mPEG修飾紅細(xì)胞Rh抗原穩(wěn)定性的研究

1、mPEG修飾紅細(xì)胞Rh抗原穩(wěn)定性的研究邱艷，查，檀英霞，章?lián)P培【摘要】本研究旨在探究PEG修飾的紅細(xì)胞Rh抗原的穩(wěn)定性。使用紅細(xì)胞膜卵白SDS電泳技能闡發(fā)PEG修飾后紅細(xì)胞膜卵白與PEG結(jié)合環(huán)境，用紅細(xì)胞血影凝集實(shí)行及4PD調(diào)養(yǎng)液保存的修飾紅細(xì)胞與匹配血液體外混血實(shí)行，不雅察PEG修飾后紅細(xì)胞Rh抗原被掩藏的穩(wěn)定性。效果創(chuàng)造：差異保存時(shí)間的PEG修飾的紅細(xì)胞在模擬輸血即混血前后的血型保持穩(wěn)定，同時(shí)PEG修飾的紅細(xì)胞在保存歷程中游離血紅卵白程度正常，而且混血后經(jīng)37孵育的PEG修飾的紅細(xì)胞游離血紅卵白程度低于不混淆的修飾的紅細(xì)胞。比力闡發(fā)PEG特異的碘染和考馬斯亮藍(lán)染的顯色圖譜創(chuàng)造，特別的碘染表

2、現(xiàn)出PEG與紅細(xì)胞膜卵白結(jié)合的條帶，PEG-SPA與紅細(xì)胞膜卵白結(jié)合后導(dǎo)致卵白分子遷徙速率產(chǎn)生改變。PEG修飾的紅細(xì)胞血影凝集實(shí)行證明，修飾紅細(xì)胞在質(zhì)膜裂損后PEG仍有用地掩藏抗原。結(jié)論：PEG-SPA豈論在紅細(xì)胞膜卵白被單獨(dú)提取后，照舊膜破壞后以及存活狀態(tài)下，均能與紅細(xì)胞膜卵白安定結(jié)合?！娟P(guān)鍵詞】PEG修飾紅細(xì)胞；Rh抗原；紅細(xì)胞RhAntigenStabilityfPEGdifiedRedBldellsKeyrdsPEGdifiedredbldell;Rhantigen;redbldellPEG-SPA可以與卵白質(zhì)和多肽中的賴氨酸K、精氨酸(R)的胺基、組氨酸(H)的咪唑基以及酪氨酸(Y)

3、的羥基產(chǎn)生化學(xué)反響，形成共價(jià)結(jié)合鍵，從而結(jié)合到卵白質(zhì)多肽上1，到達(dá)掩藏抗原的作用。PEG與紅細(xì)胞膜Rh抗原結(jié)合后是否穩(wěn)定，進(jìn)入人體后是否會(huì)脫落，這些題目干系到修飾后紅細(xì)胞進(jìn)入人體后的寧?kù)o性。為此，我們接納PEG修飾的紅細(xì)胞膜卵白SDS電泳、紅細(xì)胞血影凝集實(shí)行以及用4PD調(diào)養(yǎng)液保存的修飾紅細(xì)胞與匹配血液舉行的體外混血實(shí)行，對(duì)PEG修飾后紅細(xì)胞Rh抗原被掩藏的穩(wěn)定性舉行了開端的研究。質(zhì)料和要領(lǐng)樣品20l/LPEG-SPA修飾的AB、RhDEe紅細(xì)胞，AB、RhD-全血，RhD+血液血漿。試劑PD調(diào)養(yǎng)液、低滲磷酸緩沖液20S，pH7.4、10l/LTris-鹽酸低滲緩沖液、等滲液、電泳緩沖液、30%

4、聚丙烯酰胺凝膠溶液、分散膠緩沖液、濃縮膠緩沖液、10%分散膠、10%下層膠、0.25%考馬斯亮藍(lán)R-250、脫色液、樣品處置懲罰液、卵白分子量尺度物arker。儀器倒置顯微鏡、KUBTA2100離心機(jī)Japan、EBA12RZentrifugen低溫高速離心機(jī)Bekan公司產(chǎn)物，Gerany、XTB數(shù)顯調(diào)治儀水浴鍋浙江余姚產(chǎn)業(yè)儀表二廠產(chǎn)物、ini-Prtean型電泳儀Bi-Rad公司產(chǎn)物，USA、TS-1型脫色搖床江蘇海門其林貝爾儀器制造產(chǎn)物。PEG修飾紅細(xì)胞體外穩(wěn)定性檢測(cè)將PD保存的血比容為35%的20l/LPEG-SPA修飾的ABRhDEe紅細(xì)胞、ABRhD-全血、RhD+血漿分裝，于2-

5、6保存并在儲(chǔ)存第1、7、14、21天時(shí)取PD保存的修飾的ABRhDEe紅細(xì)胞50l，用間接抗人球卵白試驗(yàn)斷定血型后，別離參加250l的ABRhD-全血和RhD+血漿，以PD保存的血比容為35%的20l/LPEG-SPA修飾的ABRhDEe紅細(xì)胞RhD-全血和RhD+血漿作為比較，在37動(dòng)搖孵育24小時(shí)后，再次檢測(cè)血型和血漿游離血紅卵白。PEG修飾的紅細(xì)胞血影凝集實(shí)行取未修飾和修飾的紅細(xì)胞各40l，加10倍體積的PBSpH7.4，4安排30分鐘，3500g/in離心10分鐘，棄上清，參加600l的低滲磷酸緩沖液，4安排30分鐘，3500g/in離心10分鐘，棄上清，低滲磷酸緩沖液洗滌4次，350

6、0g/in離心10分鐘，沉淀即為血影細(xì)胞。在血影細(xì)胞參加Rhanti-D多抗后，在倒置顯微鏡下不雅察效果。PEG修飾的紅細(xì)胞膜卵白的SDS闡發(fā)紅細(xì)胞膜卵白的提取取PD抗凝血100l，以2000g/in10離心5分鐘，撤除血漿和灰白色血細(xì)胞層；另取PEG-SPA修飾紅細(xì)胞約40l，加預(yù)冷的等滲液將沉淀RB懸浮，以2000g/in10離心5分鐘，撤除上清液，云云重復(fù)洗滌3遍；按110v/v向沉淀RB中參加預(yù)冷的低滲液，混勻后4安排至紅細(xì)胞完全溶血；以1000g/in，4離心10分鐘，撤除上清液，將沉淀在4用低滲液6000g/in離心5分鐘，洗滌3次，得到白色的RB膜樣品。電泳別離配制10%分散膠和

7、下層膠，灌分散膠，37安排40分鐘，待膠凝固，灌下層膠，放梳子組裝電泳裝置；將卵白arker及獲得的RB膜樣品各10l與5樣品緩沖液在Eppendrf管中混淆；95加熱5分鐘，將卵白變性；用微量加樣槍將樣品參加樣品孔底部；180V恒壓電泳至溴酚藍(lán)指示劑挪動(dòng)至電泳膠外。PEG碘染色2將電泳后的膠放入容器內(nèi)，在搖床上遲鈍振蕩的歷程中參加20l0.1l/L的高氯酸，15分鐘后依次參加5l5%氯化鋇，2l0.1l/L碘溶液。5分鐘后見到碘染的PEG條帶漸漸出現(xiàn)，照相、記載效果?？捡R斯亮藍(lán)染色將碘染的膠放在蒸餾水中漂洗約20分鐘，碘染條帶漸漸消散；將約20l考馬斯亮藍(lán)染液放入盛膠的容器里，搖床遲鈍振蕩約

8、2小時(shí)，將染液棄去，再在水中漂洗數(shù)次，然后參加脫色液，脫色的條帶清楚，配景變淺，此中調(diào)換脫色液數(shù)次，照相、記載效果。統(tǒng)計(jì)學(xué)處置懲罰接納SPSS10.0軟件對(duì)檢測(cè)效果舉行hi-square查驗(yàn)。效果PEG修飾紅細(xì)胞體外穩(wěn)定性修飾的ABRhDEe紅細(xì)胞在儲(chǔ)存歷程中和模擬輸血?dú)v程即與全血和血漿混淆后于37孵育24小時(shí),Rh血型D、E、e、h和抗原未產(chǎn)生變革，PEG修飾紅細(xì)胞在保存歷程中血漿游離血紅卵白程度正常，修飾的ABRhDEe紅細(xì)胞在模擬輸血?dú)v程后，游離血紅卵白未見升高，反而低落，且1組和6組在統(tǒng)計(jì)學(xué)有明顯差異，1組和7組在統(tǒng)計(jì)學(xué)同樣有明顯差異附表。Table.Plasafreeheglbinh

9、angeinthepressfbldixture略PEG修飾的紅細(xì)胞血影凝集PEG-SPA修飾前后的紅細(xì)胞處置懲罰得到的血影和IgGRhD多克隆抗體，用直接凝集實(shí)行舉行斷定，效果表白PEG修飾前的紅細(xì)胞產(chǎn)生了凝集，而PEG-SPA修飾后的紅細(xì)胞未產(chǎn)生凝集圖1。討論P(yáng)EG與紅細(xì)胞膜只有穩(wěn)定結(jié)合，才氣包管其輸入人體后不脫落，被修飾的抗原不會(huì)表露，因此不會(huì)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反響。在對(duì)重組卵白、酶、藥物等的應(yīng)用和研究底子上創(chuàng)造，PEG與卵白分子共價(jià)結(jié)合后會(huì)進(jìn)一步吸附水分子，使卵白分子具有一個(gè)PEG和水分子包裹親水外殼，這個(gè)外殼能有用地掩藏卵白質(zhì)外貌的抗原3。已有研究效果表現(xiàn)，Rh血型抗原膜外的1、2

10、、3、4、5環(huán)上均存在與PEG-SPA產(chǎn)生反響的氨基酸K、R、H和Y，后者是PEG共價(jià)結(jié)合卵白質(zhì)氨基酸物質(zhì)基矗因此，從理論上講結(jié)合應(yīng)是穩(wěn)定的。由于如今缺乏成熟的修飾紅細(xì)胞動(dòng)物評(píng)價(jià)模子4，因此我們方案了PEG修飾紅細(xì)胞體外穩(wěn)定性實(shí)行，效果表白：差異保存時(shí)間的PEG修飾的紅細(xì)胞在模擬輸血即混血前后的血型保持穩(wěn)定，這一效果不但支持修飾的紅細(xì)胞血型在體外穩(wěn)定，而且也提示其進(jìn)入體內(nèi)應(yīng)是穩(wěn)定的；同時(shí)PEG修飾的紅細(xì)胞在保存歷程中游離血紅卵白程度正常，而且混血后經(jīng)37孵育的PEG修飾的紅細(xì)胞游離血紅卵白程度低于不混淆的修飾紅細(xì)胞，這不但說(shuō)明PEG與紅細(xì)胞的結(jié)合是安定的，同時(shí)表白全血和血漿與保存期間的PEG修

11、飾紅細(xì)胞混淆，不但不會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞布局和成效損傷，而且有利于PEG修飾紅細(xì)胞成效維持和規(guī)復(fù)，PEG仍安定與紅細(xì)胞結(jié)合起著掩藏抗原的作用。，SDS電泳闡發(fā)可以表現(xiàn)紅細(xì)胞膜上分子量從15000-250000的15種重要卵白，包羅血影卵白spetrin，：240000；220000、錨卵白ankyrin、條帶3(：100000)、條帶4.1、條帶4.2、肌動(dòng)卵白atin和血型糖卵白(glyphrin，:300005。Stt等6研究效果表白，與PEG結(jié)合的膜卵白會(huì)由于分子量的改變使電泳的帶型產(chǎn)生變革，而且表示出劑量依靠性；而且已有的效果也表白，PEG可以與紅細(xì)胞膜卵白血影卵白、條帶3、條帶4.1、條帶4.2、肌動(dòng)卵白和血型糖卵白結(jié)合7。本研究中對(duì)保存期21天PEG-SPA修飾的紅細(xì)胞膜卵白經(jīng)SDS電泳后，先用碘染色，脫色后再用考馬斯亮藍(lán)染色，比力闡發(fā)PEG特異的碘染和考馬斯亮藍(lán)染色顯色圖譜，創(chuàng)造特別的碘染色可以表現(xiàn)出PEG與紅細(xì)胞膜卵白結(jié)合的條帶，PEG-SPA與紅細(xì)胞膜卵白結(jié)合后導(dǎo)致卵白分子遷徙速率產(chǎn)生改變。這