實(shí)驗(yàn)4 蛋白透析技術(shù)課件

1、實(shí)驗(yàn)4 透析技術(shù)2014-2015學(xué)年第一學(xué)期研究生現(xiàn)代生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)陳 飛 （,2014-10-274.1 膜分離技術(shù)4.1.1 膜分離的概念：利用膜的選擇性，以膜的兩側(cè)存在一定量的能量差作為驅(qū)動(dòng)力，由于溶液中各組分透過(guò)膜的遷移速率不同而實(shí)現(xiàn)分離的一種技術(shù)。膜分離屬于速率控制的傳質(zhì)過(guò)程，具設(shè)備簡(jiǎn)單、條件溫和、無(wú)相變、處理效率高、節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)，非常適合熱敏性的生物大分子的分離純化，同時(shí)還兼有濃縮的功能。膜料液水小分子大分子滲透液濃縮液進(jìn)料液滲透液4.1.2 膜分離過(guò)程的分類：膜分離過(guò)程的實(shí)質(zhì)是物質(zhì)透過(guò)或被截留于膜的過(guò)程，近似于篩分過(guò)程，依據(jù)濾膜孔徑大小而達(dá)到物質(zhì)分離的目

2、的，故而可以按分離粒子的大小分為以下幾類：微濾、超濾、反滲透、透析等。（1）微濾（Microfiltration, MF）：以多孔細(xì)小薄膜為過(guò)濾介質(zhì)，壓力為推動(dòng)力，使不溶性物質(zhì)得以分離的操作。微濾膜：孔徑分布范圍在0.02514 m之間，截留直徑為0.0210 m大小的粒子。特點(diǎn)：是一種靜態(tài)過(guò)濾，隨過(guò)濾時(shí)間延長(zhǎng)，膜面上截流沉積不溶物，引起水流阻力增大，透水速率下降，直至微孔全被堵塞?？蓱?yīng)用于消毒、澄清、細(xì)胞收集等。如培養(yǎng)基液菌體分離與濃縮，產(chǎn)品消毒等。（2）超濾（Ultrafiltration, UF）：分離介質(zhì)同微濾膜，但孔徑更小，為0.0010.02 m，分離推動(dòng)力仍為壓力差，截?cái)喾肿恿靠?/p>

3、變化。特點(diǎn)：一種動(dòng)態(tài)過(guò)程，由泵提供推動(dòng)力，在膜表面產(chǎn)生兩個(gè)分力：一個(gè)是垂直于膜面的法向分力，使水分子透過(guò)膜面，另一個(gè)是于膜面平行的切向力，把膜面截流物沖掉。適合于酶、蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)的分離、濃縮，超濾親和純化，血漿分離，脫鹽，去熱原，在生物工程中應(yīng)用很廣。常規(guī)過(guò)濾(A)和超濾(B)的示意圖 AB4.2 透析原理透析（Dialysis, DS）原理：透析只需要使用專用的半透膜便可完成。通常是將半透膜制成袋狀，將生物大分子樣品溶液置入袋內(nèi)，將此透析袋浸入水或者緩沖液中，樣品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋內(nèi)，而鹽和小分子物質(zhì)不停擴(kuò)散透析到袋外，直到袋內(nèi)外兩邊的濃度到達(dá)平衡為止。水分子大

4、分子小分子透析膜表征透析膜性能的幾個(gè)參數(shù)：孔的性質(zhì)(包括孔徑、孔分布和孔隙度)、水通量、截留率、截?cái)喾肿恿?、透析比、抗壓能力、pH適用范圍、對(duì)熱和溶劑的穩(wěn)定性。截留率:膜對(duì)溶質(zhì)的截留能力,以截留率R（rejection）來(lái)表示，其定義為： R1 CpCb Cp和Cb：表示在某一瞬間，透析液和保留液的濃度。如R1，則Cp0，表示溶質(zhì)全部被截留；如R0，則Cp Cb，表示溶質(zhì)能自由透過(guò)膜。質(zhì)量好的膜，陡直,可使不同分子量的溶質(zhì)分離完全；反之，會(huì)導(dǎo)致分離不完全。截?cái)嗲€4.3 透析操作A:透析夾，B:透析，C:透析示意圖 透析袋透析裝置成功進(jìn)行透析分離的關(guān)鍵是在適當(dāng)?shù)臈l件下選用最合適的膜：根據(jù)目的選

5、擇等級(jí)（生物技術(shù)或標(biāo)準(zhǔn)）；根據(jù)溶液化學(xué)特性選擇膜材質(zhì)（再生纖維素RC、纖維素酯CE或聚偏氟乙烯 PVDF，下表）；根據(jù)使用方法選擇產(chǎn)品類型（管狀、一次性或片狀）；根據(jù)溶質(zhì)分子量選擇截留分子量（MWCO）：透析膜由海綿狀橫向耦合的聚合物材料構(gòu)成，截留性能間接由MWCO表示（截留率90%的溶質(zhì)分子大小可更精確的表示膜的MWCO）。而溶質(zhì)的滲透性亦取決于分子形狀、水合度、離子電荷與極性，推薦選擇膜的MWCO為欲截留物質(zhì)分子量的一半，兩倍于透過(guò)物質(zhì)的分子大小。根據(jù)處理量在5種尺寸（一次性透析裝置）或16種寬度（管狀）中選擇；根據(jù)目的選擇膜預(yù)處理方式。膜材質(zhì)的選擇透析袋預(yù)處理：透析袋出廠時(shí)都用10的甘油

6、處理過(guò)，并含有極微量的硫化物、重金屬和一些具有紫外吸收的雜質(zhì)，它們對(duì)蛋白質(zhì)和其它生物活性物質(zhì)有害。使用前一般將透析袋剪成1020 cm的小段，在2%（W/V）NaHCO3和1 mmol/L的EDTA（pH 8.0）中煮沸10 min，用蒸餾水徹底洗凈透析袋；然后放在1 mmol/L的EDTA（pH 8.0）中煮沸10 min，用蒸餾水徹底洗凈透析袋，冷卻后，存放于4 ，此后取用透析袋，必須戴手套。檢查透析效果的方法：用1% BaCl2檢查(NH4)2SO4，用1% AgNO3檢查NaCl、KCl等。透析注意事項(xiàng)：實(shí)驗(yàn)前透析袋一定要檢驗(yàn)是否漏液，防止樣品流失。必須經(jīng)常換蒸餾水，以保證較高的透析度。每次換蒸餾水時(shí)，都要檢查透析袋是否漏液。透析時(shí)間越長(zhǎng)，透析出的鹽離子越徹底，實(shí)驗(yàn)時(shí)間有限，只以時(shí)間作為衡量標(biāo)準(zhǔn)，一般檢測(cè)透析的結(jié)果可以檢測(cè)燒杯中鹽離子濃度，當(dāng)鹽離子濃度很小以不影響實(shí)驗(yàn)時(shí)可停止透析。兩端的夾子夾的時(shí)候，距離不要太近，避免透析袋鼓的太緊，而使透析袋脹破。蛋白