離子交換劑的選擇、處理和保存

1、PAGE 1PAGE 離子交換劑的選擇、處理和保存 1. 離子交換劑的選擇離子交換劑的種類很多，離子交換層析要取得較好的效果首先要選擇合適的離子交換劑。首先是對離子交換劑電荷基團的選擇，確定是選擇陽離子交換劑還是選擇陰離子交換劑。這要取決于被分離的物質(zhì)在其穩(wěn)定的pH下所帶的電荷，如果帶正電，則選擇陽離子交換劑；如帶負電，則選擇陰離子交換劑。例如待分離的蛋白等電點為4，穩(wěn)定的pH范圍為69，由于這時蛋白帶負電，故應(yīng)選擇陰離子交換劑進行分離。強酸或強堿型離子交換劑適用的pH范圍廣，常用于分離一些小分子物質(zhì)或在極端pH下的分離。由于弱酸型或弱堿型離子交換劑不易使蛋白質(zhì)失活，故一般分離蛋白質(zhì)等大分子物

2、質(zhì)常用弱酸型或弱堿型離子交換劑。其次是對離子交換劑基質(zhì)的選擇。前面已經(jīng)介紹了，聚苯乙烯離子交換劑等疏水性較強的離子交換劑一般常用于分離小分子物質(zhì)，如無機離子、氨基酸、核苷酸等。而纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等離子交換劑親水性較強，適合于分離蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)。一般纖維素離子交換劑價格較低，但分辨率和穩(wěn)定性都較低，適于初步分離和大量制備。葡聚糖離子交換劑的分辨率和價格適中，但受外界影響較大，體積可能隨離子強度和pH變化有較大改變，影響分辨率。瓊脂糖離子交換劑機械穩(wěn)定性較好，分辨率也較高，但價格較貴。另外離子交換劑顆粒大小也會影響分離的效果。離子交換劑顆粒一般呈球形，顆粒的大小通常以目數(shù)（mesh）或者

3、顆粒直徑（m）來表示，目數(shù)越大表示直徑越小。前面在介紹交換容量時提到了一些關(guān)于交換劑顆粒大小、孔隙的選擇。另外離子交換層析柱的分辨率和流速也都與所用的離子交換劑顆粒大小有關(guān)。一般來說顆粒小，分辨率高，但平衡離子的平衡時間長，流速慢；顆粒大則相反。所以大顆粒的離子交換劑適合于對分辨率要求不高的大規(guī)模制備性分離，而小顆粒的離子交換劑適于需要高分辨率的分析或分離。 這里特別要提到的是，離子交換纖維素目前種類很多，其中以DEAE-纖維素（二乙基氨基纖維素）和CM-纖維素（羧甲基纖維素）最常用，它們在生物大分子物質(zhì)（蛋白質(zhì)，酶，核酸等）的分離方面顯示很大的優(yōu)越性。一是它具有開放性長鏈和松散的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，有

4、較大的表面積，大分子可自由通過，使它的實際交換容量要比離子交換樹脂大的多；二是它具有親水性，對蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)吸附的不太牢，用較溫和的洗脫條件就可達到分離的目的，因此不致引起生物大分子物質(zhì)的變性和失活。三是它的回收率高。所以離子交換纖維素已成為非常重要的一類離子交換劑。 2. 離子交換劑的處理和保存離子交換劑使用前一般要進行處理。干粉狀的離子交換劑首先要進行膨化，將干粉在水中充分溶脹，以使離子交換劑顆粒的孔隙增大，具有交換活性的電荷基團充分暴露出來。而后用水懸浮去除雜質(zhì)和細小顆粒。再用酸堿分別浸泡，每一種試劑處理后要用水洗至中性，再用另一種試劑處理，最后再用水洗至中性，這是為了進一步去除

5、雜質(zhì)，并使離子交換劑帶上需要的平衡離子。市售的離子交換劑中通常陽離子交換劑為Na型（即平衡離子是Na離子），陰離子交換劑為Cl型，因為通常這樣比較穩(wěn)定。處理時一般陽離子交換劑最后用堿處理，陰離子交換劑最后用酸處理。常用的酸是HCl，堿是NaOH或再加一定的NaCl，這樣處理后陽離子交換劑為Na型，陰離子交換劑為Cl型。使用的酸堿濃度一般小于0.5 mol / L，浸泡時間一般30 min。處理時應(yīng)注意酸堿濃度不宜過高、處理時間不宜過長、溫度不宜過高，以免離子交換劑被破壞。另外要注意的是離子交換劑使用前要排除氣泡，否則會影響分離效果。離子交換劑的再生是指對使用過的離子交換劑進行處理，使其恢復原來

6、性狀的過程。前面介紹的酸堿交替浸泡的處理方法就可以使離子交換劑再生。離子交換劑的轉(zhuǎn)型是指離子交換劑由一種平衡離子轉(zhuǎn)為另一種平衡離子的過程。如對陰離子交換劑用HCl處理可將其轉(zhuǎn)為Cl型，用NaOH處理可轉(zhuǎn)為OH型，用甲酸鈉處理可轉(zhuǎn)為甲酸型等等。對離子交換劑的處理、再生和轉(zhuǎn)型的目的是一致的，都是為了使離子交換劑帶上所需的平衡離子。前面已經(jīng)介紹了，離子交換層析就是通過離子交換劑上的平衡離子與樣品中的組分離子進行可逆的交換而實現(xiàn)分離的目的，因此在離子交換層析前要注意使離子交換劑帶上合適的平衡離子，使平衡離子能與樣品中的組分離子進行有效的交換。如果平衡離子與離子交換劑結(jié)合力過強，會造成組分離子難以與交換

7、劑結(jié)合而使交換容量降低。另外還要保證平衡離子不對樣品組分有明顯影響。因為在分離過程中，平衡離子被置換到流動相中，它不能對樣品組分有污染或破壞。如在制備過程中用到的離子交換劑的平衡離子是H或OH離子，因為其它離子都會對純水有污染。但是在分離蛋白質(zhì)時，一般不能使用H或OH型離子交換劑，因為分離過程中H或OH離子被置換出來都會改變層析柱內(nèi)pH值，影響分離效果，甚至引起蛋白質(zhì)的變性。離子交換劑保存時應(yīng)首先處理洗凈蛋白等雜質(zhì)，并加入適當?shù)姆栏瘎话慵尤?.02 %的疊氮鈉，4C下保存。3.3.5 離子交換層析的基本操作 離子交換層析的基本裝置及操作步驟與前面介紹的柱層析類似，這里就不再重復了。下面主要

8、介紹離子交換層析操作中應(yīng)注意的一些具體問題。 1. 層析柱離子交換層析要根據(jù)分離的樣品量選擇合適的層析柱，離子交換用的層析柱一般粗而短，不宜過長。直徑和柱長比一般為1:10到1:50之間，層析柱安裝要垂直。裝柱時要均勻平整，不能有氣泡。 2. 平衡緩沖液離子交換層析的基本反應(yīng)過程就是離子交換劑平衡離子與待分離物質(zhì)、緩沖液中離子間的交換，所以在離子交換層析中平衡緩沖液和洗脫緩沖液的離子強度和pH的選擇對于分離效果有很大的影響。平衡緩沖液是指裝柱后及上樣后用于平衡離子交換柱的緩沖液。平衡緩沖液的離子強度和pH的選擇首先要保證各個待分離物質(zhì)如蛋白質(zhì)的穩(wěn)定。其次是要使各個待分離物質(zhì)與離子交換劑有適當?shù)?/p>

9、結(jié)合，并盡量使待分離樣品和雜質(zhì)與離子交換劑的結(jié)合有較大的差別。一般是使待分離樣品與離子交換劑有較穩(wěn)定的結(jié)合。而盡量使雜質(zhì)不與離子交換劑結(jié)合或結(jié)合不穩(wěn)定。在一些情況下（如污水處理）可以使雜質(zhì)與離子交換劑有牢固的結(jié)合，而樣品與離子交換劑結(jié)合不穩(wěn)定，也可以達到分離的目的。另外注意平衡緩沖液中不能有與離子交換劑結(jié)合力強的離子，否則會大大降低交換容量，影響分離效果。選擇合適的平衡緩沖液，直接就可以去除大量的雜質(zhì)。并使得后面的洗脫有很好的效果。如果平衡緩沖液選擇不合適，可能會對后面的洗脫帶來困難，無法得到好的分離效果。 3. 上樣離子交換層析的上樣時應(yīng)注意樣品液的離子強度和pH值，上樣量也不宜過大，一般為

10、柱床體積的15為宜，以使樣品能吸附在層析柱的上層，得到較好的分離效果。 4. 洗脫緩沖液在離子交換層析中一般常用梯度洗脫，通常有改變離子強度和改變pH兩種方式。改變離子強度通常是在洗脫過程中逐步增大離子強度，從而使與離子交換劑結(jié)合的各個組分被洗脫下來；而改變pH的洗脫，對于陽離子交換劑一般是pH從低到高洗脫，陰離子交換劑一般是pH從高到低。由于pH可能對蛋白的穩(wěn)定性有較大的影響，故一般通常采用改變離子強度的梯度洗脫。梯度洗脫的裝置前面已經(jīng)介紹了，可以有線性梯度、凹形梯度、凸形梯度以及分級梯度等洗脫方式。一般線性梯度洗脫分離效果較好，故通常采用線性梯度進行洗脫。洗脫液的選擇首先也是要保證在整個洗

11、脫液梯度范圍內(nèi)，所有待分離組分都是穩(wěn)定的。其次是要使結(jié)合在離子交換劑上的所有待分離組分在洗脫液梯度范圍內(nèi)都能夠被洗脫下來。另外可以使梯度范圍盡量小一些，以提高分辨率。 5. 洗脫速度洗脫液的流速也會影響離子交換層析分離效果，洗脫速度通常要保持恒定。一般來說洗脫速度慢比快的分辨率要好，但洗脫速度過慢會造成分離時間長、樣品擴散、譜峰變寬、分辨率降低等副作用，所以要根據(jù)實際情況選擇合適的洗脫速度。如果洗脫峰相對集中某個區(qū)域造成重疊，則應(yīng)適當縮小梯度范圍或降低洗脫速度來提高分辨率；如果分辨率較好，但洗脫峰過寬，則可適當提高洗脫速度。 6. 樣品的濃縮、脫鹽離子交換層析得到的樣品往往鹽濃度較高，而且體積

12、較大，樣品濃度較低。所以一般離子交換層析得到的樣品要進行濃縮、脫鹽處理。3.3.6 離子交換層析的應(yīng)用 離子交換層析的應(yīng)用范圍很廣，主要有以下幾個方面。 1. 水處理離子交換層析是一種簡單而有效的去除水中的雜質(zhì)及各種離子的方法，聚苯乙烯樹脂廣泛的應(yīng)用于高純水的制備、硬水軟化以及污水處理等方面。純水的制備可以用蒸餾的方法，但要消耗大量的能源，而且制備量小、速度慢，也得不到高純度。用離子交換層析方法可以大量、快速制備高純水。一般是將水依次通過H 型強陽離子交換劑，去除各種陽離子及與陽離子交換劑吸附的雜質(zhì)；再通過OH 型強陰離子交換劑，去除各種陰離子及與陰離子交換劑吸附的雜質(zhì)，即可得到純水。再通過弱型陽離子和陰離子交換劑進一步純化，就可以得到純度較高的純水。離子交換劑使用一段時間后可以通過再生處理重復使用。 2. 分離純化小分子物質(zhì)離子交換層析也廣泛的應(yīng)用于無機離子、有機酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物質(zhì)的分離純化。例如對氨基酸的分析，使用強酸性陽離子聚苯乙烯樹脂，將氨基酸混合液在pH 23上柱。這時氨基酸都結(jié)合在樹脂上，再逐步提高洗脫液的的離子強度和pH，這樣各種氨基酸將以不同的速度被洗脫下來，可以