碎，把磨碎的菌絲放入小試管溶液中，放到離心機(jī)中離心。離心完以后提取含有DNA的上清液。把含有DNA的上清液放入小試管中并放到-4的冰箱中保存?zhèn)溆谩?.6.4 PCR測定把配置好的DN

18、A上清液放到明膠上在電泳槽中跑膠，把跑好的膠放到PCR儀中觀察菌株的DNA含量。2.7 農(nóng)藥測定2.7.1 供試殺菌劑咪酰胺，濃度設(shè)置：10ug/ml,30ug/ml,50ug/ml,100ug/ml,150ug/ml2.7.2 殺菌劑的配制 配制5103ug/ml母液：用電子天平各稱取0.05g的咪酰胺殺菌劑，然后各加入10ml的丙酮溶解，即配成的藥劑母液；配制103ug/ml母液：取上述母液1ml，加入4ml丙酮溶解，即配成103ug/ml的藥劑母液； 配制咪酰胺不同濃度濃度的稀釋液：（終體積5ml,因需500mlPDA，溶劑中PDA含量1%）150ug/ml:取103ug/ml的溶液75

19、0ul,加入4250ml丙酮；100ug/ml:取103ug/ml的溶液500ul,加入4500ul丙酮；50ug/ml:取103ug/ml的溶液250ul,加入4750ul丙酮；30ug/ml取103ug/ml的溶液150ul,加入4850ul丙酮10ug/ml取103ug/ml的溶液50ul,加入4950ul丙酮。將（3）中各濃度溶液5ml加入到500mlPDA中，制得濃度分別為1.5ug/ml,1.0ug/ml,0.5ug/ml,0.3ug/ml,0.1ug/ml的PDA平板（3次重復(fù)的量）。對照PDA平板制備：取5ml丙酮加入到500mlPDA中 (3次重復(fù)的量)。桑樹病菌接種：將培養(yǎng)

20、5天后的桑樹病菌在無菌條件下用滅菌后的5mm打孔器在菌落邊緣切下菌餅，用接種針將菌餅接種于上述各含藥劑的和對照的培養(yǎng)皿中央，菌絲朝下。每皿接4個菌，每個菌重復(fù)三次。培養(yǎng)菌株：將所有培養(yǎng)皿放入25恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4天后，用十字交叉法測量菌落直徑，取平均值。依據(jù)下式計算不同濃度藥劑對桑樹病菌的菌絲生長抑制率：抑制率（）=對照菌落增長直徑（mm）處理菌落增長直徑（mm）100對照菌落增長直徑（mm）（菌落增長直徑=菌落直徑-菌餅直徑）根據(jù)“反應(yīng)率-幾率值”轉(zhuǎn)換表將抑制生長率轉(zhuǎn)換成抑制率幾率值。然后以殺菌劑濃度的對數(shù)值為橫軸 ，以抑制率幾率值為縱軸，做出LP-D線性方程式y(tǒng)=ax+b。由線性公式計

21、算各種藥劑對桑樹病菌各菌株的EC50(抑制中濃度)及相關(guān)系數(shù)r。3 結(jié)果與分析3.1 桑樹病菌的鑒定3.1.1 菌株分離2010年6月至10月間自云南曲靖、保山等桑樹種植區(qū)的葉子和枝條上采集病樣。所有菌株均采用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行分離，于25黑暗條件下培養(yǎng)，待產(chǎn)孢后挑取單孢進(jìn)行純化。菌種在PDA斜面上于4冰箱中保存。1號菌株從保山地區(qū)桑葉上采集得到，病斑為黑褐色大斑點狀。2、3、4、5、6、7、8、9號菌株采樣地為曲靖，2、3、4、5號菌株從桑樹葉片上分離得到，2、4、5號菌株病斑形狀為斑點狀，3號菌株病斑形狀為條狀，病斑顏色都為黑褐色，6、7號菌株從桑樹枝條上分離得到，病斑都為黑褐色斑點狀，8、

22、9號菌株從桑樹葉柄上分離得到，8號菌株病斑為條狀，9號菌株病斑為斑點狀，顏色都為黑褐色。表1 桑樹病菌采集地點、分離部位和病癥Table 1 mulberry germs collecting site, separate parts and disease菌株編號名稱采集地點分離部位病斑形狀病斑顏色1保2-2保山葉片斑點狀黑褐色2曲4-1-1曲靖枝條斑點狀黑褐色3曲6-2-1曲靖葉片條狀黑褐色4曲5-1-1曲靖葉片斑點狀黑褐色5曲5-1-2曲靖葉片斑點狀黑褐色6曲2-2-2曲靖葉片斑點狀黑褐色7曲2-1-2曲靖枝條斑點狀黑褐色8曲5-2-1曲靖葉片條狀黑褐色9曲3-1-1曲靖葉片斑點狀黑褐色

23、3.1.2 形態(tài)鑒定結(jié)果菌落形態(tài)觀察結(jié)果表明（表2，圖1），在PDA平板上培養(yǎng)1號菌株菌落正面為粉紅色，菌絲絲狀，背面粉紅色，孢子堆黑色較少，生長過程中產(chǎn)生紅色色素。2號菌株菌落正面白色，絲狀菌絲，背面白色，孢子堆黑色較多。3號菌株菌落正面米黃色，有同心輪紋，絮狀菌絲，背面枯黃色有同心輪紋，孢子堆黑色較多，生長過程中產(chǎn)生黃色色素。4號菌株菌落正面米白色，有同心輪紋，菌絲絲狀，背面白色，孢子堆黑色較多。5號菌株菌落正面白色，菌絲絲狀，背面枯黃色，有同心輪紋，孢子堆黑色較少。6號菌株菌落正面白色，有同心輪紋，菌絲絲狀，背面黑黃相間沒有同心輪紋，孢子堆黑色較多。7號菌株菌落正面黑白相間，有同心輪紋，

24、菌絲絮狀，背面黑黃相間，有同心輪紋，孢子堆黑色較多。8號菌株菌落黑白相間，有同心輪紋，絲狀，背面黑黃相間，孢子堆黑色較多。9號菌株菌落黑白相間，有同心輪紋，菌絲絲狀，背面黑黃相間，有同心輪紋，孢子堆黑色較多。表2 9種菌株在PDA平板上的形態(tài)特征Table 2 nine in the PDA plating strains the morphological characteristics編號名稱正面形態(tài)背面形態(tài)孢子堆1保2-2粉紅色 絲狀粉紅色黑色 較少 2曲4-1-1白色 絲狀白色黑色 豐富 3曲6-2-1米白色 有輪紋 絮狀桔黃色 有輪紋黑色 豐富4曲5-1-1米白色 有輪紋 絲狀白色黑

25、色 豐富5曲5-1-2白色 絲狀桔黃色 有輪紋黑色 較少6曲2-2-2白色 有輪紋 絲狀黑黃相間 有輪紋黑色 豐富7曲2-1-2黑白相間 有輪紋 絮狀黑黃相間 有輪紋黑色 豐富8曲5-2-1黑白相間 有輪紋 絲狀黑黃相間黑色 豐富9曲3-1-1黑白相間 有輪紋 絲狀黑黃相間 有輪紋黑色 豐富圖1 菌株在PDA平板上的形態(tài)A、菌株在PDA平板上的正面形態(tài) B、菌株在PDA平板上的背面形態(tài)Figure 1 straince on the PDA plating in formA. Strains on the PDA plating in positive form B. Strains on t

26、he back of the PDA plating form孢子形態(tài)觀察結(jié)果表明（表3，圖2），1號菌株孢子很小形狀為橢圓形，光滑，近無色，成堆時綠色，長在1.64um-2.30um之間，寬在0.84um-1.38um之間，初步鑒定為亞木霉（Trichoderma koningii）。2號菌株子囊殼扁球形生于分生孢子器的周圍，子囊孢子紡錘形或橢圓形，有1個隔膜，無性世代的分生孢子器扁球形，分生孢子紡錘形，長橢圓形或卵形，無色，9142.54um，初步鑒定為桑幹枯?。≒homopsis sp）。3、8、9號菌株桑樹病菌孢子形狀為棒狀，有尾和須。本體被隔膜隔開成4個黑褐色的細(xì)胞，本體長在11.8

27、3um-15.11um之間，須長在5.43um-9.84um之間，尾長在2.02um-4.93um之間，孢子寬在2.30um-3.63um之間，初步鑒定為擬盤多毛孢（Pestalotiopsis）。4號菌株分生孢子梗欖褐色，不常分枝，有隔膜07個，上部屈曲，有顯著孢子痕，1448613um；分生孢子單生或形成4個孢子的短鏈，長卵形或倒棍棒形，33147933um，有橫隔膜和縱隔膜，初步鑒定為甘藍(lán)長尾交鏈孢霉（Alternaria brassicae）。5號菌株子囊殼散生，壁深藍(lán)色或深紫色，子囊棍棒形，無側(cè)絲，子囊孢子梭形，無色，有3個隔膜，無性階段為禾谷鐮刀菌（Fusarium gramine

28、arum)，大型分生孢子聚集時呈淡紅色，鐮刀形或梭形，有性態(tài)為玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae (Schw.) Petch.), 屬于子囊菌亞門球殼菌目赤霉屬，多有3個隔膜，孢子長在9.55um-15.19um之間，寬在1.89um-2.69um之間，初步鑒定為禾赤霉菌（Gibberella zeae）。6號菌株子囊殼深藍(lán)色或深紫色，表面光滑，子囊棍棒形至圓筒形，子囊孢子長卵形、橢圓形或紡錘形，有隔膜3個，16254.56um，無性世代為桑牙枯鐮孢霉（Fusarium lateritium），初步鑒定為桑牙枯病（Fusarium cerealis）12。7號菌株屬子囊菌亞門真菌。無性

29、態(tài)瓜葉單隔孢菌（Ascocb cucumis Fautr et Roum），屬半知菌亞門真菌。分生孢子器埋生在寄主表皮下，球形至扁球形，褐色，大小95137.5微米；內(nèi)壁密生簡單的分生孢子梗，單孢無色，大小7.515.52.54微米，器孢子具兩型：一類是小型孢子，特豐富，橢圓形或卵形，單胞無色，大小5.310.52.85微米。另一類是大型孢子，橢圓形至長卵形，具1隔膜，個別23個隔膜，隔膜縊縮，大小7.5172.55.5微米。該菌在PDA平板上菌落初白色，擴(kuò)展后呈圓形，除邊緣白色外，內(nèi)絲暗黑色，氣生菌絲稠密發(fā)達(dá)，白色至灰白色，初步鑒定為蔓枯病菌（Didymella bryoniae）13。表3

30、 桑樹病菌孢子形態(tài)Table 3 mulberry germs spore form序號采樣地點孢子形狀孢子顏色孢子長（um）孢子寬（um）1保山孢子很小橢圓形近無色，成堆時綠色1.642.300.841.382曲靖紡錘形、長橢圓形或卵形無色長：9142.543曲靖棒狀中間4色胞同色，有尾和須。黑褐色身體長：11.8315.11須長：5.439.84尾長：2.024.932.303.634曲靖長卵形或倒棍棒形欖褐色孢子痕長：1448孢子長：33147孢子痕寬：613孢子寬：9335曲靖鐮刀形或梭性無色9.5515.191.892.696曲靖長卵形、橢圓形或紡錘形深藍(lán)色或深紫色16254.56表

31、3 桑樹病菌孢子形態(tài)Table 3 mulberry germs spore form7曲靖小型孢子橢圓形或卵形大型孢子橢圓形至長卵形無色小型孢子5.310.5大型孢子7.517小型孢子2.85大型孢子2.55.58曲靖棒狀中間4色胞同色，有尾和須。黑褐色身體長：11.8315.11須長：5.439.84尾長：2.024.932.303.639曲靖棒狀中間4色胞同色，有尾和須。黑褐色身體長：11.8315.11須長：5.439.84尾長：2.024.932.303.63圖2 桑樹病菌孢子形態(tài)A、3號菌株孢子形態(tài) B、1號菌株孢子形態(tài) C、5號菌株孢子形態(tài)Figure 2 mulberry ge

32、rms spore formA. No 3 was spore form B. No 1 was spore form C. No 5was spore form3.1.3 分子鑒定結(jié)果對上述9個菌株做ITS測序，其結(jié)果與GeneBank比對，結(jié)果顯示（表4）， 1號為亞木霉（Trichoderma koningii）在GeneBank上的編號為AF218790.1，相似度為99%。2號為桑幹枯菌（Phomopsis sp）在GeneBank上的編號為AB302247.1，相似度為99%。3號為細(xì)極鏈格孢（Alternaria tenuissima）在GeneBank上的編號為HM467832

33、.1，相似度為99%。4號為甘藍(lán)長尾交鏈孢霉（Alternaria brassicae）在GeneBank上的編號為JF439449.1，相似度為99%。5號為禾赤霉菌（Gibberella zeae）在GeneBank上的編號為HQ671191.1，相似度為99%。6號為桑牙枯菌（Fusarium cerealis）在GeneBank上的編號為GU584950.1，相似度為99%。7號為蔓枯病菌（Didymella bryoniae）14在GeneBank上的編號為EU167573.1，相似度為99%。8號為細(xì)極鏈格孢（Alternaria tenuissima）在GeneBank上的編號為

34、JQ417902.1，相似度為100%。9號為天竺葵鏈格孢（Alternaria porri）在GeneBank上的編號為JF422727.1，相似度為99%。表4 分離菌株在GeneBank比對結(jié)果Table 4 in separate strains GeneBank than the results序號菌種AccessionMax identDescriptionGenebank比對結(jié)果1保2-2AF218790.199%Trichoderma koningii亞木霉2曲4-1-1AB302247.199%Phomopsis sp桑干枯菌3曲6-2-1HM467832.199%Alter

35、naria tenuissima細(xì)極鏈格孢4曲5-1-1JF439449.199%Alternaria brassicae甘藍(lán)長尾交鏈孢霉5曲5-1-2HQ671191.199%Gibberella zeae禾赤霉菌6曲2-2-2GU584950.199%Fusarium cerealis桑牙枯菌7曲2-1-2EU167573.199%Didymella bryoniae蔓枯病菌8曲5-2-1JQ417902.1100%Alternaria tenuissima細(xì)極鏈格孢9曲3-1-1JF422727.199%Alternaria porri天竺葵鏈格孢3.2 云南桑樹病原菌對咪酰胺的敏感性3

36、.2.1 實驗結(jié)果表明（表5）咪酰胺對桑樹病菌的抑制率較強，咪酰胺濃度越高對桑樹病菌的抑制率越高。咪酰胺濃度為10ug/ml時抑制率最高的是3號為0.5566，最低的7號為-0.365。咪酰胺濃度為30ug/ml時抑制率最高的是3號為0.7211，最低的是8號為0.0588。咪酰胺濃度為50ug/ml時抑制率最高的是4號為0.7756，抑制率最低的是2號為0.2271。咪酰胺濃度為100ug/ml時抑制率最高的是4號為0.8424，最低的是3號為0.2961。咪酰胺濃度為150ug/ml時抑制率最高的是6號為0.881，最低的是9號為0.4471。表5 桑樹病菌對咪酰胺的抑制率Table 5

37、mulberry germs to microphones amide inhibition rate序號菌株抑制率濃度10ug/ml濃度30ug/ml濃度50ug/ml濃度100ug/ml濃度150ug/ml1保2-20.50710.66140.70390.66930.6222曲4-1-10.30940.25880.22710.30350.50243曲6-2-10.55660.72110.70390.29610.80134曲5-1-10.52030.66440.77560.84240.85255曲5-1-20.4950.63830.71670.79670.80836曲2-2-20.50.55

38、560.59520.73810.8817曲2-1-2-0.3650.19570.47830.44780.66098曲5-2-10.19650.05880.28590.44710.51419曲3-1-10.27650.25880.30240.30590.4471咪酰胺對桑樹病菌的抑制效果圖0.000000.200000.400000.600000.800001.00000147101316192225283134374043菌株抑制率圖3 咪酰胺對桑樹病菌的抑制效果圖Figure 3 microphones amide to the inhibition of mulberry germs de

39、picted圖4 桑樹病菌對不同濃度的咪酰胺的抑制率效果圖Figure 4 mulberry germs to different concentrations microphones amide inhibition effect圖5 桑樹病菌對不同濃度的咪酰胺的抑制效果圖Figure 5 mulberry germs to different concentrations microphones amide inhibition effect3.2.2 咪酰胺對桑樹病菌的抑制效果從表6可以看出，云南桑樹病菌對咪酰胺的EC50存在一定的差異，而且不同菌株對同濃度咪酰胺的敏感性差異較大。咪酰胺

40、對桑樹病菌的EC50從0.012774ug/ml-17.815ug/ml。EC5017的菌株有兩株是桑干枯病（2號）和天竺葵鏈格孢（9號）咪酰胺對這兩個菌株不敏感。0.5EC502有兩株是蔓枯病菌（7號）和細(xì)極鏈格孢（8號），咪酰胺對這兩株病菌不太敏感。0.1EC500.5的菌株是桑牙枯病（6號）此菌株對桑樹葉斑病病菌較敏感。EC500.1的菌株有3個分別是細(xì)極鏈格孢（3號）、甘藍(lán)長尾交鏈孢霉（4號）和禾赤霉菌（5號）這4個菌株對咪酰胺的敏感性最強。證明咪酰胺能有效防治亞木霉、細(xì)極鏈格孢、甘藍(lán)長尾交鏈孢霉和禾赤霉菌所引起的桑樹病害。表6 咪酰胺對桑樹病菌的EC50Table 6 microph

41、ones amide to mulberry germs EC50序號菌株EC50 ug/ml1保2-20.0431672曲4-1-117.8153曲6-2-10.0127744曲5-1-10.0808465曲5-1-20.0990046曲2-2-20.1375857曲2-1-20.9441328曲5-2-11.6770019曲3-1-117.025048個菌株對咪酰胺的EC50分布有一個單峰，其中6號（桑牙枯病菌）、3號（細(xì)極鏈格孢）、4號霉（甘藍(lán)長尾交鏈孢）和5號（禾赤霉菌）這四個菌株的EC502。即除了EC502的這兩菌株外，其余6個菌株菌落對咪酰胺敏感。EC50分布圖012345670

42、-0.50.5-1.01.0-1.51.5-22EC50區(qū)域頻率圖6 咪酰胺對桑樹病菌的EC50分布圖Figure 6 microphones amide to mulberry germs EC50 of map4 討論4.1 桑樹病害的病原 本文鑒定表明，云南省引起桑樹真菌病害的病原有：細(xì)極鏈格孢（Alternaria tenuissima）、甘藍(lán)長尾交鏈孢霉（Alternaria brassicae）、禾赤霉菌（Gibberella zeae）、桑牙枯病（Fusarium cerealis）、蔓枯病菌（Didymella bryoniae）、天竺葵鏈格孢（Alternaria porri

43、）。前人研究表明云南桑樹病害主要是侵染性病害，而引起桑樹侵染性病害的病原物主要是真菌，屬于子囊菌綱（Ascomycetes）、擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes）和半知菌類（Fungi imperfecti）。菌絲體發(fā)達(dá)，有隔膜和分枝，菌絲體可構(gòu)成菌核、子座、子囊果等組織體。此外，本文還分離到一株亞木霉（Trichoderma koningii），亞木霉（Trichoderma koningii）是否對桑樹的其它病原有防治效果，需進(jìn)一步研究。4.2 咪酰胺可以有效防止桑樹病害本文中，咪酰胺可以有效防治桑樹真菌病害，在供試的8個菌株中有三個菌株：細(xì)極鏈格孢（Alternaria tenuis

44、sima）、甘藍(lán)長尾交鏈孢霉（Alternaria brassicae）和禾赤霉菌（Gibberella zeae）的EC500.1，表明咪酰胺對桑樹上的這些病菌抑制和殺菌作用很顯著。2007年仇鐵燁用咪酰胺防治水稻惡苗病的效果顯著，每hm2用咪酰胺60ml，對秧苗期和分蘗末期惡苗病防治效果達(dá)到90左右，齊穗期防效達(dá)到98以上11；2010年郭雙義、郭漠鎂、羅曉新等用20咪酰胺防治水稻紋病在水稻破口前施用750 kg/hm2 效果最好，防效達(dá)761，水稻產(chǎn)量為655208 kg/hm 28；2010年楊昌法用60 mlhm 2的咪酰胺防治早稻惡苗病防效達(dá)98810；2011年張金花、韓潤亭、劉

45、明一等用20咪酰胺防治水稻稻瘟病取得了良好的成效7。前人研究結(jié)果表明，咪鮮胺是一種咪唑類殺菌劑，對大田作物、水果、蔬菜、皮革及觀賞植物上的多種病害具有治療和鏟除作用 由于它具有選擇性高、殺菌譜廣、高效、安全等特點，而且咪鮮安屬低毒殺菌劑，未發(fā)現(xiàn)致畸、致突變和致癌作用6。對鳥低毒，對魚和水生物中等毒性，在不同類型土壤中的半衰期為35個月不等。在本文中咪鮮胺也可以有效防治桑樹病害，因此，以后對桑樹真菌病害的防治可以采用咪鮮胺。參考文獻(xiàn)1黃君霆.栽桑養(yǎng)蠶技術(shù)大全M.中國農(nóng)業(yè)出版社,1995:3-10.2華德公,胡必利.蠶桑病蟲害防治,北京金盾出版社出版M.2006:156-168.3 HYPERLINK /Main/Search.aspx?w=%22a-%186,柴建萍,HYPERLINK /Ma