高三生物二輪復(fù)習(xí)課件：微專題-“篩選”

1、高中生物二輪復(fù)習(xí)微專題篩選教材中涉及的4個篩選問題01含目的基因的重組 DNA 篩選02單克隆抗體制備中的篩選0304植物體細胞雜交中的篩選微生物的篩選教材中涉及的4個篩選問題目的基因與載體 DNA 正確連接的效率、重組導(dǎo)入細胞的效率都不是百分之百的。受體細胞經(jīng)轉(zhuǎn)化（傳染）或傳導(dǎo)處理后，真正獲得目的基因并能有效表達的受體細胞一般來說只是一小部分，而絕大部分仍是原來的受體細胞，或者是不含目的基因的細胞。為了從處理后的大量受體細胞中分離出含有目的基因的受體細胞，需要對受體細胞進行篩選和鑒定。1.含目的基因的重組 DNA 篩選1.含目的基因的重組 DNA 篩選一般的運載體都攜帶有標(biāo)志基因（抗藥性標(biāo)志

2、）如抗氨芐青霉素、抗四環(huán)素、抗卡那霉素等。當(dāng)培養(yǎng)基中含有抗生素時，只有攜帶相應(yīng)抗藥性基因運載體的細胞才能生存繁殖，這就把凡未能接受運載體 DNA 的細胞全部篩除掉了。如果外源目的序列插入在運載體抗藥性基因中間，使該抗藥性基因失活，這個抗藥性標(biāo)志就會消失。根據(jù)重組 DNA 的標(biāo)志來篩選，可篩選去大量的非目的基因重組體。1.含目的基因的重組 DNA 篩選【例1】圖1為某種質(zhì)粒表達載體簡圖，小箭頭所指分別為限制性內(nèi)切酶EcoRI、BamHI的酶切位點，ampR 為青霉素抗性基因，tctR為四環(huán)素抗性基因，P啟動子，T為終止子，ori 為復(fù)制原點。已知目的基因的兩端分別有包括EcoRI、BamHI在內(nèi)

3、的多種酶的酶切位點。據(jù)圖回答（1）將含有目的基因的 DNA 與質(zhì)粒該表達載體分別用EcoRI酶切，酶切產(chǎn)物用 DNA 連接酶進行連接后，其中由兩個 DNA 片段之間連接形成的產(chǎn)物有_、_、_三種。若要從這些連接產(chǎn)物中分離出重組質(zhì)粒，需要對這些連接產(chǎn)物進行_。（2）用上述3種連接產(chǎn)物與無任何抗藥性的原核宿主細胞進行轉(zhuǎn)化實驗。之后將這些宿主細胞接種到含四環(huán)素的培養(yǎng)基中，能生長的原核宿主細胞所含有的連接產(chǎn)物是_；接種到含青霉素培養(yǎng)基中，能生長的原核宿主細胞所含的連接產(chǎn)物是_。（1）目的基因載體連接物 載體一載體連接物 目的基因目的基因連接物；分離純化（2）載體載體連接物 目的基因栽體連接物載體載體連

4、接物1.含目的基因的重組 DNA 篩選【例1】圖1為某種質(zhì)粒表達載體簡圖，小箭頭所指分別為限制性內(nèi)切酶EcoRI、BamHI的酶切位點，ampR 為青霉素抗性基因，tctR為四環(huán)素抗性基因，P啟動子，T為終止子，ori 為復(fù)制原點。已知目的基因的兩端分別有包括EcoRI、BamHI在內(nèi)的多種酶的酶切位點。據(jù)圖回答（3）目的基因表達時，RNA 聚合酶識別和結(jié)合的位點是_，其合成的產(chǎn)物是_。（4）在上述實驗中，為了防止目的基因和質(zhì)粒表達載體在酶切后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意連接，酶切時應(yīng)選用的酶是_。（3）啟動子 mRNA （4）RcoRI 和 BamHI2.單克隆抗體制備中的篩選（1）第一次篩選B 淋巴

5、細胞在與骨髓瘤細胞融合后可得到三種類型的融合細胞，即 B 淋巴細胞與B 淋巴細胞融合成的融合細胞、B 淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合形成的雜交瘤細胞、骨髓瘤細胞與骨髓瘤細胞融合成的融合細胞，第一步篩選的目的是從三種融合細胞中把雜交瘤細胞篩選出來。2.單克隆抗體制備中的篩選第二次篩選與骨髓瘤細胞融合的 B淋巴細胞不只是一種，融合后可得到多種雜交瘤細胞，本次篩選的目的從多種雜交瘤細胞篩選出能夠產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細胞，再進行細胞培養(yǎng)?！纠?2】已知細胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基嘌呤阻斷。人淋巴細胞中有這兩種 DNA 的合成途徑，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤細胞中盡管沒有S途徑，但能不斷

6、分裂增殖，將這兩種細胞在試管中混合，加聚乙二醇促融，獲得雜種細胞。請回答;（1）試管中除融合的雜種細胞外，還有_種融合細胞。（2）設(shè)計一方法（不考慮機械方法），從培養(yǎng)液中分離出雜種細胞，并說原理。方法_。原理_。2.單克隆抗體制備中的篩選（1）2（2）培養(yǎng)液中加入氨基嘌呤，收集增殖的細胞 加入氨基嘌呤后，使 D合成途徑阻斷，僅有 D合成途徑的骨髓瘤細胞及其彼此融合的細胞就不能增殖，但人淋巴細胞和骨髓瘤細胞融合后的雜種細胞中可以利用淋巴細胞中的 S 途徑合成 DNA而增殖.【例 3】 圖2是單克隆抗體制備流程階段示意圖。2.單克隆抗體制備中的篩選 (1)_技術(shù)是單克隆抗體技術(shù)的基礎(chǔ)。（2）單克隆

7、抗體與常規(guī)的血清抗體相比。最大的優(yōu)越性是_。（3）動物細胞融合除了采用植物細胞原生質(zhì)體融合常用誘導(dǎo)劑外，還可以采用_。動物細胞培養(yǎng)特異性強，靈敏度高滅活的病毒【例 3】 圖2是單克隆抗體制備流程階段示意圖。2.單克隆抗體制備中的篩選（4）選出的雜交瘤細胞既具備骨髓瘤細胞的_特點，又具備淋巴細胞的_特點。（5）上圖中的某些淋巴細胞是指_。能大量增殖分泌特異性抗體效應(yīng)B細胞（漿細胞）植物體細胞雜交中涉及不同植物原生質(zhì)體的融合。在融合細胞中有同種和異種融合兩種類型，因此涉及對雜種細胞的篩選和培養(yǎng)。如煙草與大豆的原生質(zhì)體融合后，將原生質(zhì)體轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上培養(yǎng)，使原生質(zhì)體再生出細胞壁。這時，在細胞混

8、合物中，不僅有煙草大豆雜種細胞，還有煙草細胞、大豆細胞、煙草煙草細胞、大豆大豆細胞。雜種細胞的篩選，可用機械方法，也可用生理學(xué)或遺傳學(xué)的方法。以機械方法為例，根據(jù)兩種親本細胞在形態(tài)、色澤上的差異，將細胞分別接種在帶有小格的培養(yǎng)皿中，每個小格中約放 13個細胞。在顯微鏡下找出雜種細胞，并且標(biāo)定位置。等雜種細胞分裂成細胞團時，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)成愈傷組織。3.植物體細胞雜交中的篩選具體的說，在植物體細胞雜交中雙親原生質(zhì)體經(jīng)融合處理后產(chǎn)生的雜合細胞，一般要經(jīng)含有滲透壓穩(wěn)定劑的原生質(zhì)體培養(yǎng)基培養(yǎng)（液體或固體），再生出細胞壁后轉(zhuǎn)移到合適的培養(yǎng)基中。待長出愈傷組織后按常規(guī)方法誘導(dǎo)其長芽、生根、成苗。在此

9、過程中可對是否雜合細胞或植株進行鑒別與篩選。 雜合細胞的顯微鏡鑒別根據(jù)以下特征可以在顯微鏡下直接識別雜合細胞3.植物體細胞雜交中的篩選以互補法篩選雜合細胞白化互補不同基因的白化突變株出 aBxAh，可互補為綠色細胞株 AaBb。生長互補甲細胞株缺外源激素 A不能生長，乙細胞株需要提供外源激素 B才能生長，則甲株與乙株融合，雜合細胞在不含激素 A、B的選擇培養(yǎng)基上可能生長?？剐曰パa篩選假如某個細胞株具某種抗性（抗青霉素）另一個細胞株具另一種抗性（如抗卡那霉素），則它們的雜合株將可在含上述兩種抗生素的培養(yǎng)基上再生與分裂。這種篩選方式即所謂的抗性互補篩選。代謝互補篩選根據(jù)碘代乙酚胺能抑制細胞代謝的特

10、點，用它處理受體原生質(zhì)體，只有融合后的供體細胞質(zhì)才能使細胞活性得到恢復(fù)等。采用細胞與分子生物學(xué)的方法鑒別雜合體：經(jīng)細胞融合后長出的愈傷組織或植株，可進行染色體核型分析、染色體顯帶分析、同功酶分析以及更為精細的核酸分子雜交、限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性和隨機擴增多態(tài)性 DNA（RAPD）分析，以確定其是否結(jié)合了雙親本的遺傳素質(zhì)。根據(jù)融合處理后再生長出的植株的形態(tài)特征進行鑒別。3.植物體細胞雜交中的篩選【例4】現(xiàn)有甲、乙兩個煙草品種（2n=48），其基因型分物為aaBb和 Aabb.這兩對基因位于非同源染色體上，且在光照強度大于800 lx 時，都不生長，這是由于它們中的一對隱性純合基因（aa 和

11、bb）作用的結(jié)果。取甲、乙兩品種的花粉分別培養(yǎng)成植株，將它們的叫醫(yī)細胞制成原生質(zhì)體，并目將兩者相混，使之映合誘導(dǎo)產(chǎn)生細胞團。然后放到大于 80O lx光照下培養(yǎng)，結(jié)果有的細胞團不能分化，有的能分化發(fā)育成植株。請回答下列問題（1）甲、乙兩個煙草品種花粉的基因型分別為_和_。（2）在大于 800lx光照下培養(yǎng)，有_種細胞團不能分化，能分化的細胞團是由_的原生質(zhì)體融合而來的（這里只考慮兩個原生質(zhì)體的相互融合）。由該細胞團分化發(fā)育成的植株，其染色體數(shù)是_，基因型是_，該植株自交后代中，在大于800lx光照下，出現(xiàn)不能生長的植株的概率是_。3.植物體細胞雜交中的篩選aBAb2甲 乙兩品種48AaBb7/

12、16借助選擇培養(yǎng)基，依據(jù)不同類型微生物的特性，通過改變培養(yǎng)基的成分來實現(xiàn)篩選出人類需要的某種微生物。選擇培養(yǎng)基介紹：例如：從大腸桿菌群中用不含蘇氨酸的選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)蘇氨酸營養(yǎng)缺陷型時，只有少數(shù)變異恢復(fù)型才能生長。在含鏈霉素的培養(yǎng)基中，若接種對鏈霉素敏感的大腸桿菌，則只有混在其中的少數(shù)對鏈霉案有抗性的菌株才會生長。如在培養(yǎng)基中添加高濃度的食鹽可以抑制多中細菌的生長，而不影響金黃色葡萄球菌的生長，從而可將其篩選與分離出來。4.微生物的篩選【例5】 某同學(xué)在做微生物實驗時，不小心把圓褐固氮菌和酵母菌混在一起，請你設(shè)計實驗分離得到純度較高的的圓褐固氮菌和酵母菌的實驗步驟，并回答有關(guān)問題（1）主要步驟 制備兩種培養(yǎng)基一種是_培養(yǎng)基，另一_的培養(yǎng)基。分別分成兩份，依次標(biāo)上 A，A/的B，B/，備用。分別向 A、B培養(yǎng)基中接種_。接種