毛細管電泳法

1、關(guān)于毛細管電泳法第一張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié) 毛細管電泳概述第二節(jié) 毛細管電泳基礎(chǔ)理論第三節(jié) 毛細管電泳儀第四節(jié) 毛細管電泳類型第五節(jié) 毛細管電泳的應用和進展第二張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié) 毛細管電泳概述毛細管電泳（CE），又稱高效毛細管電泳，是近年來發(fā)展最快的高效分離分析技術(shù)之一。該技術(shù)是現(xiàn)代微柱分離技術(shù)和經(jīng)典電泳技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物，是氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)等常用分離技術(shù)的重要補充，在諸多研究領(lǐng)域得到了人們廣泛的接受和認可。第三張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月一、毛細管電泳發(fā)展歷程1808年，俄國物理學家 Pence 發(fā)

2、現(xiàn)電泳現(xiàn)象。1937年，瑞典Tiselius將蛋白質(zhì)混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端施以電壓進行自由溶液電泳，發(fā)現(xiàn)樣品的遷移速度和方向由其電荷和淌度決定,第一次從人血清提取的蛋白質(zhì)混合液中分離出白蛋白和、球蛋白，但分離效率低；1981年，Jorgenson在75m毛細管內(nèi)施加300 V/cm的高強度電場，獲得了理論塔板數(shù)超過400,000 plates/m的高分離效率，轟動了整個分離界，成為CE劃時代里程碑1989年，毛細管電泳儀問世。 1989年，第一屆CE國際會議的召開，標志著一門新的分析技術(shù)的產(chǎn)生。第四張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月二、毛細管電泳的特點(1)高效：每米理論塔扳

3、數(shù)低則十幾萬，高則幾百萬甚至上千萬；(2)快速：可在十幾分鐘甚至幾十秒內(nèi)完成分離；(3)低樣品消耗：只需納升甚至皮升級樣品量；(4)低成本分析：只需低廉的分離毛細管和少量的運行緩沖液； CE是現(xiàn)代微柱分離和經(jīng)典電泳技術(shù)有機結(jié)合的產(chǎn)物，具有較HPLC和平板凝膠電泳更多的優(yōu)點：第五張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月(5)高度自動化：CE是目前自動化程度最高的分離分析方法之一；(6)潔凈：通常用水溶性緩沖液，對人體和環(huán)境無害；(7)多分離模式：可根據(jù)需要在同一儀器上選用不同的樣品分離模式；(8)應用范圍廣：具有“萬能”分析的功能和潛力，既可以分析無機離子、氨基酸、藥物等小分子，又可以分析蛋白

4、質(zhì)等生物大分子,甚至整個細胞和各種微粒。第六張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 毛細管電泳基礎(chǔ)理論+第七張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月一、電泳流電泳：在電解質(zhì)溶液中，位于電場中的帶電離子在電場力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象。電泳時，不同離子在電場中具有不同的定向遷移速度，遷移速度與哪些因素有關(guān)？淌度(）：單位電場下的電泳速度。絕對淌度：在無限稀釋溶液中測得的淌度。 有效電泳淌度：在實際溶液中測得的淌度。+第八張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月電場強度：與所施加的電壓成正比，與兩電極間的距離（L）成反比 E=V/L電場力：在溶液中，

5、電場對帶電離子作用力（F）的大小等于帶電離子所帶的凈電荷（q）與電場強度的乘積：F=qE在電泳遷移過程中，介質(zhì)粘滯力（F）必然會阻礙離子的遷移。粘滯力的大小與離子大小、形狀、緩沖液粘度、甚至電泳介質(zhì)孔徑均有關(guān)系，與帶電離子的移動速度更是直接相關(guān)。對于球形分子F的大小服從Stokes定律：F=6ref ：緩沖液粘度；r：球形分子的半徑；ef：離子在電場中的遷移速度。第九張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月當帶電離子以速度 在電場中移動時，受到大小相等、方向相反的電場驅(qū)動力和平動摩擦阻力的作用，此時F=F故： qE= 6ref則離子在電場中的遷移速度：即帶電離子的電泳遷移速率（或稱電泳淌度）

6、 :由此可知，球形帶電離子的遷移率，主要取決于自身狀態(tài)，即與其所帶電量成正比，與其半徑及介質(zhì)粘度成反比。電泳過程中正是利用帶電離子電泳遷移速度或遷移速率的差異來實現(xiàn)分離的。 第十張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月二、電滲流在高電場的作用下，帶正電荷的溶液表面及擴散層向陰極移動，由于這些陽離子實際上是溶劑化的，故將引起柱中的溶液整體向負極移動，形成電滲流。石英毛細管柱，內(nèi)壁大約有8.31 mol/m2的硅醇基（Si-OH），其等電點約為1.5，內(nèi)充液pH3時，表面電離成SiO-，管內(nèi)壁帶負電荷，形成雙電層。第十一張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月1. CE中電滲流的大小與方向 電

7、滲流的大小可用電滲速度和電滲淌度表示。 （1）電滲流的大小電滲流的大小與電場強度、Zata電勢及緩沖液介電常數(shù)有關(guān)，某一電泳體系內(nèi)電滲流的具體數(shù)值可以用Helmholtz-Smoluchowski 公式計算：式中， 為電滲速度； 為電滲淌度（EOF mobility）； 為雙電層的Zeta電位； 為緩沖液介電常數(shù)；為電解液粘度；V為所施加的電壓； 為毛細管總長度。第十二張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月在具體實驗中，可根據(jù)需要選用不同的中性組分作為標記物（N,N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、甲酰胺、苯酚、丙酮等），測定不同緩沖條件下中性標記物的遷移時間，按下述公式計算出電滲率： 其中，t：

8、中性標記物的遷移時間，ldet為毛細管電泳有效長度， ltot為毛細管電泳有效長度。 第十三張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）CE中電滲流的方向石英毛細管帶負電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向陰極；改變電滲流方向的方法：毛細管改性：表面鍵合陽離子基團；加電滲流反轉(zhuǎn)劑: 內(nèi)充液中加入大量的陽離子表面活性劑，將使石英毛細管壁帶正電荷，溶液表面帶負電荷。電滲流流向陽極。第十四張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2.CE中電滲流的流形液相色譜中的溶液流動為層流，拋物線流型，管壁處流速最慢，管中心處的速度為平均速度的2倍（引起譜帶展寬較大）。在毛細管電泳中，電荷均勻分布，整體移動，電滲流

9、的流動為平流，塞式流動（譜帶展寬很小），故柱效較高。第十五張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月3.CE中電滲流的作用電滲流的速度一般約等于離子電泳速度的57倍；各種電性粒子在毛細管柱中的遷移速度為：陽離子遷移速度 =電滲流+電泳流，陽離子運動速度快于電滲流；陰離子遷移速度 =電滲流電泳流，陰離子運動速度慢于電滲流；中性粒子遷移速度 =電滲流，中性粒子運動速度與電滲流一致。CE中電滲流的作用：可一次完成陽離子、陰離子、中性粒子的分離；改變電滲流的大小和方向可改變分離效率和選擇性電滲流的微小變化影響結(jié)果的重現(xiàn)性； 在CE中，控制電滲流非常重要。+第十六張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6

10、月4.CE中影響電滲流的因素（1）電場強度的影響 電滲流速度和電場強度成正比，當毛細管長度一定時，電滲流速度正比于工作電壓。（2）毛細管材料的影響 不同材料毛細管的表面電荷特性不同，產(chǎn)生的電滲流大小不同。第十七張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）電解質(zhì)溶液性質(zhì)的影響 溶液pH的影響 對于石英毛細管，溶液pH增高時，表面電離多，電荷密度增加，管壁zeta電勢增大，電滲流增大。pH在4-7之間，電滲流增大顯著；pH8時電滲流增大速度漸緩。 當pH電泳時,陰離子在負極最后流出,在這種情況下,不但可以按類分離,同種類離子由于差速遷移被相互分離。CZE是最基本、應用廣的分離模式；第三十六張，

11、PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月二、毛細管凝膠電泳 Capillary gel electrophoresis ，CGE 將聚丙烯酰胺等在毛細管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。 其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分擴散，所得峰型尖銳，分離效率高。 蛋白質(zhì)、DNA等的電荷/質(zhì)量比與分子大小無關(guān)，CZE模式很難分離，采用CGE能獲得良好分離，DNA排序的重要手段。 特點：抗對流性好，散熱性好，分離度極高。 無膠篩分技術(shù)：采用低粘度的線性聚合物溶液代替高粘度交聯(lián)聚丙烯酰胺。柱便宜、易制備。第三十七張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月1.緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，其

12、濃度達到臨界濃度，形成一疏水內(nèi)核、外部帶負電的膠束。三、 膠束電動毛細管色譜（MECC，MEKC）Micellar electrokinetic capillary chromatography, MEKC 在電場力的作用下，膠束在柱中移動。第三十八張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月2. 電泳流和電滲流的方向相反，且電滲流 電泳 ，負電膠束以較慢的速度向負極移動；5.色譜與電泳分離模式的結(jié)合。3.中性分子在膠束相和溶液（水相）間分配，疏水性強的組分與膠束結(jié)合的較牢，流出時間長；4.可用來分離中性物質(zhì)，擴展了高效毛細管電泳的應用范圍；第三十九張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月根據(jù)

13、等電點差別分離生物大分子的高分辨率電泳技術(shù)；2.毛細管內(nèi)充有兩性電解質(zhì)（合成的具有不同等電點范圍的脂肪族多胺基多羧酸混合物），當施加直流電壓（68.0 kV）時，管內(nèi)將建立一個由陽極到陰極逐步升高的pH梯度；3. 氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽等的所帶電荷與溶液pH有關(guān)，在酸性溶液中帶正電荷，反之帶負電荷。在其等電點時，呈電中性，淌度為零；四、毛細管等電聚焦Capillary isoelectric focusing, CIEF第四十張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月4.聚焦：具有不同等電點的生物試樣在電場力的作用下遷移，分別到達滿足其等電點pH的位置時，呈電中性，停止移動，形成窄溶質(zhì)帶而相互分

14、離；5.陽極端裝稀磷酸溶液，陰極端裝稀NaOH溶液；6.加壓將毛細管內(nèi)分離后的溶液推出經(jīng)過檢測器檢測；7.電滲流在CIEF中不利，應消除或減小。第四十一張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月1. 將兩種淌度差別很大的緩沖液分別作為前導離子(充滿毛細管)和尾隨離子，試樣離子的淌度全部位于兩者之間，并以同一速度移動。2. 負離子分析時，前導電解質(zhì)的淌度大于試樣中所有負離子的。所有試樣都按前導離子的速度等速向陽極前進，逐漸形成各自獨立的區(qū)帶而分離。陰極進樣，陽極檢測。五、毛細管等速電泳 Capillary isotachophoresis ，CITP第四十二張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年

15、6月3. 不同離子的淌度不同，所形成區(qū)帶的電場強度不同(=E)，淌度大的離子區(qū)帶電場強度小。 沿出口到進口，將不同區(qū)帶依次排序1、2、3、4 電場強度依次增大。假設(shè)“2”號中離子擴散到“3”號，該區(qū)電場強度大，離子被加速，返回到“2”區(qū)；當“2”號中離子跑到“1”號區(qū)，離子被減速使之歸隊；4. 特點：界面明顯，富集、濃縮作用。第四十三張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 在毛細管壁上鍵合或涂漬高效液相色譜的固定液，以含有機物的緩沖液為流動相，以電滲流為驅(qū)動力，試樣組分在兩相間的分配為分離機理的電動色譜過程；六、毛細管電色譜 Capillary electroosmostic chroma

16、tography ，CEC第四十四張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月一、離子分析陽離子分析 遷移方向和電滲流方向一致； 4.5 min內(nèi)分離了24種金屬離子； 陽極進樣，陰極檢測； 具有很高的靈敏度。第五節(jié) 毛細管電泳的應用與進展第四十五張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月陰離子分析 陰離子電泳方向和電滲流方向相反、速度接近，分析時間長、效率低； 質(zhì)量小、電荷密度大的離子如：SO42-、Cl-、F-等，電泳速率大于電滲流，陽極端流出，在陰極端無法檢測； 加入電滲流改性劑，十六烷基三甲基溴化胺等，使電泳方向和電滲流方向一致，可在3.1 min內(nèi)分離36種陰離子；陰極進樣，陽極檢測；

17、離子價態(tài)及存在形態(tài)分析；第四十六張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月二、藥物分析 檢測體液或細胞中某些代謝產(chǎn)物的分析； 尿液中的氨基酸含量作為臨床診斷糖尿病的輔助手段； 采用毛細管區(qū)帶電泳方式，在11 min內(nèi)分離17種藥物；第四十七張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月采用MEKC模式，鑒定違禁藥物；效果優(yōu)于HPLC法第四十八張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月三、手性化合物分析 合成獲得單一手性化合物相當困難；528種手性合成藥物，61中以單一對映體形式銷售，其他為外消旋體；檢測分析也相當困難；研究熱點；R-反應停是安眠藥，S-式致胎兒畸形； HPCE分離分析手性化合物的方法：加入手性選擇劑；形成配合物的穩(wěn)定常數(shù)有差異，結(jié)合HPCE的高效率； 常用手性選擇劑：環(huán)糊精及其衍生物；手性冠醚；手性表面活性劑（氨基酸衍生物、膽酸鈉、?；敲撗跄懰峒捌溻c鹽、低聚糖等天然手性表面活性劑）第四十九張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月四、氨基酸與蛋白質(zhì)分析采用MEKC模式，在25 min內(nèi)分離了23種丹?；被?；HPCE可取代傳統(tǒng)的氨基酸分析儀；問題：吸附和檢測；第五十張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月蛋白質(zhì)分析第五十一張，PPT共五十四頁，創(chuàng)作于2022年6月五、核酸分析及DNA排序酶解的雙螺旋D