李敏-感染性疾病(細(xì)菌類)分子檢測(cè)及臨床應(yīng)用 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院

1、感染性疾病(細(xì)菌類)分子檢測(cè)及臨床應(yīng)用李 敏檢驗(yàn)科上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院傳統(tǒng)微生物檢驗(yàn)：病原體分離鑒定(金標(biāo)準(zhǔn)）+藥物敏感性試驗(yàn)24-48 hr24-48 hr24 -48hr生化鑒定+藥敏試驗(yàn)3-5 daysPathogens causing human infectious diseases1% pathogens can becultured and identified inclinical labs;Many infectious diseaseshave no pathogen diagnosisresults2019/3/11Diagnosis of infectious

2、 diseases: urgent!膿毒癥發(fā)生前，有效抗生素治療每延遲1小時(shí)，平均生存率將降低7.6% (3.6-9.9%);快速及時(shí)的病原學(xué)診斷、有效合理抗感染治療對(duì)挽救生命至關(guān)重要.臨床感染性疾病診療面臨的問題1：多重耐藥菌感染是臨床抗感染治療面臨的棘手問題；2：非常規(guī)病原體感染診療能力有待提高（分枝桿菌，真菌，病毒，支原體，衣原體，寄生蟲等）2019/3/11微生物室：迫切需要提高感染診斷效率生化鑒定管生化鑒定儀器鑒定免疫學(xué)技術(shù)（G實(shí)驗(yàn)、GM實(shí)驗(yàn)、隱球菌莢膜多糖抗原、艱難梭菌毒素檢測(cè)，呼吸道病原體9聯(lián)檢）生物活性物質(zhì)檢測(cè)（-干擾素、CRP 、SAA 、PCT）核酸檢測(cè)技術(shù)(核酸檢測(cè)、耐藥

3、基因，分型，高通量病原體核酸檢測(cè)，NGS）快速診斷技術(shù)MALDI-TOF MS （時(shí)間飛行質(zhì)譜技術(shù)）病原診斷方法的發(fā)展診斷方法顯微鏡病原鑒定的時(shí)間數(shù)分鐘，形態(tài)學(xué)（淋球菌，隱球菌，分枝桿菌）革蘭染色數(shù)分鐘，G+/G-培養(yǎng)和生化（細(xì)菌，分枝桿菌，真菌）數(shù)天-數(shù)周，耗時(shí)急性和恢復(fù)期抗體（EIA,ELISA)數(shù)周單克隆抗體抗原檢測(cè)數(shù)小時(shí)數(shù)分鐘-數(shù)小時(shí)（不能進(jìn)行藥敏檢測(cè)）PCR檢測(cè)病原體和耐藥基因 1-數(shù)小時(shí)質(zhì)譜分析Mass數(shù)秒-數(shù)分鐘（細(xì)落形成后）spectrometry二代測(cè)序2-3天2019/3/11新興前沿的 MALDI-TOF MS技術(shù)：微生物快速鑒定革新技術(shù)病原體鑒定革命性改變（2010-）

4、:簡(jiǎn)便、快速診斷人類病原體比常規(guī)生化鑒定節(jié)省至少24小時(shí)證明是一個(gè)可靠和快速的方法%Int.1001713 mVsum= 42832 mV Prof iles 1-25 Smooth Av 30436362898060407243539376479140638272715264948220073376604 729182069545362040004567567660008118 885310641122441200013258 1410880001000014000m/z5分鐘內(nèi)得到鑒定結(jié)果1-2天的分離培養(yǎng)進(jìn)一步加快準(zhǔn)確診斷、有效合理抗生素治療的效率數(shù)據(jù)庫(kù)更新：聚焦新出現(xiàn)的重要病原體人類感

5、染中，馬耳他布魯菌占主要地位; V3.2已覆蓋陸生布魯菌8種中的6種，覆蓋海洋僅有的2種，以及近期報(bào)道的乳房植入體分離的1種新發(fā)病原體：按蚊伊麗莎白金菌，耳道念珠菌厭氧菌感染在臨床上已經(jīng)變得越來越值得關(guān)注；數(shù)據(jù)庫(kù)獨(dú)有菌種：14種真菌，7種霉菌，3種酵母菌，11種支原體及3種其他菌種血培養(yǎng)直接萃取鑒定血培養(yǎng)直接萃取鑒定：血培養(yǎng)液抽取6ml放入BD分離膠促凝管，離心后去除上清；用1ul一次性接種環(huán)挑取上述步驟得到的灰白色菌體富集物加入到500ul無菌水中, 13000rpm,離心2min;用無菌吸管吸取上清棄去，加入500ul無菌水懸浮并充分振蕩混勻，13000rpm,離心2min10-20分鐘質(zhì)

6、譜萃取鑒定結(jié)果：馬爾尼菲藍(lán)狀菌MALDI-TOF MS技術(shù)在臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用領(lǐng)域核酸檢測(cè)技術(shù)在臨床感染性疾病中的應(yīng)用 核酸檢測(cè)技術(shù)主要包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、核酸探針雜交、基因芯片、測(cè)序等 分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)在感染性疾病中的應(yīng)用主要包括對(duì)病原生物進(jìn)行鑒定、分型、耐藥和治療過程中的療效監(jiān)測(cè)等 應(yīng)用于不能或不易培養(yǎng)、生長(zhǎng)緩慢的病原體引起的感染性疾病，如病毒性肝炎、艾滋病、流感、結(jié)核病、支原體、衣原體等2019/3/11結(jié)核 中國(guó)入榜WHO的“三高”負(fù)擔(dān)國(guó)家. 新發(fā)病例：91.8萬. 死亡病例：3.8萬. 報(bào)告病例：80.4萬“十三五”要求: 臨床結(jié)核防控工作重點(diǎn)(到2020年). 全國(guó)結(jié)核發(fā)病率

7、下降到58/10萬. 結(jié)核病患者數(shù)較多和疫情偏高的地區(qū)，發(fā)病率較2015年下降20%. 肺結(jié)核患者的病原學(xué)診斷率達(dá)到50%以上（關(guān)口前移）. 耐多藥肺結(jié)核高危人群篩查率達(dá)到95%以上藥敏試驗(yàn)觀察 孵育4周觀察生長(zhǎng)情況涂片MTB培養(yǎng)孵育4-8周（陽性）Sputum平均時(shí)間2-3個(gè)月液體培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)平均時(shí)間20天涂片（陽性）分子診斷技術(shù)只需2小時(shí)-2天涂陽=60-98%有結(jié)核分枝桿菌，因此涂陽后最好用分子生物學(xué)方法進(jìn)行快速鑒定結(jié)核病分子診斷RNA水平DNA水平蛋白質(zhì)水平IGRAs 、TST等恒溫?cái)U(kuò)增鑒定變溫?cái)U(kuò)增擴(kuò)增雜交T-SPOT.TB與QFT-GI為IGRAs實(shí)驗(yàn)SAT、TMA FISH、Pr

8、obe鑒定+耐藥LAMP、SDA 芯片、RT-PCR全血IFN-釋放分析技術(shù)(IGRA)結(jié)核感染者體內(nèi)存在特異的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，效應(yīng)T淋巴細(xì)胞再次受到結(jié)核抗原刺激時(shí)會(huì)分泌多種細(xì)胞因子（IFN-）。因此，檢測(cè)效應(yīng)T淋巴細(xì)胞可用于結(jié)核病或結(jié)核潛伏感染者的診斷。由于效應(yīng)T細(xì)胞存活時(shí)間很短，而且具有特異性，因此可以作為機(jī)體是否正處于被感染的指標(biāo)，無論是否有臨床癥狀?；贗GRA原理的產(chǎn)品目前已被美國(guó)、加拿大、英國(guó)、德國(guó)、意大利、瑞士、法國(guó)、荷蘭、日本等二十余個(gè)國(guó)家寫入本國(guó)的結(jié)核診療指南中結(jié)果判斷圖空白對(duì)照抗原 AESAT-6抗原 BCFP10陽性對(duì)照（PHA）陰性結(jié)果陽性結(jié)果潛伏性結(jié)核（LTBI）診斷

9、技術(shù)比較難以從感染者中鑒別出活動(dòng)性肺結(jié)核患者IGRAs與TST相比，具有更高的靈敏度和特異性小于5歲兒童、免疫力低下患者不適合采用IGRAs檢測(cè)試劑成本非常高IGRAs與BCG, NTM無交叉反應(yīng)，TST有交叉反應(yīng)核酸擴(kuò)增技術(shù)核酸擴(kuò)增技術(shù)反應(yīng)條件熱循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)方法實(shí)時(shí)RT-PCRDNADNART-LAMP恒溫GenoTypeMTBDRplus熱循環(huán)DNACPA恒溫恒溫DNARNANASBATMASAT恒溫恒溫RNARNA終點(diǎn)實(shí)時(shí)RNA作為臨床分子診斷靶標(biāo)RNA 拷貝數(shù) DNA拷貝數(shù)生命力旺盛的病原體RNA轉(zhuǎn)錄活躍較好的愈后指標(biāo)TMA、S AT優(yōu)點(diǎn)交叉污染少SAT技術(shù)同一溫度下（42），以R

10、NA為起始模板，通過M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生一個(gè)雙鏈DNA拷貝，然后利用T7 RNA多聚酶從DNA拷貝上產(chǎn)生多個(gè)（1001000個(gè)）RNA拷貝；每一個(gè)RNA拷貝再?gòu)姆崔D(zhuǎn)錄開始進(jìn)入下一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)；同時(shí)，帶有熒光標(biāo)記的探針和這些RNA拷貝特異結(jié)合，產(chǎn)生熒光。該熒光信號(hào)可由熒光檢測(cè)儀器實(shí)時(shí)捕獲，直觀反映擴(kuò)增循環(huán)情況RNA(+)Forward PrimerRTRNA(+)DNA(-)RNase H activityDNA(-)DNA(-)Reverse PrimerRTDNA(+)DNA(-)T7100-1000 copiesDNA(+)DNA(+)RNA(-)RNA(-)Forward PrimerM

11、olecular BeaconRT/RNase H activityReverse PrimerRNA(-)MTBC-鑒定MTB復(fù)合群(TMA技術(shù))方法名稱：HPV（Hybridization Protection Assay）-雜交保護(hù)分析法原理：以rRNA為靶標(biāo)，采用線性探針技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群HPA-MTD(Mycobacterium Tuberculosis Direct):2.5h 報(bào)告，直接從標(biāo)本中檢測(cè)結(jié)核菌HPA-Accuprobe:1h 報(bào)告，用菌落或自動(dòng)培養(yǎng)系統(tǒng)的菌DNA作為臨床分子診斷靶標(biāo)方法名稱 ：MTBDRplus-鑒定MDR耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)快速診斷為

12、Hain Lifescience公司專利原理：采用線性探針技術(shù)（Line-Probe或稱DNA-Strip）檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群利福平(rpoB)和異煙肼(katG和inhA)等結(jié)核治療藥物的耐藥基因來判斷TB體內(nèi)耐藥性MTBDRplus:6h報(bào)告結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群鑒定與耐藥結(jié)果MTBDRplus技術(shù)路線結(jié)核耐藥的分子機(jī)制抗 結(jié) 核藥物耐 藥水平靶基因 編碼的產(chǎn)物靶區(qū)域和突變率最常見突變位點(diǎn)RNA聚合酶亞單位過氧化氫酶-過氧化物酶Codon531，30-75RFPrpoBkatGRRDR 81 bp，95高INHINH整個(gè)基因，60-95調(diào)節(jié)區(qū)，25S315T，60-95 高inhA烯?；€

13、原酶inhA-15低低ahpC-INHPromote 過氧化物酶啟動(dòng)區(qū)，12%rPZApncA吡嗪酰胺酶整個(gè)基因，68-97無特定位點(diǎn)高高ERDR少數(shù)密碼子， Codon306，47-8947-94阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶EMBembBCodons 43 和88， 40-95SMSMrpsLrrs核糖體蛋白S12K43R，40-90 高513位、905位堿16S rRNA多個(gè)堿基，29%67106位,75-94%基，各占10.3%低gyrAgyrB喹 諾 酮類DNA旋轉(zhuǎn)酶Codon90,94高結(jié)果解釋 野生型：有雜交帶顯色為“+”，表示未發(fā)生突變 耐藥突變位點(diǎn)：有雜交帶顯色為“+”，表示發(fā)生突變 敏感

14、：所有野生型探針“+”和所有耐藥位點(diǎn)探針“-” 耐藥：對(duì)應(yīng)藥物有1條野生型探針“-”或有1條耐藥位點(diǎn)“+”MTBDRplus技術(shù)優(yōu)勢(shì)不足快速檢測(cè)RFP和INH的耐藥時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單、安全高特異性和靈敏度較高、重復(fù)性好主觀因素影響小、更為可靠不能檢測(cè)所有藥物的耐藥基因型缺少ahpC-oxyR間隔序列范圍不能取代傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)檢測(cè)、只能作為參考技術(shù)特點(diǎn)交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù):將病原體DNA擴(kuò)增、核酸雜交和核酸試紙條檢測(cè)三種技術(shù)有機(jī)地融為一體，在恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)中加入兩對(duì)TB特異性引物、一對(duì)特異性探針，同時(shí)一次性完成TB DNA的擴(kuò)增及雜交過程，然后用3號(hào)一次性核酸檢測(cè)裝置對(duì)TB感染進(jìn)行定性診斷，其檢測(cè)靈敏度

15、為10個(gè)病原體，高特異引物設(shè)計(jì)確保了結(jié)果的可靠性。由于待測(cè)樣本的擴(kuò)增（PCR管蓋和石蠟油雙重保護(hù)）和檢測(cè)過程均在物理封閉條件下完成，所以本試劑盒具有防止實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增物交叉污染，防止假陽性的效果環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù) (LAMP )環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法是日本榮研化學(xué)獨(dú)立研發(fā)的一種“簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、廉價(jià)”的基因擴(kuò)增方法。它的特征是針對(duì)目標(biāo)DNA鏈上的六個(gè)區(qū)段設(shè)計(jì)四個(gè)不同的引物，然后再利用鏈置換反應(yīng)在一定溫度下進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)只需要把基因模板、引物、鏈置換型DNA合成酶、基質(zhì)等共同置于一定溫度下（60-65）、經(jīng)一個(gè)步驟即可完成。擴(kuò)增效率極高，可在15min-1h內(nèi)實(shí)現(xiàn)109-1010倍的擴(kuò)增。而且由于有著高

16、度的特異性，只需根據(jù)擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的有無可對(duì)靶基因序列的存在與否作出判斷DNA微陣列（基因芯片）技術(shù): DNA微陣列或芯片技術(shù)是利用光導(dǎo)化學(xué)合成、照相平板印刷以及固相表面化學(xué)合成等技術(shù)，在固相表面合成成千上萬個(gè)寡核苷酸探針，或?qū)⒁合嗪铣傻奶结樣晌㈥嚵衅骰驒C(jī)器人點(diǎn)樣于尼龍膜或硅片上，再與放射性同位素或熒光物標(biāo)記的DNA或cDNA雜交，用于分析DNA突變及多態(tài)性、DNA測(cè)序、監(jiān)測(cè)同一組織細(xì)胞在不同狀態(tài)下多種組織細(xì)胞基因表達(dá)水平的差異、發(fā)現(xiàn)新的致病基因或疾病相關(guān)基因等多個(gè)研究領(lǐng)域各項(xiàng)技術(shù)比較實(shí)驗(yàn)平臺(tái)要求檢測(cè)方法傳統(tǒng)培養(yǎng)性能檢測(cè)時(shí)間耗費(fèi)擴(kuò)增效率靶分子儲(chǔ)運(yùn)要求溫度特異性好，鑒定+藥敏：較大-抗原一般普通孵

17、育較高較高靈敏度低特異性與2-3月ESAT-6與CFP 10抗原二氧化碳孵育T-SPOT 靈敏度較TST好24 h高-較高極高-高高特異性與PCRS AT靈敏度較好2.5h2 h較高較低較低DNARNARNA熱循環(huán)恒溫高特異性極好，靈敏度好一般一般較低較低特異性極好，靈敏度好TMA2.5 h恒溫各項(xiàng)技術(shù)比較實(shí)驗(yàn)平臺(tái)要求檢測(cè)方法性能檢測(cè)時(shí)間耗費(fèi)擴(kuò)增效率靶分子儲(chǔ)運(yùn)要求溫度特異性與靈敏度較好鑒定+耐藥：Hain高較高DNA高熱循環(huán)較高低6 h特異性與靈敏度極好CPA2 h2 h極低極低高高高DNADNADNADNA低低高高恒溫恒溫特異性極好，靈敏度好LAMP低特異性極鑒定+耐藥：基因芯片 好，靈敏度

18、好高熱循環(huán)熱循環(huán)高6 h特異性與鑒定+耐藥：Hain靈敏度較好高較高較高6 hDNA或RNA擴(kuò)增：嚴(yán)格準(zhǔn)守基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室分區(qū)要求不同樣本類型，實(shí)驗(yàn)室分區(qū)不同，但部分分區(qū)可以共用（空間要求）分子診斷技術(shù)上崗證（人員資質(zhì)）分子診斷實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)（實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)）無法推廣到基層實(shí)驗(yàn)室和床旁Point-of care testing (POCT)- 床邊體外診斷檢驗(yàn)，即床邊檢驗(yàn)或近病人檢驗(yàn) Point：地點(diǎn)，時(shí)間 Care：保健，照料 Testing：檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)：簡(jiǎn)單，快速，便攜，試劑穩(wěn)定，便于保存，結(jié)果報(bào)告即時(shí)化臨床價(jià)值：敏感，特異，適合多種樣本2019/3/11Rapid diagnosis of i

19、nfectious diseasesMoleculardiagnosisMicrofluidic chip technology makes POCT moleculardiagnosis possibleMicrofluidic chips- integration, portability, and miniaturization- Rapid detection of multiple pathogensApplication of microfluidic chip technology inpathogen diagnosisMolecular diagnostic processN

20、ucleic acidextractionNucleic acidamplificationIntegration, rapid, sensitive, specific,multiple pathogens, resistant genes2019/3/11分子POCT: 全自動(dòng)一體化核酸檢測(cè)平臺(tái)(樣本進(jìn)-結(jié)果出 all in one!)系統(tǒng)內(nèi)自動(dòng)完成痰標(biāo)本與處理液1：2混合DNA和PCR反應(yīng)試劑混合半巢式實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)標(biāo)本自動(dòng)清洗過濾超聲裂解DNA提純打印檢測(cè)報(bào)告吸取2ml處理樣品到反應(yīng)盒將反應(yīng)盒放入檢測(cè)模塊（手工操作完成）獲得檢測(cè)結(jié)果時(shí)間：1小時(shí)50分鐘檢測(cè)流程：手工步驟只需2

21、分鐘，2小時(shí)出報(bào)告All in one技術(shù)無需PCR實(shí)驗(yàn)室分區(qū)All in one 檢測(cè)屬于低生物安全風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別分子POCT在HAI 診斷/監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用舉例特殊感染（器官移植感染）即時(shí)診斷和溯源2019/3/11移植前供體的快速篩查（） 對(duì)器官捐獻(xiàn)者的醫(yī)療記錄和社會(huì)行為記錄進(jìn)行評(píng)估（OPO）（）對(duì)器官捐獻(xiàn)者進(jìn)行檢查(OPO)（術(shù)前感染常規(guī)檢測(cè)）移植前供體器官高毒力高耐藥細(xì)菌攜帶？2016.12017.4上海市多中心腎移植患者CRKP感染概況Antibiotics Positive blood Positive urinaypatientage/sexCRKP isolateshospitalpr

22、ophylaxiscultureculturePortal of entry723(urine),818(blood),820(sputum)P1P2P364yr,manRen jiYESYESYESYESnoyesnonoUrinary tractdonor148yr,man1156(donor)2322(blood)Ren ji52yr,womanChang zhengyesdonor21856（blood）,P420yr,woman53yr,man1859(flow liquid)Chang haiYESYESyesyesnonodonor3donor42055（donor）,2136(

23、flow liquid)，2184（blood）P5Chang haiChang hai2218(flow liquid)，2306（blood）P6P746yr,manYESYESyesyesnodonor460yr,woman137(urine),147(blood) Ren jiyesUrinary tract1(donor)，2(flowP8P952yr,woman59yr,womanliquid)Ren jiRen jiYESYESnonononodonor5donor53(flow liquid) 腎移植術(shù)后9例CRKP感染患者中僅有2例病人存活。 這些CRKP藥敏均報(bào)告替加環(huán)素和

24、多粘菌素敏感，但是使用后均無效，患者均在第一次檢出肺克3周內(nèi)死亡。肺克感染致移植腎動(dòng)脈破裂出血腎移植患者CRKP感染的細(xì)菌學(xué)溯源分析PFGE方法進(jìn)行DNA圖譜細(xì)菌同源性分析顯示，9例病人有7人是由供體獲得CRKP。MLST：多位點(diǎn)序列分型；PFGE： 脈沖場(chǎng)凝膠電泳移植前供體器官篩查高毒高耐病原體非常有必要！供體不同樣本中檢出細(xì)菌提示價(jià)值供體樣本獲得樣本的時(shí)間受體在術(shù)后21d內(nèi)檢出相同細(xì)菌的幾率血液供體獲取前高熱時(shí)50%痰或咽拭子尿液腎臟保存液供體獲取前任意時(shí)間供體獲取前任意時(shí)間供腎獲取后10%25%25%供腎血管組織供腎灌洗液供腎獲取后供腎獲取后75%100%臨床要求：1、檢測(cè)周期一定要短（1-2小時(shí)）2、靈敏度和特異度要高3、要檢測(cè)到具體的耐藥機(jī)制頭孢他啶-阿維巴坦有可能是有效的治療藥物有一線希望感染的即時(shí)檢驗(yàn)（POCT）CDC Threat LevelCDC Threat LevelUrgentSeriousXpertXpertXpertvanA/vanBXpertCarba-RXpertC. difficileSA Nasal Compl