生物實驗室日常小技巧集錦

1、平時在最常聽到的一句話就是“今天某某試驗沒做好是為什么？今天某某試驗沒出結(jié)果是什么原因？今天某某試驗為什么會是這樣的呢？” 等等。然后仔細一查找原因，往往是由于操作上面的不認真，或是一些小小的細節(jié)沒有注意到。以下是集各路朋友的一些經(jīng)驗，與大家：1 跑page 膠的時候，小電壓跑會避免高電壓產(chǎn)生的熱量爾導(dǎo)致的膠層變形。低電壓泳道會比大電壓泳道跑的直一些，且分離效果更高，有利于分子量相差不大的蛋白分離。2. 提取質(zhì)粒的時候，最后一步的揮發(fā)很關(guān)鍵，基本上是其后續(xù)的酶切反應(yīng)的決定性。所以這一步盡量揮發(fā)長一點時間，最好是空調(diào)吹熱風(fēng)，或是 37度溫箱放長一點的時間，我試過室溫過夜，酶切很好。3. 做WES

2、TERN BLOT 的時候，大家往往會摸索一抗、二抗的濃度，封閉時間，時間等等，而每次變換其中的一個條件就需要從新跑膠、轉(zhuǎn)膜，甚至重新提蛋白，這樣會浪費大量的時間。其實完全沒有必要這樣。一次轉(zhuǎn)膜后，將 PVDF膜晾干，裁減成小塊，保存起來，用的時候取出一塊，沒有任何影響。這對于摸索條件的戰(zhàn)友來說，節(jié)約了大量的時間。4. 有關(guān)緩沖液和培養(yǎng)基配置1）將緩沖液配方中的成分分別以 10100 倍配成母液相應(yīng)的母液混合，補加水稀釋即可，需要的時候只需將2）配培養(yǎng)基時通常會忘記各成分的量，如配LB 時的三個成分不記得到底哪個是 5g，哪個要 10 個，因此可以在常用的試劑瓶的上注明所需的量，如配 LB時，

3、在 NaCl 瓶外注明 10g/L, yeast 5 g/L, tryton 10 g/L 等，很方便，不需要每次配之前臨時翻書5. 有關(guān)PCR 主反應(yīng)液配置:在做克隆鑒定的時候經(jīng)常需要在酶切鑒定前進行 PCR 鑒定，每次配置 PCR 反應(yīng)液很繁瑣，可以將其配置類似kit 的形式，按你需要的反應(yīng)體系列表，然后放大100 倍配置 100主反應(yīng)液（100 次反應(yīng)），其中含buffer，Mg2，dNTPs，但不含引物和Taq 酶，然后可以 10分裝或一管在20 度，在需要的時候拿出融開，然后按所需的 PCR 反應(yīng)個數(shù)吸取相應(yīng)的倍數(shù)，再補加相應(yīng)反應(yīng)倍數(shù)的 Taq和引物，混勻后分裝，這樣做的好處如下：1

4、）可極大的節(jié)省寶貴的時間，可早點收工，看球避免每次反應(yīng)加樣不均的可能大大減少PCR 假陽性的產(chǎn)生6. 有關(guān)酶切反應(yīng)液的配置:在做酶切時，也可以象 PCR 一樣配置主反應(yīng)液，每次反應(yīng)前先列好反應(yīng)的體系，算好需要的反應(yīng)數(shù)，然后按所需反應(yīng)的體系按所需反應(yīng)數(shù)放大，加入 buffer、酶、水，質(zhì)粒欄空缺，然后混合后按除質(zhì)粒 DNA 的體積分裝，然后再在每管中加入相應(yīng)體積的質(zhì)粒 DNA 酶切，這樣做的好處如下，特別是當(dāng)同時有 10 幾個陽性克隆需要鑒定時尤為明顯：各反應(yīng)成分均一可大大減少限制型內(nèi)切酶的使用節(jié)省時間7. 有關(guān)SDSPAGE：1）可將SDSPAGE 的積層膠，分離膠預(yù)先配好大體積如 100ml

5、在 4箱（注：10AP，TEMED 不加，切記?。?，每次配置時只需吸取相應(yīng)體積的預(yù)制膠加入 AP，TEMED 即可，沒必要每次制膠時候翻分子克隆，特別方便，而且，這樣的預(yù)制膠可半年以上，不失為偷懶的絕佳方法；更關(guān)鍵的是可大大減少與酰胺的接觸，因此大大減少的機會。2）電泳時雖然小電泳分離效果要好一些，但 2 小時以上的等待的時間實在是痛苦，因此可以提高電泳至 150V，但需要將整個電泳槽放在放滿冰水的臉盆里散熱，這樣跑出來的膠分離效果絲毫不比低電壓來的差，關(guān)鍵是時間，不需 1h 即可看結(jié)果了8. 實驗中小竅門一些省時省事能夠分成兩類：一類是“非常規(guī)”操作；一類是常規(guī)操作過。前一類，我舉個例子：有

6、時候第一天涂的轉(zhuǎn)化平板、次日早晨轉(zhuǎn)化子可能長成的菌落比較大（12 毫米以上，BL21 就長得快），下一步轉(zhuǎn)化子做質(zhì)粒鑒定。這個情況下可以直接挑取一塊菌苔（勿帶出培養(yǎng)基），50 微升酚/氯仿懸浮菌體，放置兩分鐘，加 40 微升TE 抽提，上層TE 吸出后再氯仿抽提一次，吸取上層 TE 即是質(zhì)粒提取液。提取的質(zhì)粒可以直接用于電泳和酶切。這樣操作，可以省去轉(zhuǎn)接液體試管的培養(yǎng)步驟，至少節(jié)省 68 小時的時間。但是，要在各步驟都控制得很好的情況下才能保證提取和酶切的效果，不同的或者操作者未必能夠很方便地重復(fù)其實，其它的一些“小竅門”也是如此。后一類的小竅門則在中無處不在。如：平行作不同樣本的 PCR,模

7、板 DNA加量一樣，配置PCR 體系可以一起配制后分裝這點做過試驗的都知道，但是配制的時候配制量可以比預(yù)期分裝量稍多一點（如用 100 微升則配 110 微升），這樣可以避免有時候分裝不夠的尷尬，因為不同特別是大小不同的槍，會有誤差。再比如：樓上有站友說的 sds膠預(yù)配（APS 和TEMED、或者后者先不加），實際上時間放置過長肯定影響效果，如果要在一天內(nèi)連續(xù)地跑兩次板，可？又比如，配 sds膠的時候，上層膠和下層膠可以只用一個大槍頭：先取膠，次取水，取 6.8 的tris 后再取 8.8 的tris，省時省料。20021108 站友開的這個帖子很好，在上上層樓的帖子說得也有道理。但，“竅門”

8、和“偷懶”不應(yīng)該是因果關(guān)系。其實，不管是那一類的小竅門，都是在充分地理解實驗各步驟的原理、經(jīng)過多次試驗積累、再加上一點點思索然后嘗試的結(jié)果。知其然知其所以然和勤于思考敢于探索，是根本。否則，別人的小竅門對你也未必能夠有用。才進的新手，務(wù)必要先練好規(guī)范扎實的操作，然后才能弄“竅門”。本末倒置，貽害無窮。9. 我一直是把SDSPAGE 的積層膠，分離膠預(yù)先配成mixture，APS 制膠時加入，半年內(nèi)使用，絕對沒有問題，我保證。10. 做SDS的時候，除了蛋白量上樣一致，最好體積也一致，這樣跑出來的膠各個泳道之間的band 能做到一樣寬，方便后面的比較，特別是 WB。做法就是拿 1X 的上樣緩沖補

9、全要加的樣做到體積一致，否則跑出來會有的寬有的窄，特別是上樣體積相差較大的。11. 在把蛋白膠做成干膠時，很多時候會因為有氣泡使膠裂掉，經(jīng)驗是在做膠時加上層膜前在膠上多加些水就不容易進氣泡了，還有就是高溫烘膠，我喜歡放到 60 度烘箱里烘，這樣水分蒸發(fā)速度快，即使有一些小的氣泡也不會有影響，呵呵，這是經(jīng)驗之談，我從來都沒失手過，大家可以試試12. 做大腸表達時確定蛋白是否表達一般要煮樣做誘前誘后檢測,但很多時候煮出來的很黏影響跑膠效果.我發(fā)現(xiàn)如果現(xiàn)用 8M Urea 重懸細菌再煮效果會有極大改善.注:不能用 Gu-HCl 代替13. 我也幾個偷懶的方法1 做SDS跑膠通常都是現(xiàn)配現(xiàn)用,但配膠要

10、1h,所以如果想第二天睡個懶覺而又不耽誤跑膠可以于前一天晚上做好濃縮膠和分離膠,待凝聚后不要拔下梳子,把含膠玻璃板從制膠槽取下,用保鮮膜包上,注意玻璃板上下兩邊緣會有氣體,所以需要加一點電泳緩沖液以避免膠內(nèi)水分蒸發(fā).然后放 4 度過夜.第二天直接拔下梳子行后續(xù).國外好多公司出售腳既是如此,可以保存上.2 配置分離膠或者非變性膠時因膠凝時收縮可導(dǎo)致加樣孔變淺.可以將加剩的膠放入 4 度以降低凝聚速度,而將凝膠放入 37 度促聚,并隨時用 4 度加剩的膠補充下降的膠面.另外將膠橫放與水平面成10 度角也可以減少收縮的影響.3一個節(jié)約抗體/時間的做法:同時跑 2 塊膠,同時轉(zhuǎn)膜,然后兩塊膜背靠背放入

11、同一膜同時封閉,同時一抗二抗(最好是用轉(zhuǎn)輪,這樣效果好.如果是搖床,隔一段時間幫它們翻個身以保證兩張膜的正面都有機會與液體充分接觸.一起洗膜(可以稍微加強洗膜也可以不做.我最多一張盤子里放4而沒有影響洗膜).可分別或同時壓片.這樣就可以節(jié)約一半抗體和接近一半時間而不會影響結(jié)果.或者另外一個就是孵育后的抗體不要扔,好的抗體可以反復(fù)做好幾呢.但每次都會減弱,效果不如上面法.14.做 western blotting 轉(zhuǎn)膜時，膠放在轉(zhuǎn)膜緩沖液中一段時間，待膠在含有甲醇的緩沖夜中縮小的差不多后裝好轉(zhuǎn)膜裝置經(jīng)驗是把膜印在膠上直接在膜上畫出預(yù)染maker 條帶，方便的很。因為很多時候跑電泳時膠上的預(yù)染 m

12、aker 很清楚，等轉(zhuǎn)膜后就不是分辨的很清楚了。不過要注意畫好預(yù)染 maker 后就不要使膠和膜發(fā)生對位移動了，以防m(xù)aker 失去參照價值。超濾最合適用于蛋白的濃縮，更換緩沖液和除鹽，對于按照分子量進行初分離的效果不是很好，理論和現(xiàn)實是有很大差別的_關(guān)于Western Blot 1）器具的清潔非常重要，開始做前，為了安全，尤其是裝膠的厚薄玻璃板，可以先用中性洗滌劑和自來水反復(fù)沖洗，確保無洗滌殘液后用蒸餾水沖洗 23 遍，然后用去離子水沖洗一遍。最后用 95再擦一遍后晾干備用。2）配膠最好現(xiàn)用現(xiàn)配，先配下層膠（分離膠），后配上層膠（濃縮膠或積層膠），而且在臨灌膠前加 APS 并迅速混勻，即用移

13、液槍抽吸與注入 12 次即可。17 跑蛋白page 的時候，一開始用加樣針，太麻煩，發(fā)現(xiàn)用 20ul 槍+普通槍頭點，非常省事。另外，點樣時有可能看不清孔在哪，看遠離你的那面膠，反光的。點樣也點你對面的那塊膠，省的總低頭，干咱這行的容易得頸椎呀，愛惜自己。18. 垂直電泳時，可在電泳糟中放入青霉素小瓶等，可自然使液面提高而不影響電泳，又很節(jié)約電泳緩沖液。19.有時要沉淀東西時，由于沉淀量很少，離心完之后不知道到底有沒沉淀下來東西，由于量很少，不好觀察，所以離心時建議按特定的方向放置離心管，這樣你就可以在離心之前確定沉淀該沉淀到管子的大致部位，這樣離心后就可直接觀察那有沒有沉淀，避免滿管子找，另

14、外看沉淀時可以對光看，這樣就是顆粒狀的細小沉淀也能看見的。20. 大家都知道PMSF 有劇毒，以前都是知道濃度和要配的體積的基礎(chǔ)上,算出要稱多少毫克的PMSF,其實也可以先稱PMSF,稱多少算多少,再調(diào)整異丙醇的體積，到達你所要的濃度。這樣就避免了你長時間和它接觸。21. 跑好SDS膠的一些體會。1.好玻璃板，不要偷懶，很多時候跑完電泳撬膠時會因為玻璃板不干凈膠粘在板上把膠撬破。2. 配膠時不要反復(fù)用槍混，稍微搖混就可以了，用槍混多次會導(dǎo)致膠凝不好影響電泳圖的分辨率。AP 分裝成 500 微升一管保存放-20 度，避免 AP 用太久失效。倒膠時把玻璃板中的水用濾紙盡量吸干，因為微量的水存在會影

15、響配的膠濃度。盡量不用過夜放室溫或者四度的膠，也回影響膠 的分離效果。電泳完撬膠時根本不需要用撬膠板，在一平皿里裝好水，把有膠一面的放在水中晃動幾次膠很容易就脫落下來，一點沒有問題，方便的很。點樣時樣品別忘了離心這步，因為上樣含有固體沉淀會影響電泳圖分辨效果。盡量在冰浴狀態(tài)下跑。22. 做做的比較多，總結(jié)了幾個小竅門：一向電泳時，鹽離子容易聚在膠槽的兩側(cè)剪一小段膠條放在兩側(cè)，鹽橋，電壓就容易上去了避免一向電泳不好影響最后實驗結(jié)果 SDSPAGE 時,在灌膠之前,一般大家都會用凡士林封底, 在SDSPAGE電泳之前又必須把凡士林搽干凈,很是麻煩,經(jīng)驗是:不用凡士林,取少量未加Ap 的分離膠,按比

16、例加2 倍量的 Ap,然后灌入板間,等上幾分鐘,待膠凝固后就可以接著灌分離膠了.方面,效果好!蛋白質(zhì)純化時，蛋白質(zhì)降解可能與超聲破菌保持冰浴有關(guān)，之前建議加 pmsf，建議在上柱子洗脫的時候也加pmsf（蛋白降解抑制劑），一定要用之前再加。做透析的時候，拿一個 5ml 的槍頭或者是其他類似的東西，剪短，穿過個塑料之類的面積比燒杯大東西，然后把透析帶一端扎緊，另一端開口綁緊在5ml 槍頭下端，扎緊得那端也可以彎過來綁成 u 字型。這樣就可以用 1ml 的槍穿過 5ml 的槍頭的孔，另一只手調(diào)整透析帶，來加樣取樣，省去了總綁透析帶的麻煩，對同一個蛋白大量多次透析非常方便25. 第一次發(fā)貼說一下自己

17、的小經(jīng)驗，希望版主能給我一分，每次看到好東西因為沒分都沒法下，好羨慕有分的人啊。當(dāng)然也不能不勞而獲，說一下自己的實驗技巧給大家。1. 配SDS膠時，用槍頭混勻比較麻煩，而且費時費力，效果也不好?？梢约粢恍《螉A文件的那種曲針做轉(zhuǎn)子放到配膠的小燒杯里，在磁力攪拌器上邊攪邊加入各溶液，這樣加完也就混勻了，直接灌膠即可。2. 上面的站友也，上樣用黃槍頭就行，我也一直在用，根本不用注射器，方便的很，建議大家也試試。3.電泳后考馬斯亮藍染色一般要 1h 到 2h，脫色也要 2h 左右，麻煩的很?，F(xiàn)在給大家說一個簡單的方法，是我從一個師姐那里學(xué)到的。加入染色液后，先放入微波爐里加熱 5-10 秒，使染色液微

18、熱即可（千萬不要加熱太久，否則冰醋酸就揮發(fā)了）。然后放水平搖搖 20 分鐘，最多就染好了。脫色也很簡單，不用脫色液，直接用去離子水，放微波爐里煮沸 5 分鐘左右，然后將水倒掉，上新的去離子水煮，這樣反復(fù)幾次，就可以了。效果可能比正常的脫色稍差一點點，不如那樣清楚，只要電泳時比平時多上 1/5 的樣品就可以了，關(guān)鍵是這樣省時省材料（用不著含甲醇和冰醋酸的脫色液）。方便快捷！放心，反復(fù)煮膠不會把膠煮壞的。26. 我也說說小經(jīng)驗?？赡艽蠹叶贾?，請別笑話我。1、配膠時一定要掌握好時間，不要因為過度趕時間，而造成以后的條帶粗大，壓不成條帶，且消耗很多試劑和時間。2、加樣時，沖洗加樣器可許是因為SDS

19、的原因吧？蒸水，用電泳液會使加樣器中有很多的?；?、對于大分子蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜過夜更好。濾紙的可以適當(dāng)減少。4、在跑樣時同時加入 MARKER 有助于正確識別所需的蛋白位置，減少 NC 膜的消耗。5、一抗、二抗的濃度不要太高。6、做 ECL 顯影時，根據(jù)熒光的亮度調(diào)整時間。泡完顯影液，膠片應(yīng)用水洗一下，以減少定影液變黃。7、和有經(jīng)驗的同學(xué)交流，也是非常重要的。知識的交流絕對有助于試驗的成功。這是我目前的一點拙見。27.一個省質(zhì)粒試劑盒硅與溶液的方法：所有試劑使用手提質(zhì)粒自己配置的溶液一、溶液二、溶液三（代替試劑盒的solution1、2、3），然后一比一的與飽和碘化鉀或碘化鈉（代替結(jié)合緩沖液）混合

20、，就可以讓質(zhì)粒在硅膠上結(jié)合，而試劑盒的硅可以重復(fù)使用，沒有試劑盒溶液量的限制，只要是一樣的質(zhì)粒提幾管就提多少。順便說一句硅也可以用自己買的硅膠粉末代替，離心后倒掉硅上面的上清就可以，用起來不象柱子方便。效果比手提的要好要快。28. 做 WB 時,樣品比較多, 又怕放時間長了對蛋白樣品不好,而且確定以后肯定要做某個抗體,只是一時沒有決定.那么你可以選擇先做SDS,并轉(zhuǎn)膜. 然后把PVDF 膜涼干, 放四度保存. 以后拿出來封閉后,加抗體就行了. 蛋白在膜上,且已經(jīng)分離, 比保存在BUFFER 里面的蛋白肯定更可靠。呵呵29. 今天作his 純化的時候，又琢磨了一個竅門，與大家。我得樣品比較多，幾

21、百ml，而柱子不夠大，只有 10 幾ml，跑來跑去的上樣，還總得記著，太麻煩了。于是，我就刷干凈了一個燒杯，裝了樣品，找了一個細膠皮管，當(dāng)連通器，就像魚缸換水一樣，用 5ml 槍在一頭一吸，液體流出來，放到純化柱里，調(diào)好燒杯的位置，兩個液面一樣平了，呵呵，上了好幾個小時了，沒有問題，現(xiàn)在調(diào)低速度，過夜上樣：）30. 能導(dǎo)致PAGE 膠不凝的原因主要有三個：1、配膠中用到的主要試劑的配置。主要就是 30的酰胺的配置。粉末狀的酰胺和甲叉酰胺使用不應(yīng)該超過一年，因為酰胺會吸潮水解，這樣以來丙烯酸的含量就會加大，從而導(dǎo)致page 膠不凝。2、溫度。溫度高時凝固快，但是亦不宜過高，因為溫度變化會影響交連

22、物的孔徑大小。所以溫度在 25 度最為合適。3、氧氣。氧氣是凝固的終止劑，所以不能讓膠中出現(xiàn)氣泡。雖然都是些看起來聽低級的錯誤，但是不注意還是會犯。31. 我做 2 維蛋白電泳，也有些心得：1、向電泳玻璃板內(nèi)加入膠條時，先在縫隙中加入配好的溴芬蘭緩沖液，要加滿，再將膠條貼后面玻璃板壁用薄片將膠條緩緩?fù)葡轮聊z上緣，這樣可以很好的避免膠條下形成空氣泡。2、能做出好的圖譜已經(jīng)很不容易了，如果在掃圖時撕破實在可惜，所以掃圖要，將凝膠轉(zhuǎn)移到掃描儀時可以用隔片在下面托著，同時保持有些水，這樣就安全多了。32. 湊個熱鬧吧1、sds膠如果配好裝好倒入內(nèi)槽液以后，發(fā)現(xiàn)內(nèi)槽液稍有滲漏，可以把外槽液多加一些，加

23、滿，加到與內(nèi)槽液相齊，這樣就可以繼續(xù)正常跑膠，不用浪費已經(jīng)加進去的內(nèi)槽液2、至于染色脫色，這里一直是染色：加熱半分鐘，搖 20 分鐘；如果染液不是新配的，就加熱半分鐘搖十分鐘，涼透了再重復(fù)一次即可脫色也一直是用去離子水煮兩三次即可3、不知道大家都是怎么做酶切的，體會是，酶切質(zhì)粒時，兩個酶分別單酶切比直接雙酶切效果要好很多。我有一次雙酶切兩次都沒連出來，后來分步單酶切，連接效率幾乎 100%?？梢缘谝粋€酶切完后直接把體系熱失活，（根據(jù)酶說明書上一般是 65 度 20min）然后直接向里面補第二個酶或者第一個切完后用氯仿抽提，把蛋白提出或者中間做一次回收，這個就要考慮回收效率和損失了，但是這樣除蛋

24、白最徹底前兩個方法這都是有人做過的，已經(jīng)都很好用了33. 俺也來說說關(guān)于Bradford 法蛋白濃度定量和DTNB 法巰基濃度定量的一點體會：我是做蛋白修飾巰基后，通過這兩種方法的定量來間接反應(yīng)修飾的程度。一路摸索過來，也有半年有余；最大的體會就是不要急于求成，直接實驗，首先檢測修飾體系是否對方法有影響，修飾基團是否會在 595nm 和 412nm 下有特定的吸收，修飾后修飾試劑本身是否會有變化，對蛋白整體結(jié)構(gòu)造成影響，其次再談具體修Biochem. 1998 Dec飾比例和程度。對于巰基濃度測定方法，有四種（1;265(1):8-14），而 DTNB 本身雖然靈敏度不高，但是重復(fù)性和了。是最

25、佳的34. 考馬斯亮藍染色后的脫色，如在脫色液中加數(shù)張捏成條狀的 Kimwipes 紙（國外常用，相當(dāng)?shù)牟羚R紙，全棉制造），由于吸附到紙上，脫色加速。待紙較深時，更換新紙條，不用換液。脫脂棉或紗布也是一樣的。但濾紙等可能，會溶掉。半貼壁細胞如SP/0 或雜交瘤細胞傳代時，不用吹打或刮落。先將上清吸出，適當(dāng)拍打培養(yǎng)瓶（當(dāng)然是瓶，玻璃瓶拍碎了別找我），即可見貼壁細胞脫落，加培養(yǎng)基混懸即可。注意，過力拍打培養(yǎng)瓶會裂，特別是瓶頸。35. 一向電泳時，鹽離子容易聚在膠槽的兩側(cè)剪一小段膠條放在兩側(cè)，鹽橋，電壓就容易上去了避免一向電泳不好影響最后實驗結(jié)果36. 我也幾條：1、關(guān)于 20021108 戰(zhàn)友的說

26、法，我覺得好了一批感受態(tài)，最好馬上轉(zhuǎn)化一種已知質(zhì)粒，與此同時，取一點感受態(tài)接種到含抗性的固/液體培養(yǎng)基培養(yǎng)來做對照。這樣第二天即可以知道這批感受態(tài)是否還有外源質(zhì)粒，又可以知道這批感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率的高低。如果合格，那以后就可以放心使用！因為我也曾經(jīng)遇到其實是因為感受態(tài)不好而導(dǎo)致試驗不成功，但是當(dāng)時不知道，結(jié)果費時費力。2、做克隆挑斑時，可以在將沾有菌體的牙簽丟到試管前，在一塊相應(yīng)抗性的平板上點一下，標注清楚，培養(yǎng)時間稍長一點，待長成較大菌收取。以后需要哪一個菌,就在平板上挑取。這樣既方便快捷，又可以保證菌的一致。3、抽提質(zhì)粒時，加入Sloutio和III 后要求輕柔混勻。我個人覺得不用這樣，只要不

27、是非常劇烈，可以快速混勻。尤其可以運用在一次抽提多管質(zhì)粒的時候，這樣可以快速，而且效果一點也不差。4、抽提質(zhì)粒時，用無水乙醇沉淀的時間可以由實驗操作者來決定，如果時間充?？梢?30min，否則 8-10min 也可以。至于溫度，個人覺得-20 度好于常溫。如果加入可醋酸鈉，會較容易形成鹽類雜質(zhì)，所以時間短一些更好！今天想到這些，先寫到這里，以后想到了在上來與大家。希望小經(jīng)驗對大家有所幫助！37. 首先：實驗中的一些技巧要用在首先對基本的操作有深刻了解的基礎(chǔ)上，在力求省時、省力、節(jié)約成本等的同時，實驗的準確性是最重要的。對大多數(shù)做蛋白的戰(zhàn)友們來說，培養(yǎng)細胞應(yīng)該是不陌生的，我這里談一個培養(yǎng)細胞的小

28、技巧，大家知道，對于一定的空間（如某種尺寸的細胞培養(yǎng)瓶）來說，細胞數(shù)目太多或者太少都不利于其生長，太多了就要消化，太少了要換一個小點兒的培養(yǎng)瓶，做法是：如果細胞數(shù)目太少，可以不必去找小一點兒的培養(yǎng)瓶，可把原來的培養(yǎng)瓶由原來的平放改為豎著放，這樣底部的空間就小了，有利于細胞的生長，當(dāng)細胞數(shù)目增加到一定程度的時候還可以在平過來，避免了來回換培養(yǎng)瓶而增加污染的機會（對沒有小培養(yǎng)瓶的更實用）。個會，參考。38. 說說關(guān)于SDS的幾個小經(jīng)驗1、做好膠后，把所有的加樣孔都加上樣，這樣可以防止邊緣的樣品脫尾。2、高電壓/高電流電泳時，可以把電泳槽放到 41hr 搞定。箱中進行電泳，省時省力，3、膠考染時間

29、40min，放在凝膠搖（沒有膠床可以放到 28 度普通搖，但要控制好搖床速度）緩緩搖動，使染色均勻，同時可提高檢測的靈敏度，根據(jù)經(jīng)驗可以達到銀染的級別，就是脫色時間比較長，一般需要脫色 23d，夏天的時候要勤換脫色液，防止變臭哦39. 質(zhì)粒小提如果是用作鑒定或酶切，不必進行酚仿抽提，將溶液 1.2.3 離心后的清液移入一個新的 1.5ml 離心管中，再次離心 3-5 分鐘，取出上清液后，直接沉淀，不必擔(dān)心 DNA 切不開，我已經(jīng)這樣使用一年多，沒出過什么問題。當(dāng)然這樣的質(zhì)粒不很干凈，但是做鑒定足夠了。尤其是女同胞們，可以減少酚仿的，而且節(jié)省時間。分子生物學(xué)當(dāng)中的經(jīng)驗教訓(xùn)及技巧copy(2009

30、-03-23 15:02:08)大家平時做實驗，肯定都有很多小的技巧，在書上都看不到的，也沒有系統(tǒng)的整理，但是確實能夠起到很好的作用，不妨在這里與大家一下。任何專業(yè)任何點滴的東西都行，也許就對別人有一點好處哦！舉個例子：我在用酶標板加樣的時候，蛋白樣品常常會產(chǎn)生很多氣泡，如果做熒光實驗，由于靈敏度非常高，一點點微小的氣泡都會影響很大，常常又不可能加消泡劑，我就用衛(wèi)生紙，撕下來一下條，搓成小針，碰一碰氣泡就破了，很好使：）1、酶切或者PCR 體系混合好以后，大家都會用手指輕彈EP 管的底部來混勻溶液，常常出現(xiàn)很多氣泡。這時候輕彈液面上方的管壁，消除氣泡就輕而易舉了。千萬別彈液面下方的，氣泡會越來

31、越多。2、CR 不要一次做太多樣品 有時候機器不穩(wěn)定 影響結(jié)果3、用衛(wèi)生紙是一個，我覺得最好的是用接種針燒熱了之后去戳一下，防止被衛(wèi)生紙污染哈建議瞬間離心一下是最好的，不但消除氣泡，還有將管壁上的液體離下來，否則可能不夠分裝4、衛(wèi)生紙主要成分是素，一般并不會污染樣品，除非你做分析實驗，之所以用衛(wèi)生紙是因為它會吸水，減少水的表面張力，很容易就讓氣泡破裂了5、磁珠回收時，不要貪多，收集上層即可，太過影響 DNA 的純度和質(zhì)量，對、轉(zhuǎn)化有影像。6、各種buffer 都要完全融化后才能用，而且不管什么藥品，如果只剩下最后一點底子了，最好放棄，因為可能會影響你的實驗7、動手前，一定要思路清晰，盡量把要做

32、的事情列出來8、做前一定要在筆記上寫上 1、2、3.，在按照筆記一步一步做，否則容易出錯。9、要加的酶阿，dNTP，水啊之類的能分裝的話最好分裝好一點，萬一污染的話就全完了10、實驗前,列個表單,關(guān)鍵點.避免出錯.這樣費一點時間是值得的.不要太相信自己的.孤風(fēng)逐日：任何試劑反復(fù)凍融對其效率都有很大地影響。所以買來的試劑第一次使用時要注意按每次實驗用量分裝保存。提取的模板或純化的樣品也最好分裝保存，以備不測。很多個人經(jīng)驗在個板塊相關(guān)分析中都有一些提及，只要多加留意就可以學(xué)到很多高手的不傳經(jīng)驗。11、同時做很多管PCR 時的加樣技巧例如，需要做n 管PCR：1. 如果用同一對引物擴不同的模板，可以

33、先按照事先確定的比例，按照 n+2的量把水，反應(yīng)緩沖液，dNTP，鎂鹽，引物和Tag 酶先加到一個大管里面，混勻后就是“預(yù)混合液”了，然后把“預(yù)混合液”分裝到做PCR 用的小管里面，通常我會分裝n+1 管，最后向前 n 管里面入模板，混勻，最后一管不加模板而是加入和模板等量的無菌水，作為對照，以檢查加樣過是否引入了污染，接下來就可以進行PCR 反應(yīng)。2.如果用不同的引物擴同一模板（不做多重 PCR），則將第 1 點的引物和模板次序調(diào)換即可。3.同理，如果用不同的引物分別擴不同的模板，則將引物和模板留在最后分裝后再分別加入。這樣做的優(yōu)點：可以大量減少取樣次數(shù)，減少了不同 PCR 管之間的誤差（這

34、一點對于熒光定量PCR 尤其重要）；節(jié)省時間。缺點：如果在預(yù)混合液時的任何一步引入了污染則會導(dǎo)致這一批次的所有PCR 反應(yīng)都被污染，所以檢測是否被污染。次都做一個對照（用無菌水替換模板），以12、如果遇到試驗有很多步，只是自己看protocol 做，沒有人帶而且是第一次，我建議確立好步驟，然后每做一步的時候只注重眼前這一步，認真的做，不出錯。這樣每一步都只是關(guān)心眼下，可以集中精力，并且每一步都保證無誤，最后結(jié)果應(yīng)該不會太壞，而且即使出了問題，可以排除操作的。13、跑PAGE 膠染色的技巧吧：的親身體會，大家都知道如果嚴格按照 protocol 上的去做不但浪費其實是藥品，也浪費時間，程序還繁瑣

35、，當(dāng)然代價也高些。1、如果你跑的是小板的（SSR 之類的分析足夠），那么先找來 4 個 1 升左右的空瓶，洗干凈（我用的是國藥的裝尿素瓶，帶蓋的），用來分別裝銀染要用的固定液、染色液（硝酸銀）、顯影液、純水，在每個上面分別寫上名字，以免弄錯，每次回收這些溶液后，把蓋子擰緊，以一些揮發(fā)或分解吧，延長使用“”。2、一般的書上都說顯影液只能用一次，其實完全不至，我一般都是至少用 2 次，根本一點問題都沒有。還有固定液和染色液也可以適當(dāng)多用幾次，只要能然出來就行。3、有的時候用超純水 so 多，也so 浪費，或是一時半會制不出來，而染色要用怎么辦呢，我無意中就用蒸餾水代替，什么問題都沒有，根本沒啥差別

36、，甚至于后來我壓根都不用蒸餾水了，干脆改自來水，也沒啥問題，完全可行，不信大家可以試試，呵呵，雖然說是可能某些地方不是很合理，但對一般像做分子標記之類的根本沒啥影響，替能省就省點吧，大家都不容易，哈哈!還有我忘了說了，以前經(jīng)常跑完膠后來不及染色就得回寢室了，怎么辦呢，不用熬夜，就把膠剝離下來泡在固定液里，第二天早上再來接著下面的步驟一點問題都沒有，就是可能膠尺寸會有些變化，但絕對不影響你的結(jié)果?！鞍l(fā)明”了一種實用、最后一個就是讀帶問題，我見過別人好多種方法，但準確的：找一塊大點的普通玻璃板(我當(dāng)時用的是跑大垂直板膠的），帶上手套（保護好自己，雖然聚合后毒性小，但還是有的），快速把膠撈出來，放在玻璃板上，再迅速把玻璃翻個面，平放在觀片燈上，只要你速度快，膠是不會掉下來的，會緊緊貼在玻璃上的，最好玻璃板和管片燈的平面有點空隙，否則膠粘住觀片燈表面就會把燈面弄臟，膠也可能會掉，一切弄好后，你就可以直接那筆在玻璃的這個干凈面上一清二楚的讀帶，直接可以往上面寫帶型，然后為了以后檢查用，最好用數(shù)碼相機快速拍照保存，不但膠上的帶可以看清，你在玻璃上寫的帶型數(shù)字也是非常清楚的，當(dāng)然讀完的膠就可以立即扔掉，沒必要保存14、做實驗時，認真做好新，寫好實驗結(jié)果，過一段時間再去看看，溫故而知15、有些時候做完，由于條帶很淡，但你想回收不妨將有目的條帶的膠切下來放到度凍