鈉氫交換蛋白1特異性抑制劑二甲基氨氯吡咪對HL60ADM細(xì)胞pHi變

1、鈉氫互換卵白-1特異性按捺劑二甲基氨氯吡咪對HL-60/ADM細(xì)胞pHi變常城，孔佩艷，陳幸華，彭賢貴，劉林，劉紅，曾東風(fēng)，梁雪，王慶余【摘要】為了探究鈉氫互換卵白-1NHE-1按捺劑二甲基氨氯吡咪DA對HL-60/AD細(xì)胞pHi變革及細(xì)胞增殖、凋亡的影響，以敏感HL-60細(xì)胞為比擬，用差異濃度的DA干預(yù)后，熒光指示劑BEF/A檢測法檢測細(xì)胞內(nèi)pHi，微量噻唑藍(lán)法TT檢測細(xì)胞生長的按捺率，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變革，TUNEL法檢測原位細(xì)胞凋亡，比擬HL-60/AD細(xì)胞與HL-60細(xì)胞之間的差異。效果表現(xiàn)：HL-60/AD細(xì)胞內(nèi)pHi較HL-60細(xì)胞明顯升高；DA作用下，HL-60/AD細(xì)胞的

2、pHi低落幅度、生長按捺率、細(xì)胞凋亡率均明顯高于HL-60細(xì)胞；當(dāng)DA濃度100-150l/L時(shí)，HL-60/AD細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞比率增長幅度、S期及G2/期細(xì)胞比率低落幅度均高于HL-60細(xì)胞。結(jié)論：NHE-1特異性按捺劑DA引起HL-60/AD的pHi低落，可按捺細(xì)胞生長并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；且DA對HL-60/AD細(xì)胞的生長按捺作用明顯高于HL-60細(xì)胞?！娟P(guān)鍵詞】鈉/氫互換卵白-1EffetftheNHE-1-SpeifiInhibitrDAnpHi，PrliferatinandApptsisfHL-60/ADellsInVitrAbstratTheaifthisstudyasteva

3、luatetheeffetfdiethylailride(DA)，aspeifiinhibitrfNa+/H+exhanger-1(NHE-1)，nintraellularpHvalue(pHi)，prliferatinandapptsisfHL-60/ADellsinvitr.AftertreatentithDAatdifferentdses，pHifHL-60andHL-60/ADelllineseredeterinedbyusingpH-sensitivefluresenedyeBEEF-A;theratefgrthinhibitinfellsasdetetedithTTassay;el

4、lyleasdetetedbyflytetriDNAanalysis;ellapptsisasbservedithterinaldexynuletidyltransferase-ediateddUTPnikendlabeling(TUNEL).TheresultsshedthatpHiinHL-60/ADellsashigherthanthatinHL-60ells.AftertreatentithDAatdifferentdses，pHidereased，theratefgrthinhibitinandtheratefappttiellsinHL-60/ADellsereallhighert

5、hanthseinHL-60ells.eanhile，aftertreatentithDAduring100l/Lt150l/L，theinreaseaplitudefG0/G1phaseellsandthedereaseaplitudefSG2/ellsinHL-60/ADellserehigherthanthseinHL-60ells.Itisnludedthatbyausingintraellularaidifiatin，theNHE-1-speifiinhibitrDAinhibitsprliferatinfHL-60/ADellsandinduesapptsisfHL-60/ADel

6、ls，andthedegreefthisgrthinhibitinfHL-60/ADellsishigherthanthatfHL-60ells.KeyrdsNHE-1;diethylailride;HL-60/ADell;pHi;ellprliferatin;apptsis鈉/氫互換卵白-1Na+/H+exhanger-1，NHE-1普及存在于真核細(xì)胞膜上，介導(dǎo)細(xì)胞表里11鈉/氫互換以維持細(xì)胞內(nèi)的pH值intraellularpHvalue，pHi。NHE-1表達(dá)增高和或活化可引起細(xì)胞內(nèi)堿化，促進(jìn)細(xì)胞增殖，相反那么可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)酸化，促進(jìn)細(xì)胞凋亡1，2。凋亡按捺是白血病多藥耐藥DR產(chǎn)生的緊張機(jī)

7、制之一3，本研究以HL-60細(xì)胞株為比擬，檢測NHE-1特異性按捺劑二甲基氨氯吡咪diethylailride，DA作用下，阿霉素誘導(dǎo)產(chǎn)生多藥耐藥的HL-60細(xì)胞株HL-60/ADpHi改變及其細(xì)胞增殖、凋亡變革，探究DA對HL-60/AD細(xì)胞生長的影響。質(zhì)料和要領(lǐng)質(zhì)料細(xì)胞株HL-60細(xì)胞株由第三軍醫(yī)大學(xué)復(fù)合傷研究所提供。阿霉素誘導(dǎo)的耐藥HL-60細(xì)胞株(HL-60/AD)購自天津中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所，實(shí)行前經(jīng)檢測證明，該細(xì)胞株對臨床常用多種化療藥物耐藥，細(xì)胞外貌表達(dá)多藥耐藥相干卵白R(shí)P，細(xì)胞內(nèi)拓?fù)洚悩?gòu)酶Tp增高。試劑及儀器BEF-A購自美國Eugene公司，RPI1640造就液、尺度胎

8、牛血清為美國Hylne公司產(chǎn)物，尼日利亞菌素nigeriin、DA、噻唑藍(lán)TT、二甲亞砜DS購自美國Siga公司。其他通例試劑為海內(nèi)試劑公司產(chǎn)物，闡發(fā)純。美國PE公司LS-50B熒光分光光度計(jì)，國產(chǎn)酶聯(lián)免疫闡發(fā)儀。氯化鈉緩沖液PSS，pH7.4，37、氯化鉀緩沖液37下用1N鹽酸和1N氫氧化鉀別離調(diào)定pH為6.8、7.0、7.2、7.4、7.6參照文獻(xiàn)4自行配制。TT溶于PBS液，事情液濃度為5g/l。細(xì)胞造就用含10胎牛血清的RPI1640造就液用1N鹽酸調(diào)治pH值至7.2，于飽和濕度，52、37造就箱中造就。HL-60/AD細(xì)胞株通例造就參加阿霉素0.5g/l，實(shí)行前無藥造就1周。pHi檢

9、測熒光強(qiáng)度比值FIR測定按BEF-A法4舉行。取對數(shù)生恒久的細(xì)胞，以1106細(xì)胞重懸于1lPBS液中；參加差異濃度DA，37孵育30分鐘；參加BEF-A終濃度1g/l，37孵育30分鐘；PSS漂洗后置于LS-50B分光光度計(jì)上用雙波長比例丈量法檢測，引發(fā)波長為495n和440n，發(fā)射波長為530n。FIR495n/440n。pHi尺度曲線制作參照文獻(xiàn)4舉行。細(xì)胞別離重懸于上述差異pH值氯化鉀緩沖液中，參加BEF-A、Nigeriin終濃度5l/L孵育30分鐘，以pH值和對應(yīng)FIR求出回歸方程，作出pHi尺度曲線。按照此曲線將檢測FIR轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的pHi值。細(xì)胞生長按捺率的TT法檢測取對數(shù)生恒久

10、細(xì)胞，用含10胎牛血清的RPI1640造就液調(diào)解細(xì)胞濃度為1105/l，接種于96孔板，0.2l/ell。同時(shí)別離參加差異濃度DA，每種濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，設(shè)置不加DA的陰性比擬孔和不加細(xì)胞的空缺比擬孔。通例造就48小時(shí)后參加TT事情液20l/ell，孵育5小時(shí)，離心后棄上清，參加DS0.15l/ell，震蕩10分鐘使結(jié)晶充實(shí)溶解，酶標(biāo)儀570n波長檢測D值，按照D值盤算相應(yīng)按捺率。按捺率1D檢測D空缺/D陰性D空缺細(xì)胞周期檢測對數(shù)生恒久細(xì)胞參加差異濃度DA配合造就24小時(shí)，細(xì)胞懸液用70%的冷乙醇結(jié)實(shí)后，調(diào)解細(xì)胞濃度為106/l；PI染色(50g/l)，4避光孵育30分鐘，在流式細(xì)胞儀(美國FA

11、S)上舉行檢測。原位細(xì)胞凋亡率檢測對數(shù)生恒久細(xì)胞別離與差異濃度DA配合造就12、24、48小時(shí)，離心涂片機(jī)涂片；接納TUNEL法，封片后光鏡高倍鏡400下不雅察，至少不雅察5個(gè)視野，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞以上，盤算陽性細(xì)胞百分率。統(tǒng)計(jì)闡發(fā)細(xì)胞周期檢測數(shù)據(jù)接納總體率假設(shè)查驗(yàn)。別的數(shù)據(jù)以均數(shù)尺度差xSD表現(xiàn)，用irsftExel2000軟件舉行t查驗(yàn)。效果pHi變革HL-60/AD細(xì)胞pHi值較HL-60細(xì)胞明顯增高P0.01。用差異濃度的DA干預(yù)后，HL-60/AD細(xì)胞內(nèi)pHi低落幅度高于HL-60細(xì)胞表1。Table1.pHivaluefHL-60andHL-60/ADellsaftertreate

12、ntithdifferentnentratinfDA略DA對細(xì)胞生長的按捺率在差異濃度DA作用下，HL-60/AD細(xì)胞生長的按捺率均高于HL-60細(xì)胞，且DA對細(xì)胞生長按捺率隨劑量增長而增高，HL-60/AD對劑量增長更為敏感表2。Table2.GrthinhibitinratesfHL-60andHL-60/ADellsaftertreatentithdifferentnentratinfDA略差異細(xì)胞周期的細(xì)胞比率變革當(dāng)DA濃度為100-150l/L時(shí)，HL-60細(xì)胞及HL-60/AD細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞比率均明顯高于未加藥時(shí)，S期及G2/期細(xì)胞比率均明顯低于未加藥時(shí)，且HL-60/AD

13、細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞比率增長幅度、S期及G2/期細(xì)胞比率低落幅度高于HL-60細(xì)胞表3。Table3.ellratihangesfHL-60andHL-60/ADellsinvariusphasesfellyleaftertreatentithdifferentnentratinsfDA略細(xì)胞凋亡檢測在DA作用下各組凋亡率均較比擬組明顯增高P0.01，凋亡率隨藥物濃度和作用時(shí)間的增長而增高表4。Table4.ellapptsisratefHL-60andHL-60/ADellsaftertreatentithdifferentnentratinsfDA略討論DR是導(dǎo)致白血病及其他種種惡性腫瘤

14、化療失敗的最重要緣故原由。如今存在多種DR機(jī)制，且在同一種耐藥細(xì)胞內(nèi)大概存在多種耐藥機(jī)制，這使得逆轉(zhuǎn)DR越發(fā)困難。Larsen等5創(chuàng)造，細(xì)胞內(nèi)堿化是腫瘤細(xì)胞DR產(chǎn)生后的配合變革，且與何種耐藥機(jī)制無關(guān)。我們測得HL-60細(xì)胞株的pHi為7.3870.054，與文獻(xiàn)報(bào)道同等6，耐藥的HL-60/AD細(xì)胞株pHi為7.4780.044，較HL-60細(xì)胞株明顯增高，證明DR細(xì)胞有比敏感細(xì)胞更高的pHi。如今，腫瘤細(xì)胞pHi的升高可改變革療藥物的漫衍，淘汰堿性化療藥物與靶位的結(jié)合。很多化療藥物結(jié)合到細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)是pH依靠性的，略微的細(xì)胞內(nèi)pH梯度的改變即可對藥物積蓄、胞噬和排泄產(chǎn)生影響。在化療藥物負(fù)荷下，

15、腫瘤細(xì)胞內(nèi)可以出現(xiàn)包羅藥物的酸性囊泡，通過胞吐作用將化療藥物排擠胞體外。敏感細(xì)胞內(nèi)酸性囊泡數(shù)目比耐藥細(xì)胞少，提示敏感細(xì)胞活性排泄通道移除藥物分子的本領(lǐng)較低6，7。這提示pHi的增高可影響細(xì)胞對化療藥物的敏感性，大概是白血病細(xì)胞產(chǎn)生DR的需要條件之一。本研究創(chuàng)造，在雷同濃度DA作用下，HL-60/AD細(xì)胞的生長按捺率、細(xì)胞凋亡率均明顯高于HL-60細(xì)胞，G0/G1期細(xì)胞比率明顯高于HL-60細(xì)胞，S期及G2/期細(xì)胞比率明顯低于HL-60細(xì)胞，這些效果說明在必然范疇內(nèi)HL-60/AD細(xì)胞對DA更為敏感。有研究表白，拓?fù)洚悩?gòu)酶按捺劑如喜樹堿是通過改變pHi來誘導(dǎo)和/或促進(jìn)細(xì)胞凋亡的，耐藥HL-60細(xì)胞可以或許對抗這種細(xì)胞內(nèi)酸化征象的產(chǎn)生，因此得到耐藥性；多藥耐藥HL-60細(xì)胞內(nèi)，Bl-2的表達(dá)和磷酸化顯著多于敏感細(xì)胞，而且不受凋亡誘導(dǎo)劑調(diào)控，這與耐藥細(xì)胞pHi相對較高的征象同等8，9。NHE-1是細(xì)胞內(nèi)pH值最重要的調(diào)治者，其表達(dá)及活性直接影響細(xì)胞內(nèi)pH值的程度。有報(bào)道表現(xiàn)，NHE-1表達(dá)及活性加強(qiáng)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡按捺10。陳杰11等運(yùn)用按捺消減雜交技能挑選耐藥及敏感肺癌細(xì)胞差異表達(dá)基因，創(chuàng)造