大鼠部分肝移植后早期肝內(nèi)細(xì)胞因子的變化

1、大鼠局部肝移植后早期肝內(nèi)細(xì)胞因子的變化【摘要】【目的】研究不同冷缺血損傷條件下，腫瘤壞死因子-和白介素-等細(xì)胞因子在大鼠局部肝移植后的變化規(guī)律與肝臟再生的關(guān)系。【方法】建立大鼠局部原位肝移植模型。實驗組分為：冷缺血、和組，每組只。觀察各組的生存率，并在術(shù)后、和搜集標(biāo)本。檢測不同冷缺血時間腫瘤壞死因子-、白介素-等細(xì)胞因子的表達(dá)。檢測溴脫氧尿核苷攝取觀察肝細(xì)胞合成情況?！窘Y(jié)果】共行例大鼠局部肝臟移植，肝移植手術(shù)的成功率是。冷缺血、組的局部肝移植物存活率均為。冷缺血后局部肝移植組存活率為。與冷缺血相比，和的冷缺血損傷誘導(dǎo)大鼠局部肝移植物白介素-和腫瘤壞死因子-等因子表達(dá)增加。與冷缺血相比，冷缺血組

2、的移植肝在移植術(shù)后攝取溴脫氧尿核苷明顯增多。冷缺血組的移植肝在移植術(shù)后僅有少數(shù)溴脫氧尿核苷染色陽性的肝細(xì)胞存在。【結(jié)論】腫瘤壞死因子-和白介素-等細(xì)胞因子的上調(diào)表達(dá)在啟動和完成局部肝移植后早期肝臟再生的過程中非常重要。輕度和中度的冷缺血損傷可以啟動并完成局部肝移植物移植后的肝臟再生，但重度的冷缺血損傷即使在早期啟動信號存在的情況下，不能完成移植后的肝臟再生?！娟P(guān)鍵詞】冷缺血損傷；肝移植；白介素-；腫瘤壞死因子；肝；再生-，-，-，；，-，：【】-【】：，-【】，-，【】-，：；-；-；在影響臨床劈裂式肝移植后移植物功能存活的因素中，冷缺血再灌注損傷仍然是一個重要因素。研究發(fā)現(xiàn)大鼠的全肝移植物在

3、冷缺血再灌注損傷后的恢復(fù)途徑大鼠肝切除后的機(jī)制相似，通過?鄄誘導(dǎo)肝臟再生，修復(fù)組織損傷，。局部肝臟移植物冷缺血損傷后肝臟再生的機(jī)理尚未完全清楚。本實驗應(yīng)用大鼠原位局部肝移植模型，研究不同冷缺血損傷條件下，局部肝臟移植物的功能存活和肝臟再生，討論?鄄和?鄄等細(xì)胞因子的表達(dá)參與損傷后肝臟再生的規(guī)律。材料和方法動物供受體均采用安康、雄性、清潔級近交系大鼠，供、受體大鼠各只，體質(zhì)量。飼養(yǎng)條件符合無特定病原動物標(biāo)準(zhǔn)。手術(shù)方法供體手術(shù)異氟醚持續(xù)吸入麻醉，在單人雙目型手術(shù)顯微鏡公司，德國下進(jìn)展。腹部橫切口進(jìn)腹，游離肝臟。*近肝門處切開膽總管，置入膽道支架管，美國。游離門靜脈及肝固有動脈，近門靜脈處結(jié)扎幽門靜

4、脈。別離肝下下腔靜脈，結(jié)扎切斷右腎上腺靜脈和右腎靜脈。在肝總動脈分支處游離肝總動脈。灌注前，經(jīng)肝下下腔靜脈注入肝素鈉。的器官保存液液經(jīng)門靜脈灌注肝臟呈土黃色。灌注前開放肝下下腔靜脈排出灌注液。肝下下腔靜脈和門靜脈分別用聚乙烯套管固定。供肝置入液中保存。受體手術(shù)受體手術(shù)時，麻醉方法、體位、切口均同供體手術(shù)。游離肝周韌帶和腎上血管。游離肝固有動脈，在*近肝門分支處切斷。膽總管*近肝門分支處切斷。阻斷肝上、肝下下腔靜脈和門靜脈后切除受體肝臟，保存足夠的血管長度以利于血管重建。原位肝移植采用二袖套法，肝上下腔靜脈端端縫合。肝下下腔靜脈和門靜脈分別用套管法重建，膽管重建采用內(nèi)支架管端端連接的方法。套疊縫

5、合法重建肝動脈。移植肝恢復(fù)血流前，用絲線結(jié)扎大鼠左側(cè)中央葉、左外葉、尾狀葉，保存右側(cè)的肝葉，即可建立大鼠的局部肝移植模型。絲線連續(xù)雙層縫合腹壁。實驗分組實驗分組，各只：冷缺血組，供肝置入液中保存；冷缺血組，供肝置入液中保存；冷缺血組，供肝置入液中保存。每組分別在供肝血流恢復(fù)后、和處死只大鼠搜集標(biāo)本進(jìn)展檢測。每組只大鼠觀察至術(shù)后第天。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反響?鄄檢測?鄄和?鄄在預(yù)定的時間點(diǎn)處死大鼠后，切取肝組織提取，純化。的經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增后用瓊脂糖凝膠電泳別離后進(jìn)展半定量分析。?鄄肌動蛋白?鄄作為對照。擴(kuò)增?鄄所用的引物是?鄄?鄄?鄄；?鄄?鄄?鄄。免疫組化檢測肝細(xì)胞復(fù)制移植肝復(fù)流后進(jìn)展肝細(xì)胞復(fù)制檢

6、測。取標(biāo)本前經(jīng)腹腔注入溴脫氧尿核苷，。試劑有抗抗體公司，美國等。免疫組化染色方法按說明書進(jìn)展。本實驗采用顯色，采用棕色，蘇木素復(fù)染的方法將增殖細(xì)胞的細(xì)胞核染成棕色，而靜止期的細(xì)胞核不染色。陽性細(xì)胞數(shù)通過計數(shù)低倍鏡下個視野染色陽性的細(xì)胞，然后計算其平均陽性數(shù)。常規(guī)進(jìn)展染色，觀察細(xì)胞形態(tài)。統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示。各實驗組間?鄄和?鄄的等因子的表達(dá)程度比擬采用方差分析。冷缺血組和在冷缺血組術(shù)后攝取溴脫氧尿核苷的肝細(xì)胞數(shù)量屬于連續(xù)型計量資料，符合正態(tài)分布，兩者比擬采用檢驗。檢驗水準(zhǔn)，設(shè)。結(jié)果動物的存活情況冷缺血、組的局部肝臟移植手術(shù)成功率均為。冷缺血、組的動物存活率均為。兩組局部肝臟移

7、植物在術(shù)后第已到達(dá)原受體肝體積的以上。冷缺血組的動物麻醉后清醒和活動恢復(fù)較慢，但無其它的并發(fā)癥發(fā)生。后冷缺血組的局部肝臟移植物的存活率降至。本實驗證實動脈重建的大鼠局部肝移植物不能耐受的冷缺血損傷。-和-等細(xì)胞因子的表達(dá)-檢測肝內(nèi)-和-的表達(dá)圖。局部肝臟移植后，在冷缺血組，-和-的表達(dá)保持在較低程度。在冷缺血組和冷缺血組，-和-的表達(dá)明顯增加，與冷缺血組的-和-的表達(dá)程度相比，差異有顯著性，。但冷缺血組和冷缺血組的-的表達(dá)差異無顯著性，；圖。肝細(xì)胞合成的檢測免疫組化檢測肝細(xì)胞攝取溴脫氧尿核苷觀察肝移植物的細(xì)胞復(fù)制情況。合成期增殖的細(xì)胞被染成棕色。全肝的移植物，術(shù)后是肝細(xì)胞分裂期的頂峰。為了觀察

8、移植肝的細(xì)胞復(fù)制情況，我們在移植術(shù)后連續(xù)測定肝細(xì)胞攝取溴脫氧尿核苷情況。冷缺血組，肝細(xì)胞攝取溴脫氧尿核苷的數(shù)量保持在穩(wěn)定較低的程度。冷缺血組在術(shù)后肝細(xì)胞攝取溴脫氧尿核苷到達(dá)最高，然后下降圖。與冷缺血組的攝取溴脫氧尿核苷程度相比，差異有顯著性，。與冷缺血組和冷缺血組相比，冷缺血組的肝細(xì)胞攝取溴脫氧尿核苷沒有明顯的增加，這些移植物術(shù)后存活時間較短。移植肝組織學(xué)的檢測組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)移植術(shù)后輕度冷缺血和中度冷缺血的冷缺血損傷后移植肝組織構(gòu)造正常，沒有明顯的組織壞死等改變。僅有輕度的竇狀隙擴(kuò)張和輕度的炎癥圖。隨著冷缺血時間延長到，組織學(xué)檢查有凋亡的早期改變，伴有竇狀隙的炎癥和壞死等改變圖。討論肝臟移植是

9、治療終末期肝病的最有效方法，但供體短缺限制了肝臟移植的廣泛應(yīng)用。臨床上為解決這一矛盾，劈裂式和活體肝臟移植新技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，。無論全肝或者局部肝臟的移植物，均要經(jīng)歷一定程度的冷缺血損傷?；铙w肝移植的冷缺血時間比擬短，但劈裂式肝臟移植的冷缺血時間明顯延長。肝切除后參與肝臟再生的重要的細(xì)胞因子是-和-，。大鼠全肝移植物在冷缺血再灌注損傷后亦通過-和-等因子調(diào)節(jié)肝臟再生。肝臟局部移植物經(jīng)受冷缺血損傷后的再活力理尚不完全清楚。我們應(yīng)用肝臟移植模型，觀察了不同冷缺血損傷對移植物肝臟再生的影響和移植后-和-的變化規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論冷缺血損傷時間長短，移植后早期肝臟再生的信號始終存在。但在重度的冷缺血損傷下

10、，移植物不能完成肝臟再生過程，因此不能存活。-型受體和-缺陷小鼠肝切除后肝臟再生障礙，而外源性-可以逆轉(zhuǎn)異常的肝臟再生，說明-在肝臟再生啟動過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，。等在研究肝移植后肝臟再生時發(fā)現(xiàn)，缺血損傷導(dǎo)致移植肝組織中的-和-表達(dá)程度明顯降低，肝臟再生才能顯著下降。而-可明顯改善肝臟再生，減輕缺血再灌注損傷。與冷缺血相比，冷缺血和冷缺血組誘導(dǎo)大鼠局部肝移植物的-和-等因子表達(dá)增加。但本實驗證實，在肝臟遭受切除和冷缺血損傷后，-和-等細(xì)胞因子的表達(dá)亦明顯增加。冷缺血損傷組的局部肝臟移植物在移植術(shù)后攝取溴脫氧尿核苷明顯增多，說明已啟動并完成細(xì)胞復(fù)制和肝臟再生。冷缺血組因為損傷較輕，肝臟細(xì)胞復(fù)制保持

11、在穩(wěn)定程度。但冷缺血組的移植肝在移植術(shù)后僅有少數(shù)溴脫氧尿核苷染色陽性的肝細(xì)胞存在，比冷缺血組的肝臟細(xì)胞復(fù)制程度還低，說明重度的冷缺血損傷后局部肝臟物的肝臟再生過程沒有完成。這一點(diǎn)與全肝移植物經(jīng)歷冷缺血后肝臟再生的結(jié)果完全不同。全肝移植雖然遭受冷缺血損傷，但由于啟動了肝臟再生這一保護(hù)機(jī)制，可以保持功能存活。假如冷缺血損傷超過機(jī)體的承受才能，機(jī)體雖能產(chǎn)生-和-，但是不能對啟動的信號起作用。肝再生的細(xì)胞復(fù)制階段不能完成，移植物不能存活。臨床上可以觀察到活體肝移植的效果優(yōu)于劈裂式肝移植，可能就是冷缺血損傷影響了肝臟再生的才能和移植物的功能存活。肝臟再生是非常復(fù)雜和精細(xì)調(diào)節(jié)的過程。機(jī)體通過激活系統(tǒng)促進(jìn)肝臟再生外，還存在抑制因子拮抗系統(tǒng)負(fù)反響機(jī)制準(zhǔn)確調(diào)節(jié)肝臟再生。-可促進(jìn)肝臟再生，但過高-也可阻止和延遲肝臟再生，提醒-在肝臟再生過程中表現(xiàn)出的雙重性。與全肝移植物誘導(dǎo)肝臟再生的機(jī)理類似，局部肝臟移植物經(jīng)受冷缺血損傷后，仍然需要-和-等活化因子啟動并完成肝臟再生的過程，移植物才能存活。進(jìn)一步