生物化學(xué)A（上）-5蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)-分離提純

1、蛋白質(zhì)2014年3月17日蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的層次 一級結(jié)構(gòu)：氨基酸序列 二級結(jié)構(gòu)：螺旋，折疊 超二級結(jié)構(gòu) Module, Motif domain（結(jié)構(gòu)域） 三級結(jié)構(gòu)：所有原子空間位置 四級結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)多聚體肽鏈中的肽平面蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要形式 -螺旋 ( -helix ) -折疊 ( -sheet ) -轉(zhuǎn)角 ( -turn ) 無規(guī)卷曲 ( random coil ) - 螺 旋 的 特 性氫鍵取向與主軸基本平行右旋，3.6個氨基酸一個周期，螺距0.54 nm第n個AA(NH)與第n-4個 AA(CO)形成氫鍵，環(huán)內(nèi)原子數(shù)13。氨基酸殘基側(cè)鏈可影響-螺旋的形成在多肽鏈中連續(xù)的出現(xiàn)帶同種電荷的極

2、性氨基酸，-螺旋就不穩(wěn)定。在多肽鏈中只要出現(xiàn)pro，-螺旋就被中斷,產(chǎn)生一個彎曲（bend）或結(jié)節(jié)（kink）。Gly的R基太小，難以形成-螺旋所需的兩面角，所以和Pro一樣也是螺旋的最大破壞者。肽鏈中連續(xù)出現(xiàn)帶龐大側(cè)鏈的氨基酸如Ile，由于空間位阻，也難以形成-螺旋。 -折疊的特點： 與-螺旋結(jié)構(gòu)完全不同，呈折紙狀。-折疊多肽鏈充分伸展，每個肽單元以C為旋轉(zhuǎn)點，依次折疊為鋸齒狀結(jié)構(gòu)，氨基酸側(cè)鏈交替地位于鋸齒狀結(jié)構(gòu)上下方 在兩條相鄰的肽鏈之間形成氫鏈。 -折疊有平行和反平行的兩種形式: 每一個氨基酸在主軸上所占的距離，平行的是0.325nm，反平行的是0.35nm。 -轉(zhuǎn)角（-turn）-轉(zhuǎn)角

3、: 是多肽鏈180回折部分所形成的一種二級結(jié)構(gòu)，通常有4個氨基酸殘基組成,其第1個殘基的羰基氧(O)與第4個殘基的氨基(H)可形成氫鍵。細胞色素C的三級結(jié)構(gòu)無規(guī)則卷曲是用來闡述沒有確定規(guī)律性的那部分肽鏈結(jié)構(gòu)，但許多蛋白質(zhì)的功能部位常常埋伏在這里。無規(guī)卷曲(Random coil)超二級結(jié)構(gòu)是1973年Rossmann提出的，它是指二級結(jié)構(gòu)的基本結(jié)構(gòu)單位（-螺旋，-折疊等）相互聚集，形成有規(guī)律的二級結(jié)構(gòu)的聚集體。主要有、 、等。細胞色素C的結(jié)構(gòu) 細胞核抗原的結(jié)構(gòu) 纖溶酶原的結(jié)構(gòu) 超二級結(jié)構(gòu)Up and down BarrelGFP-barrel with Greek key sheet form

4、ed structureMotifDomain蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)每個原子的空間位置，其主要研究方法是X-光衍射和核磁共振法。蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定其三級結(jié)構(gòu)。換言之，蛋白質(zhì)的三維立體結(jié)構(gòu)完全取決于其氨基酸的序列。Anfinsen （1972諾貝爾獎獲得者）用實驗證明了蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定其高級結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定三級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用，蛋白質(zhì)與核酸的相互作用，比較簡單的體系有血紅蛋白、限制性內(nèi)切酶等，復(fù)雜體系有核糖體、病毒、肌肉蛋白等。作用力 破壞因子氫鍵：-螺旋，-折疊 尿素，鹽酸胍疏水作用：形成球蛋白的核心 去垢劑，有機溶劑Van der Waals力：穩(wěn)

5、定緊密堆積的集團和原子離子鍵：穩(wěn)定-螺旋，三、四級結(jié)構(gòu) 酸、堿二硫鍵：穩(wěn)定三、四級結(jié)構(gòu) 還原劑配位鍵：與金屬離子的結(jié)合 螯合劑 EDTA維持蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的作用力蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的原則-自由能最低疏水殘基主要被包埋在蛋白質(zhì)的內(nèi)部，遠離水的作用。極性或帶電殘基主要存在于蛋白質(zhì)的表面。蛋白質(zhì)分子中的氫鍵數(shù)量被最大化。不溶性蛋白質(zhì)或膜中的蛋白質(zhì)由于它們的作用或環(huán)境遵循不同的規(guī)則，但弱的作用力對它們的結(jié)構(gòu)仍然是關(guān)鍵的作用,如：穿膜區(qū)呈螺旋結(jié)構(gòu)，側(cè)鏈外露。多聚體化是球狀蛋白質(zhì)的普遍現(xiàn)象.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系球狀蛋白質(zhì)：肽鏈為卷曲的螺旋肽鏈，鏈的折疊很緊密，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部無空穴。肌紅蛋

6、白、血紅蛋白和細胞色素c等都是研究得比較清楚的球狀蛋白質(zhì)。纖維狀蛋白質(zhì)：如絲心蛋白等的肽鏈則為一折疊的伸直肽鏈。由于肽鏈折疊或構(gòu)象的差異，所以形成這兩類蛋白質(zhì)的性質(zhì)和功能的差異。角蛋白keratin的結(jié)構(gòu)特征 Myosin膠原蛋白Collagen的特殊性Collagen分子聚合體大約 300 nm 長，1.5 nm 粗細, 由三條多肽鏈（每條多肽鏈叫alpha chain ） 互相常繞形成。每條alpha chain是 一條左手螺旋，三條多肽纏繞成 a right-handed coiled coil超螺旋。 The sequence often follows the pattern Gly

7、-Pro-Y or Gly-X-Hyp. 肌紅蛋白(Myoglobin)N 端 C端肌紅蛋白(Myoglobin) 肌紅蛋白是一個只有三級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，有8段 螺旋結(jié)構(gòu)，分別成為A B C D E F G H肽段。整條多肽鏈折疊成緊密球狀分子，氨基酸殘基上的疏水側(cè)鏈大都在分子內(nèi)部，富極性及電荷的則在分子表面，因此水溶性較好。Mb分子內(nèi)部有個袋形空穴，血紅素居于其中。His E7 and F8 are the only polar groups inside 肌紅蛋白(myoglobin,Mb)與血紅蛋白(hemoglobin, Hb)都是含有血紅素(Heme)輔基的蛋白質(zhì)。血紅素(Heme)是

8、鐵卟啉化合物，由4個甲炔基相連成為一個環(huán)形，F(xiàn)e2+居于環(huán)中。鐵離子有6個配位鍵，其中4個與吡咯環(huán)的N配位結(jié)合，1個配位鍵和肌紅蛋白的93位(F8)組氨酸殘基結(jié)合，氧則與Fe2+ 形成第6個配位鍵，接近第64位(E7)組氨酸。Porphyrin Ring: Heme GroupHis F8 (His93)Heme中Fe與O2配位結(jié)合自由的血紅素中的二價鐵被氧化成為三價鐵，不再結(jié)合氧氣。肌紅蛋白中的組氨酸能夠協(xié)助維持血紅素中鐵為二價形式，保證與氧氣的結(jié)合能力。肌紅蛋白能夠維持血紅素中鐵為二價Isolated heme binds CO 25,000 times as strong as O2.

9、Myoglobin and hemoglobin bind CO 200 times stronger than O2. Lower affinity for CO is due to steric hindrance空間位阻 of distal histidine. Effect of carbon monoxide64位（E7 ）His的咪唑N （遠側(cè)）與Fe原子距離遠不發(fā)生相互作用，但與O2分子能緊密接觸，被結(jié)合的O2夾在遠側(cè)組氨酸咪唑N和Fe（II）之間與氧的結(jié)合是一個空間位阻區(qū)域。Reversible protein-ligand interactionP + L PLAssocia

10、tion constant: Ka = PL/PLDissociation constant: Kd = 1/Ka蛋白上配體結(jié)合的比率： = PL/(PL+P) = L/(L+Kd)當(dāng) =0.5時，L=KdMyoglobin上氧氣的結(jié)合比率： =pO2/(pO2+P50),P50:O20.5 時的氧分壓肌紅蛋白的P50=0.13KPa(1mmHg) 當(dāng)在體內(nèi)毛細血管中氧分壓大于30mmHg，組織中Mb幾乎全與O2結(jié)合而達到飽和肌紅蛋白是很好的儲氧物質(zhì)。血紅蛋白(Hemoglobin) 血紅蛋白具有四個亞基組成的四級結(jié)構(gòu)，每個亞基中間有一個疏水局部，可攜帶一個血紅素并攜帶一分子氧，因此1分子Hb

11、共結(jié)合四分子氧。Hb各亞基的三級結(jié)構(gòu)與Mb極為相似。Hb亞基之間通過八對鹽鍵，使四個亞基緊密結(jié)合而形成親水的球狀蛋白。肌紅蛋白(Mb)和血紅蛋白(Hb)的氧解離曲線Hb與Mb一樣能可逆地與O2結(jié)合，Hb與O2結(jié)合后稱為氧合Hb。氧合Hb占總Hb的百分數(shù)（稱百分飽和度）隨O2濃度變化而改變。上圖為Hb和Mb的氧解離曲線，前者為S狀，后者為直角雙曲線。根據(jù)S曲線特征可知，Hb中第一個亞基與O2結(jié)合以后，促進第二及第三個亞基與氧氣的結(jié)合，當(dāng)前三個亞基與O2結(jié)合后，又大大促進第四個亞基與O2的結(jié)合。血紅蛋白的構(gòu)象變化與結(jié)合氧 協(xié)同效應(yīng)(cooperativity) 定義：一個寡聚體蛋白質(zhì)的一個亞基與其

12、配體結(jié)合后，能影響此寡聚體中另一個亞基與配體結(jié)合能力的現(xiàn)象，稱為協(xié)同效應(yīng)。 如果是促進作用則稱為正協(xié)同效應(yīng) (positive cooperativity)如果是抑制作用則稱為負協(xié)同效應(yīng) (negative cooperativity) 未結(jié)合O2時，Hb的1/1和2/2呈對角排列，結(jié)構(gòu)較為緊密，稱為緊張態(tài)（T態(tài)），T態(tài)Hb與O2的親和力小。隨著O2的結(jié)合，4個亞基羧基末端之間的離子鍵斷裂，其二級、三級、四級結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化，使1/1和2/2的長軸形成15度的夾角，結(jié)構(gòu)顯得相對松弛，稱為松弛態(tài)（R態(tài)）Hb (T態(tài))HbO2 (R態(tài))112215 T (tense) form R (relaxed

13、) form (deoxyhemoglobin) (oxyhemoglobin) Oxygen binding causes T to R transition of Hb T態(tài)轉(zhuǎn)變成R態(tài)是逐漸結(jié)合氧氣完成的，在脫氧Hb中，F(xiàn)e2+半徑比卟啉環(huán)中間的孔大，因此高出卟啉環(huán)平面0.075nm,而靠近F8位組氨酸殘基。當(dāng)?shù)谝粋€O2與血紅素結(jié)合后，使Fe2+的半徑變小，進入到卟啉環(huán)中間的小孔中，引起F肽段等一系列微小的移動，同時影響附近肽段的構(gòu)象，造成兩個亞基間離子鍵斷裂，使亞基間結(jié)合松弛，可促進第二個亞基與O2結(jié)合，依此方式可影響第三、四個亞基與O2結(jié)合最后四個亞基全處于R態(tài)。The 12 (21)

14、 contact region is designed to act as a switch between two alternative structures. 定義：變構(gòu)效應(yīng)亦稱別構(gòu)效應(yīng)，是指一個蛋白質(zhì)與它的配體結(jié)合后，蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生變化,使它更適合于功能的需要，這一類變化稱為別構(gòu)效應(yīng)。 別構(gòu)蛋白（allosteric protein）：是指具有別構(gòu)效應(yīng)的蛋白質(zhì)或酶.如血紅蛋白 別構(gòu)劑： 亦稱效應(yīng)劑,是指凡能觸發(fā)蛋白質(zhì)分子發(fā)生別構(gòu)效應(yīng)的物質(zhì)。如O2 變構(gòu)效應(yīng)（allosterism effect）Hemoglobin Transports Oxygen Efficiently by B

15、inding Oxygen Cooperatively HbO2Hb + nO2=(pO2)n(pO2)n + P50lg1-= n lg pO2 lg P50The Hill equationThe hill coefficient n is a measure of the degree of cooperativity.Hill Coefficient（Hill 系數(shù)）There is cooperation between the multiple binding sites. The degree of cooperation is quantified by this coeffi

16、cient. It is a measure of that degree to which one bound site promotes the binding of further sites. For Hb the hill coefficient can have a value from 1 to 4. For Hb, it is usually 3. For Myoglobin, the Hill Coefficient value is 1, indicating no cooperation.當(dāng)nH=1，配體結(jié)合沒有協(xié)同性；當(dāng)nH1，配體結(jié)合正協(xié)同；當(dāng)nHpI，帶負電荷；pH

17、pI帶正電荷。體內(nèi)多數(shù)蛋白pI為5.0左右，在人體體液為pH 7.45環(huán)境下，多數(shù)蛋白帶負電荷。利用蛋白質(zhì)兩性電離的性質(zhì)，可通過電泳、離子交換層析、等電聚焦等技術(shù)分離蛋白質(zhì)。 二、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)顆粒大?。涸?100nm之間。膠體，因此溶于水，成為親水膠體。 穩(wěn)定親水膠體的因素： 水化膜 表面電荷由于膠體溶液中的Pr不能通過半透膜，因此可以應(yīng)用透析法將非蛋白的小分子雜質(zhì)除去。疏水區(qū)域蛋白質(zhì)分子上的電荷與疏水區(qū)+帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負電荷的蛋白質(zhì)在等電點的蛋白質(zhì)水化膜+帶正電荷的蛋白質(zhì)帶負電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質(zhì)的聚沉蛋白質(zhì)在等電點的溶解度最小

18、pH與鹽濃度對蛋白質(zhì)溶解度的共同作用三、蛋白質(zhì)的變性、沉淀和凝固 變性（denatruation）概念: 在某些理化因素作用下，蛋白質(zhì)分子的特定空間構(gòu)象被破壞，從而導(dǎo)致理化性質(zhì)的改變和生物活性的喪失。變性本質(zhì)：二硫鍵和非共價鍵的破壞引起空間結(jié)構(gòu)的改變，不涉及一級結(jié)構(gòu)的改變。變性因素物理因素：加熱、加壓、超聲波、紫外線化學(xué)因素：胍、脲、有機溶劑、強酸強堿、-巰基乙醇、重金屬離子、生物堿試劑蛋白質(zhì)變性后理化性質(zhì)和物理性質(zhì)的改變?nèi)芙舛冉档驼扯仍黾咏Y(jié)晶能力消失生物活性喪失易被蛋白酶水解應(yīng)用舉例：臨床醫(yī)學(xué)上，變性因素常被應(yīng)用來消毒及滅菌。防止蛋白質(zhì)變性也是有效保存蛋白質(zhì)制劑（如疫苗等）的必要條件。復(fù)性（

19、renaturation）若蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質(zhì)仍可恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能，稱為復(fù)性8M尿素或-巰基乙醇透析蛋白質(zhì)沉淀(protein precipitation)在一定條件下，蛋白疏水側(cè)鏈暴露在外，肽鏈融會相互纏繞繼而聚集，因而從溶液中析出。這一現(xiàn)象被稱為蛋白質(zhì)沉淀。變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，有時蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，但并不變性。蛋白質(zhì)的凝固作用(protein coagulation) 蛋白質(zhì)變性后的絮狀物加熱可變成比較堅固的凝塊，此凝塊不易再溶于強酸和強堿中。這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的凝固作用。 由于蛋白質(zhì)分子中含有酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收峰。蛋

20、白質(zhì)的OD280與其濃度呈正比關(guān)系，因此可作蛋白質(zhì)定量測定。 蛋白質(zhì)濃度mg/ml1.45A280-0.74A260四、蛋白質(zhì)的紫外吸收（五）蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)茚三酮反應(yīng)(ninhydrin reaction) 蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反應(yīng)， 生成藍紫色化合物。雙縮脲反應(yīng)(biuret reaction)蛋白質(zhì)和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)，雙縮脲反應(yīng)可用來檢測蛋白質(zhì)水解程度。3.BCA(bicinchoninic acid)法（五）蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)（續(xù)）3.BCA(bicinchoninic acid)法 反應(yīng)試劑顏色 反應(yīng)基團

21、有此反應(yīng)的AAMillon反應(yīng)硝酸，亞硝酸紅色酚基Tyr黃色反應(yīng)HNO3及NH3 黃、橘黃 苯基 Phe,Tyr乙醛酸反應(yīng)乙醛酸，H2SO4 紫紅吲哚Trp坂口反應(yīng)次氯酸鈉,萘酚 紅色胍基 ArgFolin酚試劑反應(yīng)CuSO4，磷鎢酸-鉬酸蘭色酚基Tyr其它呈色反應(yīng)蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)分離純化的基本原則選擇好的材料摸清目的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性探索有效的抽提法和濃縮法建立一套層析的組合以較好的方法貯存 初提精純化鹽析 離子交換層析有機溶劑沉淀 分子篩層析等電點沉淀 疏水/反相層析 親和層析蛋白質(zhì)分離純化的具體方法目標(biāo)：增加制品的純度或比活，以增加單位蛋白質(zhì)重量中所需要的蛋白質(zhì)重量和生物活性。蛋白質(zhì)的

22、鹽析硫酸銨對馬血紅蛋白的溶解度的影響離子強度鹽 析鹽溶Most proteins are less soluble at high salt concentrations, an effect called salting out.For example, 0.8 M ammonium sulfate precipitates fibrinogen, a blood-clotting protein, whereas a concentration of 2.4 M is needed to precipitate serum albumin. Salting out is also usef

23、ul for concentrating dilute solutions of proteins, including active fractions obtained from other purification steps. Dialysis can be used to remove the salt if necessary. 蛋白質(zhì)的鹽析(Salting Out)透析（Dialysis）Semi-permeable membrane, such as a cellulose membrane with pores.Molecules having dimensions sign

24、ificantly greater than the pore diameter are retained inside the dialysis bag, whereas smaller molecules and ions traverse the pores of such a membrane and emerge in the dialysate outside the bag.層析-chromatographyMarch 21, 1903, Meeting of the Warsaw Society of Natural Scientists, Mikhail Semenovich

25、 Tsvet presented a lecture entitled On a New Category of Adsorption Phenomena and its Application in Biochemical Analysis. 1952年獲Nobel化學(xué)獎Martin & SyngeChromatography began to take its modern form following the work of Archer John Porter Martin and Richard Laurence Millington Synge in the 1940s and 1

26、950s. They laid out the principles and basic techniques of chromatography, and their work spurred the rapid development of several lines of chromatography methods: paper chromatography, gas chromatography, and what would become known as high performance liquid chromatography. Since then, the technol

27、ogy has advanced rapidly. 分離效果差異與理論塔板數(shù)N相關(guān) 塔板理論是色譜學(xué)的基礎(chǔ)理論，塔板理論將色譜柱看作一個分餾塔，待分離組分在分餾塔的塔板間移動，在每一個塔板內(nèi)組分分子在固定相和流動相之間形成平衡，隨著流動相的流動，組分分子不斷從一個塔板移動到下一個塔板，并不斷形成新的平衡。一個色譜柱的塔板數(shù)越多，則其分離效果就越好。 檢測器應(yīng)答好柱子差柱子理論塔板數(shù)與粒子半徑成反比因此層析載體的粒徑越小，分離效果越好。這就是為什么要發(fā)展高壓液相色譜（HPLC）蛋白質(zhì)分離純化中常用的層析分子篩層析利用分子量差異離子交換層析利用電荷差異疏水/反相層析利用親疏性差異親和層析利用特異性

28、親和物理吸附層析利用非特異性吸附分子篩層析：Molecular sieve chromatography;凝膠過濾層析:Gel filtration chromatography; 或 Gel retardation chromatography. 分子篩層析的工作原理離子交換層析原理離子交換層析的洗脫過程示意離子交換層析原理Types of ion-exchange chromatography media親和層析Affinity chromatographySmall molecules are attached to beads and complex protein mixtures

29、are applied. Bound proteins can be eluted with the small molecule or with denaturing reagents (urea, guanidine, etc.)Purification glycosylated protein with Lectins（凝集素）, such as concanavalin A 0.5-5 cm 5-100 cm實驗室用層析柱 & 工業(yè)用層析柱High pressure limits diffusion and increases interactions with chromatogra

30、phy mediaHPLC gives very high resolution of protein components高效液相色譜/HPLC- High Pressure Liquid ChromatographyHPLC基本結(jié)構(gòu)圖HPLC層析系統(tǒng)HPLC層析系統(tǒng)填充物的多孔化可以減少層析壓灌注層析示意Can be used to compare different methodologies for purification of the same proteinCan be used to standardize the purification of proteins in dif

31、ferent laboratoriesProtein Purification SchemesTotal protein. The quantity of protein present in a fraction is obtained by determining the protein concentration of a part of each fraction and multiplying by the fractions total volume. Total activity. The enzyme activity for the fraction is obtained

32、by measuring the enzyme activity in the volume of fraction used in the assay and multiplying by the fractions total volume. Specific activity. This parameter is obtained by dividing total activity by total protein. Yield. This parameter is a measure of the activity retained after each purification s

33、tep as a percentage of the activity in the crude extract. The amount of activity in the initial extract is taken to be 100%. Purification level. This parameter is a measure of the increase in purity and is obtained by dividing the specific activity, calculated after each purification step, by the sp

34、ecific activity of the initial extract. 蛋白質(zhì)分子量的確定方法超離心法: M=RTs/(1-)D 凝膠過濾: v=k + clogMSDSPAGE法: d=k + clogM光散射法: M=/Hc滲透壓法: M=cRT/Centrifugationseparating and analyzing bio-molecules determining mass and density of a molecule, learning information about the shape of a moleculeinvestigating the inter

35、actions between molecules.Sedimentation coefficients are usually expressed in Svedberg units (S), equal to 10-13 s. The smaller the S value, the slower a molecule moves in a centrifugal field. Massthe reciprocal of the particle density the frictional coefficient (a measure of the shape of the partic

36、le) Differential centrifugation - a first step in protein purificationZonal Density Gradient CentrifugationMolecules are separated by the rate at which they sediment in a density gradientThe sedimentation coefficient is a means of quantifying density sedimentation ratesMass Spectrometry (質(zhì)譜法) can ac

37、curately determine the mass of proteinsmatrix-assisted laser desorption-ionization (MALDI) the time of flight (TOF) in the electrical field is a measure of the mass (or, more precisely, the mass/charge ratio). MALDI MS 基質(zhì)輔助激光解析/電離質(zhì)譜ESI MS 電噴霧電離質(zhì)譜The Time of Flight of the protein ions is related to t

38、he mass to charge ratio of the protein ionMS/MS質(zhì)譜聯(lián)用蛋白質(zhì)的電泳 最早的電泳裝置1930年Tiselius的裝置Tiselius,1948年因電泳分離血清蛋白的工作獲得諾貝爾化學(xué)獎 垂直板電泳裝置水平式電泳裝置電泳槽幾種常用的蛋白電泳方法SDS（SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳）等電聚焦電泳雙向電泳SDS凝膠電泳Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE)A molecule with a net charge will move in an electric field. This phenomenon, te

39、rmed electrophoresis.Molecules are separated by size in an electric field. Smaller molecules migrate more rapidly through porous gel matrix起源1967年由Shapiro建立。1969年由Weber和Osborn進一步完善。他們發(fā)現(xiàn)樣品介質(zhì)和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑（SDS）以后,蛋白質(zhì)亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小,電荷因素可以忽視。Polyacrylamide is a useful polymer for gel electrophor

40、esis because both the concentration and cross-linking of the gel can be controlled.Pore size is directly controlled by acrylamide concentrantion.Acrylamide Polymerization基本原理之一陰離子去污劑SDS 破壞蛋白質(zhì)分子之間及與其它物質(zhì)分子之間的非共價鍵，使蛋白質(zhì)變性而改變其原有的構(gòu)象，并同蛋白質(zhì)分子充分結(jié)合形成帶負電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。強還原劑巰基乙醇 打開蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵使這種結(jié)合更加充分?；驹碇Y(jié)合了SDS的

41、蛋白質(zhì)在水溶液中的形狀類似于長橢圓棒，不同的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物其橢圓棒的短軸長度恒定，而長軸的長度則與蛋白質(zhì)分子量的大小成正比。這樣的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在電場作用下，其遷移率便不再受蛋白質(zhì)原有的凈電荷及形狀等因素的影響，而主要取決于其分子量大小這一因素。根據(jù)這一特點，就可以將各蛋白組分按分子量大小分開。分類 PAGE根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類. 連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中,緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。不連續(xù)系統(tǒng) 不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還

42、具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。濃縮膠 濃縮膠的作用是有堆積作用，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經(jīng)過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至一個狹窄的區(qū)帶。分離膠 孔徑較小,通過選擇合適的凝膠濃度,可以使樣品很好的分離.當(dāng)樣品進入分離膠,pH,凝膠孔徑改變,使慢離子的泳動率變大,超過蛋白,高強度電場消失.因此蛋白在均一的pH,和電場強度下通過分離膠.如果蛋白質(zhì)分子量不同,通過分離膠受到的摩擦力不同，泳動率也不同,因此能夠根據(jù)蛋白的分子量不同而分開。 凝膠由兩種不同的凝膠層組成。上層為濃縮膠，下層為分離膠。在上下電泳槽內(nèi)充以Tris-甘氨酸緩沖液(pH8.3)，這

43、樣便形成了凝膠孔徑和緩沖液pH值的不連續(xù)性。在濃縮膠中 HCl幾乎全部解離為Cl-，但只有極少部分甘氨酸解離為H2NCH2COO-。蛋白質(zhì)的等電點一般在pH5左右，在此條件下其解離度在HCl和甘氨酸之間。當(dāng)電泳系統(tǒng)通電后，這3種離子同向陽極移動。其有效泳動率依次為Cl-蛋白質(zhì)H2NCH2COO-，故C1-稱為快離子，而H2NCH2COO- 稱為慢離子。濃縮效應(yīng)之一濃縮效應(yīng)之二 電泳開始后，快離子在前，在它后面形成離子濃度低的區(qū)域即低電導(dǎo)區(qū)。電導(dǎo)與電壓梯度成反比，所以低電導(dǎo)區(qū)有較高的電壓梯度。這種高電壓梯度使蛋白質(zhì)和慢離子在快離子后面加速移動。在快離子和慢離子之間形成一個穩(wěn)定而不斷向陽極移動的界

44、面。由于蛋白質(zhì)的有效移動率恰好介于快慢離子之間，因此蛋白質(zhì)離子就集聚在快慢離子之間被濃縮成一條狹窄帶。這種濃縮效應(yīng)可使蛋白質(zhì)濃縮數(shù)百倍。 樣品進入分離膠后，慢離子甘氨酸全部解離為負離子，泳動速率加快，很快超過蛋白質(zhì)，高電壓梯度隨即消失。此時蛋白質(zhì)在均一的外加電場下泳動，但由于蛋白質(zhì)分子所帶的有效電荷不同，使得各種蛋白質(zhì)的泳動速率不同而形成一條條區(qū)帶。電荷效應(yīng)之一電荷效應(yīng)之二 與SDS結(jié)合的蛋白質(zhì)的構(gòu)型也發(fā)生變化，在水溶液中SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物都具有相似的形狀，使得SDS電泳的泳動率不再受蛋白質(zhì)原有電荷與形狀的影響。因此，各種SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在電泳中不同的泳動率只反映了蛋白質(zhì)分子量的不同。電

45、荷效應(yīng)之三 但在SDS電泳中，由于SDS這種陰離子表面活性劑以一定比例和蛋白質(zhì)結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)分子帶負電荷，這種負電荷遠遠超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷差別，從而降低或消除了蛋白質(zhì)天然電荷的差別；此外，由多亞基組成的蛋白質(zhì)和SDS結(jié)合后都解離成亞單位，這是因為SDS破壞了蛋白質(zhì)氫鍵、疏水鍵等非共價鍵。 SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍取決于用于灌膠的聚丙烯酰胺的濃度和交聯(lián)度。在沒有交聯(lián)劑的情況下聚合的丙烯酰胺形成毫無價值的粘稠溶液，而經(jīng)雙丙烯酰胺交聯(lián)后凝膠的剛性和抗張強度都有所增加，并形成SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物必須通過的小孔。這些小孔的孔徑隨 “雙丙烯酰胺丙烯酰胺” 比率的增加而變小，比率接近

46、 1：20 時孔徑達到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝膠大多按“雙丙烯酰胺丙烯酰胺”為1：29 配制，試驗表明它能分離大小相差只有3%的蛋白質(zhì)。分離范圍凝膠的篩分特性取決于它的孔徑，而孔徑又是灌膠時所用丙烯酰胺和雙丙烯酰胺絕對濃度的函數(shù)。用515%的丙烯酰胺所灌制凝膠的線性分離范圍如下表：丙烯酰胺濃度（%）線性分離范圍（kD）1512431016687.536945.057212雙丙烯酰胺丙烯酰胺摩爾比為 1：29。實驗中各成分作用聚丙烯酰胺激活劑SDS甘氨酸上樣緩沖液固定液染色劑 被激活的單體和未被激活的單體反應(yīng)開始了多聚鏈的延伸，正在延伸的多聚鏈也可以隨機地通過bis的作用進行交叉互聯(lián)成為網(wǎng)狀結(jié)

47、構(gòu)，最終多聚物聚合成凝膠狀，而其孔徑大小等特征由聚合條件及單體濃度決定。聚丙烯酰胺十二烷基硫酸鈉(SDS)SDS是陰離子型表面活性劑，它能按一定比例與蛋白質(zhì)分子結(jié)合成帶負電荷的復(fù)合物，再與PAGE技術(shù)結(jié)合，則譜帶差異更加明顯、清晰，并可測定蛋白質(zhì)分子量。SDS帶有大量負電荷，當(dāng)其與蛋白質(zhì)結(jié)合時，所帶的負電荷大大超過了蛋白質(zhì)原有的負電荷，因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異，使蛋白質(zhì)均帶有相同密度的負電荷，因而可利用分子量的差異將各種蛋白質(zhì)分開。 樣品和濃縮膠中的氯離子形成移動界面的先導(dǎo)邊界,而甘氨酸分子則組成尾隨邊界，在移動界面的兩邊界之間是一電導(dǎo)較低而電位滴度較陡的區(qū)域, 它推動樣

48、品中的蛋白質(zhì)前移并在分離膠前沿積聚。此處pH值較高， 有利于甘氨酸的離子化，所形成的甘氨酸離子穿過堆集的蛋白質(zhì)并緊隨氯離子之后，沿分離膠泳動。從移動界面中解脫后，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物成一電位和pH值均勻的區(qū)帶泳動穿過分離膠，并被篩分而依各自的大小得到分離。甘氨酸上樣緩沖液之一 蛋白上樣緩沖液(SDSloadingbuffer)是一種以溴酚藍為染料，5倍濃縮的SDS凝膠電泳上樣緩沖液,用于常規(guī)的SDS蛋白電泳樣品上樣。 蛋白上樣緩沖液分為還原型和非還原型兩種，還原型上樣緩沖液中的巰基可使蛋白分子的鏈內(nèi)二硫鍵和鏈間二硫鍵斷裂，使通過二硫鍵連接的各亞單位彼此分離，在電泳凝膠上顯現(xiàn)多個蛋白條帶，選購和

49、使用時請務(wù)必注明，仔細區(qū)分。上樣緩沖液之二注意事項 分為還原型和非還原型兩種，還原型上樣緩沖液中含一定量的DTT或巰基乙醇，有輕微刺激性氣味，較易區(qū)分； 含巰基的試劑有一定的毒性，為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。 增加樣品密度以保證蛋白質(zhì)沉入加樣孔內(nèi)，一般上樣緩沖液中加入一定濃度的甘油或蔗糖，這樣可以增加樣品的比重。 上樣緩沖液中的甘油非常重要，起增加粘度的作用，這可以阻止樣品從梳樣孔中擴散出來到電泳緩沖液中。 指示劑檢測電泳的行進過程，一般加入泳動速率較快的溴酚藍指示電泳的前沿 。 上樣緩沖液之三固定液（甲醇/冰醋酸）Carnoy固定液（甲醇：冰乙酸=3:l）甲醇：有固定、

50、硬化和脫水的作用?？梢怨潭ò椎鞍住⑶虻鞍?、核蛋白，但對核蛋白固定效果較差(親和力小且易自溶)。甲醇固定的特點是失活快，滲透力強，對組織收縮較大(可收縮20左右)，可使材料變硬。冰醋酸：純醋酸在溫度稍變低時即形成冰晶，所以又稱為冰醋酸。常用0.30.5的濃度作為固定液。冰醋酸對材料有膨脹作用，對核蛋白固定好，可與水、酒精、氯仿混合。 染色劑 考馬斯亮藍染色 0.1 g常用染色方法 銀染法 0.02 g 金屬離子染色法以考馬斯亮藍染色為例 考馬斯亮藍法測定蛋白質(zhì)濃度，是利用蛋白質(zhì)染料結(jié)合的原理，定量的測定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。 考馬斯亮藍考馬斯亮藍 考馬斯亮藍最大光吸收在488nm；當(dāng)它

51、與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍G-250結(jié)合在2min左右的時間內(nèi)達到平衡，完成反應(yīng)十分迅速；其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該法是1976年Bradford建立，試劑配制簡單，操作簡便快捷，反應(yīng)非常靈敏，可測定微克級蛋白質(zhì)含量，測定蛋白質(zhì)濃度范圍為01000gmL，是一種常用的微量蛋白質(zhì)快速測定方法。結(jié)果處理 測量并計算分子量蛋白質(zhì)的分子量與它的電泳遷移有一定關(guān)系式，經(jīng)37種蛋白的測定得到以下的關(guān)系式 Mw K(10bm) (1) lgMw = lgKbm = K1bm (

52、2) 其中MW是蛋白質(zhì)分子量；K和K1為常數(shù) b為斜率，m是電泳遷移率，實際使用的是相對遷移率mR。mR=dpr/dBPB 標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量在一定的凝膠濃度下，多肽鏈分子量的對數(shù)與多肽鏈的相對遷移率成線性關(guān)系，所以可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求未知多肽鏈分子量。實驗注意事項1. 形成凝膠的試劑要有足夠的純度：丙烯酰胺是形成凝膠溶液中的最主要成份，其純度的好壞將直接影響凝膠的質(zhì)量，丙烯酰胺可能混有的影響凝膠形成的雜質(zhì)有：線性多聚丙烯酰胺、金屬離子等。2. 注意不能隨便傾倒單體溶液（是一種神經(jīng)毒劑），應(yīng)加入過量的催化劑使其完全聚合成無毒性的聚丙烯酰胺后再棄置。3. TEMED，四甲基乙二胺中混有氧化試劑后其自身

53、極易被氧化而失去催化能力，另外TEMED的氧化產(chǎn)物呈黃色，以此可以鑒定TEMED的質(zhì)量。如果無法獲得無色透明的TEMED，只能適當(dāng)增加用量以保證聚膠速度。4. APS，過硫酸銨容易吸潮，由于它溶解于水后很快降解失去催化能力，因此潮解后的過硫酸銨會漸漸失去活性。保存固體過硫酸銨應(yīng)密閉干燥。過硫酸銨溶液宜制膠當(dāng)天配制。另外在配制凝膠溶液時過硫酸銨不易過量，否則會使蛋白質(zhì)在電泳過程中被氧化(主要指天然無變性劑凝膠)。實驗注意事項（續(xù)）5. 激活劑的用量： 激活劑的濃度適當(dāng)與否不僅可以決定凝膠聚合的速度，也將影響凝膠的質(zhì)量。增加過硫酸銨或TEMED的用量，將使丙烯酰胺聚合鏈長度縮短，凝膠會變得脆弱而失

54、去應(yīng)有的柔性。二者多至一定程度時，聚合鏈長度過短，將不會形成肉眼可見的凝膠，這些短鏈多聚物呈溶液狀，只是其粘度較聚合前高一些。實驗注意事項（續(xù)） 6. 溫度的影響： 聚膠的最佳溫度為2325 ，需要注意灌膠前單體溶液(通常置于4冰箱)及玻璃板或管(有時從烘箱取出)也要平衡至此溫度。由于溶液在抽真空時仍維持較低溫度，需待其升至室溫后再脫氣，另外升溫后脫去氧氣的速度較低溫時快。實驗注意事項（續(xù)） 7. 氧氣的影響： 氧氣會與被激活的單體自由基作用抑制聚合過程，因此需在加激活劑前對單體溶液脫氣。如果省去這一步驟，凝膠仍能聚合但需更多的激活劑，并且不能保證很好的重復(fù)性，充分去除氧氣可以用盡量少的激活劑

55、得到最佳聚合效果。通常在較好的真空度(125torr) 脫氣至少15 min 。實驗注意事項（續(xù)）8. 凝膠添加劑： 凝膠中常常加入SDS、尿素、Triton X-100等添加劑。SDS加入后不會對凝膠的聚合產(chǎn)生影響，但尿素會使凝膠孔徑變小，這一特性可用來分離小分子蛋白質(zhì)或多肽。實驗注意事項（續(xù)） 9. 聚膠時間： 雖然應(yīng)用過硫酸銨TEMED催化后灌膠1520 min即可觀察到凝膠的形成，但至少需90 min才能保證95以上的單鏈聚合成長短以及具有合適的孔徑大小。10. 單體的濃度：是指單體總重量(丙烯酰胺+bis)在溶液中的百分比(wv)，可選擇的范圍為330，單體濃度增加后聚合速度將加快，

56、因此可適當(dāng)減少催化劑的用量。實驗注意事項（續(xù)） 11. SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合按質(zhì)量成比例（即：1.4g SDS/g蛋白質(zhì)），蛋白質(zhì)含量不可以超標(biāo)，否則SDS結(jié)合量不足。12. 用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)相對分子量時，必須同時作標(biāo)準(zhǔn)曲線。不能利用這次的標(biāo)準(zhǔn)曲線作為下次用。并且SDS測定分子量有10誤差，不可完全信任。實驗注意事項（續(xù)）13. 有的蛋白質(zhì)（如：電荷異?；蚪Y(jié)構(gòu)異常的蛋白質(zhì)；帶有較大輔基的蛋白質(zhì)）不能采用該法測相對分子量。 14. 有些蛋白質(zhì)由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（-胰凝乳蛋白酶）組成的，它們在巰基乙醇和SDS的作用下解離成亞基或多條單肽鏈。因此，對于這一類蛋

57、白質(zhì)，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定的只是它們的亞基或是單條肽鏈的相對分子量。實驗注意事項（續(xù)）常見問題及處理辦法紋理和拖尾現(xiàn)象： 由于樣品溶解不佳或SDS不純引起的，克服的方法可以在加樣前離心，增加一些增溶輔助試劑如尿素。蛋白帶過寬：與鄰近泳道的蛋白帶相連是由于加樣量太多，可以減少上樣量。電泳時間比正常要長： 可能由于凝膠緩沖系統(tǒng)和電極緩沖系統(tǒng)的pH選擇錯誤。.指示劑成微笑符號（指示劑前沿呈現(xiàn)向上的曲線形）：說明凝膠的不均勻冷卻，中間部分冷卻不好，導(dǎo)致分子有不同的遷移率。.指示劑成微笑符號（指示劑前沿呈現(xiàn)向下的曲線形），由于電泳槽的裝置不合適，尤其是凝膠和玻璃板組成的“三明治”底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不完全。常見問題及處理辦法（續(xù)）6. 凝膠時間不對：通常膠在30min內(nèi)凝聚如果凝聚得太慢，可能是TEMED，APS劑不夠或者失效。7. 出現(xiàn)“皺眉”（兩邊向下中間鼓起）： 主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。常見問題及處理辦法（續(xù)）8. “鬼帶”： “鬼帶”就是在跑大分子構(gòu)象復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子時，常會出現(xiàn)在泳道頂端（有時在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞基重新締合，聚