大量提取質(zhì)粒DNA

1、大量提取質(zhì)粒DNA （CsCl密度梯度離心法）來源：2011-6-9 訪問量：3520評論（0）分享1大量提取質(zhì)粒DNA（CsCl密度梯度離心法）2010-7-7大量提取質(zhì)粒DNA（CsCl密度梯度離心法）李淵越預約搖床、超速離心機。配TB培養(yǎng)基（1L錐形瓶中裝250 ml培養(yǎng)液），并滅菌。質(zhì)粒做好轉(zhuǎn)化，并涂板。第一天早上，往TB中加入適量的Amp或Kana。挑菌，37 C搖床培養(yǎng)24 h,至OD600 到 10-15。檢查以下藥品：25% sucrose in 50 mM Tris-HC（pH8.0） 250mL、lysozyme 粉末1g、0.5 M EDTA（pH8.0） 50mL、RN

2、ase A（100 mg/ml） 150uL、Triton-lysis100mL、PEG8000300mL、 1xTE150mL、CsCl250g、正丁醇2 瓶、EB2mL。第二天早上，把菌液倒入離心瓶中，用Beckman J6-MI離心機以4,200 rpm, 20 min離 心。離心后，把上清倒干。在離心的時候，配Lysozyme 25mL。并將RNase置于室溫。棄上清，以 20ml 25% sucrose in 50 mM Tris-HCl （pH8.0），重懸至菌完全分散。加入4ml新配制的lysozyme-EDTA-RNase溶液?；靹?，室溫靜置10 min以上。在靜置的同時，準備

3、好高速離心管，往里面各加入5ml Triton-lysis。將lysozyme-EDTA-RNase-DNA溶液倒入高速離心管中，使用JA-30.50 Ti轉(zhuǎn)頭， 100,000g, 15min。將上清倒入新管中（不要把沉淀倒出來），加入PEG8000使總體積至50mL （1/2體 積），顛倒混勻，于4 C中放置2h以上（過夜更好）。4,000 g 5 min，去上清，加入8.5ml TE，溶解至無沉淀。加入11.00 g （要精確到小數(shù)點后2位，便于配平）CsCl，溶解完全。在超離管中用200ul槍加入100ul EB（2mg/ml），將溶液通過20mL 一次性注射器移 入超離管中，用TE將

4、液面補平至近管口。補加TE至液面到超速離心管管口。稱出每管重量，配平，封口。任選以下一種條件在20C下進行密度梯度離心：轉(zhuǎn)頭轉(zhuǎn)速時間Type 70.1 Ti 70,000rpm 20hNVT65 60,000rpm 16hNVT65 65,000rpm 8h滅250mL以上的超純水，并配好至少500mL滅菌水飽和正丁醇。超離后，取樣品，用5 ml注射器加上12#針頭，抽取EB帶，（離心完可見兩條EB帶， 上面一條細淺的帶為斷裂的質(zhì)粒DNA,應抽取下面一條粗濃的EB帶）放入50ml管中。以滅菌水飽和正丁醇溶液萃取EB,直到溶液澄清無色。加入等體積TE (一定要加。若不加，在無水乙醇沉淀時，會沉淀

5、下部分CsCl)。加入2倍體積預冷的無水乙醇，混勻(如果不充分混勻，可能會導致離下的DNA是 透明的，容易隨上清一起倒掉)。6,000rpm，20min，(注意方向)去上清(注意沉淀不會貼壁，不要倒掉)。加入450 pl (900ul)水，把50mL離心管平放(注意方向)，溶解，直到溶解完全(約 需室溫過夜)。用槍小心將液體吸入1.5mL離心管中(如450ul，可分成兩管)，加入十分之一體積的 3 M NaAc (pH5.2)，再加入2倍體積預冷的無水乙醇，混勻，置于4C或-20C 15-30min。13,000 rpm離 心 10min。用1mL 70%預冷的乙醇洗沉淀一次，13,000rp

6、m離心10min。去上清，以1mL TE溶解完全，測定濃度。大量提取質(zhì)粒DNA(CsCl密度梯度離心法)2010-7-7lysozyme-EDTA-RNase 溶液溶菌酶0.4 g0.5M EDTA (pH=8.0) 25mLRNase A (100mg/mL) 120uLH2O 25mL25%蔗糖：蔗糖25 g1 M Tris-HCl (pH 8.0) 5 ml過濾，加純水定容至100 ml，置于4 C保存。0.5 M EDTA (pH 8.0):EDTA-Na-2H2O 186.1 gNaOH 約 20 g加800 ml純水溶解完全后，調(diào)pH至8.0，定容至1 L，濕熱滅菌，常溫保存。Triton-lysis:10% Triton-100 5mL1 M Tris-HCl (pH 8.0) 15 mLH2O 100mL濕熱滅菌，常溫