DNARNA合成常見(jiàn)問(wèn)題解答

1、DNA/RRNA合成成 常見(jiàn)問(wèn)題題解答處理和保存存 HYPERLINK /faq5.asp#Q1#Q1 l Q1#Q1 1. 如如何保存寡寡核苷酸? HYPERLINK /faq5.asp#Q2#Q2 l Q2#Q2 2. 如如何重懸寡寡核苷酸? HYPERLINK /faq5.asp#Q3#Q3 l Q3#Q3 3. 如如果寡核苷苷酸在室溫溫中放置超超過(guò)一星期期，還可以以使用嗎? HYPERLINK /faq5.asp#Q4#Q4 l Q4#Q4 4. 熒熒光染料標(biāo)標(biāo)記的寡核核苷酸，在在儲(chǔ)存和使使用過(guò)程中中必須特殊殊處理嗎?純化和濃濃縮 HYPERLINK /faq5.asp#Q5#Q5 l

2、 Q5#Q5 5. 如如何定量合合成的寡核核苷酸? HYPERLINK /faq5.asp#Q6#Q6 l Q6#Q6 6. 如如何通過(guò)紫紫外吸光度度值來(lái)定量量寡核苷酸酸? HYPERLINK /faq5.asp#Q7#Q7 l Q7#Q7 7. 如如一個(gè)188個(gè)堿基的的寡核苷酸酸包括3個(gè)個(gè)dG,44個(gè)dC,5個(gè)dAA和6個(gè)ddT, OOD值是00.7，那那 么么它的量是是多少? HYPERLINK /faq5.asp#Q8#Q8 l Q8#Q8 8. 如如何計(jì)算寡寡核苷酸的的分子量? HYPERLINK /faq5.asp#Q9#Q9 l Q9#Q9 9. 如如何測(cè)定寡寡核苷酸的的質(zhì)量? H

3、YPERLINK /faq5.asp#Q10#Q10 l Q10#Q10 110. 如如何測(cè)定寡寡核苷酸的的質(zhì)量? HYPERLINK /faq5.asp#Q11#Q11 l Q11#Q11 111. 如如何測(cè)定合合成的寡核核苷酸的TTm值? HYPERLINK /faq5.asp#Q12#Q12 l Q12#Q12 112. 為為什么Biioneeer提供的的Tm值和和我們的TTm值不同同? HYPERLINK /faq5.asp#Q13#Q13 l Q13#Q13 13. 用什么么方法調(diào)整整寡核苷酸酸的濃度? HYPERLINK /faq5.asp#Q14#Q14 l Q14#Q14 14

4、. 單位換算算表合成與訂訂購(gòu) HYPERLINK /faq5.asp#Q15#Q15 l Q15#Q15 15. 如何合合成寡核苷苷酸? HYPERLINK /faq5.asp#Q17#Q17 l Q17#Q17 166. 標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)寡核苷酸酸結(jié)構(gòu) HYPERLINK /faq5.asp#Q17#Q17 l Q17#Q17 177. Biioneeer能合成成的最長(zhǎng)的的寡核苷酸酸是多長(zhǎng)? HYPERLINK /faq5.asp#Q18#Q18 l Q18#Q18 18. 當(dāng)我預(yù)訂訂50nmmol的寡寡核苷酸，產(chǎn)產(chǎn)品卻不足足50 nnmol，為為什么? HYPERLINK /faq5.asp#Q19

5、#Q19 l Q19#Q19 119. 能能合成出高高百分比“G”的寡核苷苷酸嗎? HYPERLINK /faq5.asp#Q20#Q20 l Q20#Q20 220. 能能提供寡核核糖核酸(RNA)合成嗎? HYPERLINK /faq5.asp#Q21#Q21 l Q21#Q21 21. 合成的寡寡核苷酸在在3 或或5位有有磷酸基嗎嗎? HYPERLINK /faq5.asp#Q22#Q22 l Q22#Q22 22. 簡(jiǎn)并引引物及通用用引物是什什么?純化方法法 HYPERLINK /faq5.asp#Q23#Q23 l Q23#Q23 23. 怎樣純化化合成的寡寡核苷酸? HYPERLI

6、NK /faq5.asp#Q24#Q24 l Q24#Q24 24. 用于芯片片分析的660 meer寡核苷苷酸如何被被純化呢?修飾寡核核苷酸 HYPERLINK /faq5.asp#Q25#Q25 l Q25#Q25 255. 修飾飾寡核苷酸酸 HYPERLINK /faq5.asp#Q26#Q26 l Q26#Q26 26. 作為反義義脫氧寡核核苷酸的硫硫磷酰化寡寡核苷酸實(shí)驗(yàn) HYPERLINK /faq5.asp#Q27#Q27 l Q27#Q27 27. 怎樣制制備雙鏈DDNA?Q1. 如如何保存寡寡核苷酸？ HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP

7、HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 通常，寡寡核苷酸應(yīng)應(yīng)該-200保存，該該溫度下能能穩(wěn)定保存存一年以上上。寡核苷苷酸在溶液液中較為穩(wěn)穩(wěn)定，但易易被污染的的核酸酶降降解，因此此我們建議議應(yīng)干燥儲(chǔ)儲(chǔ)存。若要要以溶液形形式儲(chǔ)存，最最好將其分分裝在幾管管中分別保保存，反復(fù)復(fù)凍融會(huì)使使寡核苷酸酸降解。另另外，酸性性條件下，DDNA會(huì)因因?yàn)槊撪堰蔬首饔枚到到?；堿性性條件會(huì)使使磷酸二酯酯鍵水解斷斷裂。Q2. 如如何重懸寡寡核苷酸？ HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#T

8、OP l TOP#TOP TOP 為便于于長(zhǎng)期保存存，我們建建議使用TTE緩沖液液(10 mM TTris-HCl,1 mMM EDTTA, ppH8.00)，而不不用無(wú)菌水水來(lái)溶解寡寡核苷酸。重懸后，寡寡核苷酸應(yīng)應(yīng)該在-220癈保存存以長(zhǎng)期使使用。寡核核苷酸在無(wú)無(wú)菌水中很很難溶解，加加一定量的的NaOHH有助于寡寡核苷酸在在水中溶解解。Q3. 如如果寡核苷苷酸在室溫溫中放置超超過(guò)一星期期，還可以以使用嗎？ HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 脫水的的寡核苷酸酸是長(zhǎng)期穩(wěn)穩(wěn)

9、定的。即即使在溶液液狀態(tài)寡核核苷酸也相相當(dāng)穩(wěn)定，通通常情況(沒(méi)有引入入使寡核苷苷酸降解的的污染物)即使在室室溫中放置置超過(guò)一星星期也能使使用。Q4. 熒熒光染料標(biāo)標(biāo)記的寡核核苷酸，在在儲(chǔ)存和使使用過(guò)程中中必須特殊殊處理嗎？ HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 如果暴暴露在光線線下，熒光光染料標(biāo)記記的寡核苷苷酸比未標(biāo)標(biāo)記的寡核核苷酸更易易降解，熒熒光強(qiáng)度會(huì)會(huì)逐漸降低低。為了保保持其熒光光效能，熒熒光染料標(biāo)標(biāo)記的核苷苷酸應(yīng)避光光-20保存。由由于Cy33和Cy55在pH大大于

10、9時(shí)易易被降解，所所以Cy33和Cy55修飾Q5. 如如何定量合合成的寡核核苷酸? HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 合成的的寡核苷酸酸的量非常常少，不能能直接稱重重來(lái)定量。通常通過(guò)過(guò)測(cè)量紫外外吸光度值值(OD值值)來(lái)定量量。Q6. 如如何通過(guò)紫紫外吸光度度值來(lái)定量量寡核苷酸酸？ HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 寡核苷苷酸的量經(jīng)經(jīng)常用ODD值來(lái)

11、描述述。1個(gè)OOD值是體體積1mll寡核苷酸酸溶液，在在內(nèi)徑1ccm的比色色杯中的吸吸光度值，約約為33 mg寡核核苷酸，序序列不同的的寡核苷酸酸OD值有有所不同。因?yàn)樵?260nmm處單個(gè)堿堿基的吸光光度值是已已知的，所所以序列已已知的寡核核苷酸的濃濃度就可以以測(cè)定。dT: 88.8 mml/mmoldG: 111.7 ml/mol dC: 77.3 mml/mmol dA: 115.4 ml/mol 對(duì)于一一段寡核苷苷酸，它的的吸光度等等于每個(gè)堿堿基的數(shù)目目乘以它的的吸光系數(shù)數(shù)，然后將將4種堿基基的結(jié)果加加起來(lái)就是是整個(gè)寡核核苷酸的吸吸光度。它它的濃度可可通過(guò)下式式來(lái)計(jì)算 ：O.D. =C

12、 (內(nèi)徑11 cm的的比色杯)Q7. 如如一個(gè)188個(gè)堿基的的寡核苷酸酸包括3個(gè)個(gè)dG,44個(gè)dC,5個(gè)dAA和6個(gè)ddT, OOD值是00.7，那那么它的量量是多少？ HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP首先，用下下面公式計(jì)計(jì)算18個(gè)個(gè)堿基的寡寡核苷酸的的吸光度是是多少 ： = 111.7 3 + 7.3 4 + 15.44 55 + 88.8 6 = 1944.1 (ml/ mmolle)然后，通過(guò)過(guò)下式來(lái)計(jì)計(jì)算寡核苷苷酸的濃度度：O.D. =C，CC = OO.D./

13、CC = 00.7 /194.1 = 0.00036 (moll/ml) = 33.6 (nmoll/ml)最后，ODD值為0.7的188個(gè)堿基寡寡核苷酸的的濃度是33.6nmmol。Q8. 如如何計(jì)算寡寡核苷酸的的分子量? HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP寡核苷酸的的分子量可可以通過(guò)下下式進(jìn)行計(jì)計(jì)算：M.W. =(NAA 2449.2) + (NC 2255.2) + (NNG 265.2) + (NTT 2240.22) + (寡核苷苷酸長(zhǎng)度-1) 63.98 +

14、2.002NA =總總 A數(shù)NC = 總C數(shù)NG = 總G數(shù)NT = 總T數(shù)Q9. 如如何測(cè)定寡寡核苷酸的的質(zhì)量? HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 通常，合合成的寡核核苷酸的質(zhì)質(zhì)量用摩爾爾數(shù)來(lái)描述述，常用nnmol。用寡核苷苷酸的摩爾爾數(shù)或寡核核苷酸的分分子量可以以計(jì)算寡核核苷酸的量量： 寡核苷苷酸質(zhì)量(ng) =分子量量(M.WW.)摩摩爾數(shù)(nnmol)Q10. 如果不知知道寡核苷苷酸的堿基基組成，有有什么辦法法來(lái)定量合合成的寡核核苷酸？ HYPERLINK /f

15、aq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 1 OOD值 的的單 鏈寡寡 核苷酸酸大約333 mg，雙雙鏈 寡 核 苷 酸 約為為 50.mg。然然而對(duì)于較較短的寡核核苷酸，上上述值偏差差較大。因因此，最 好 用 Q6 中中 提 到到 的 適適合于短 寡 核 苷 酸 質(zhì) 量的的計(jì)算方法法，可以 得 到 更 精 確的 結(jié)結(jié) 果。Q11. 如何測(cè)定定合成的寡寡核苷酸的的Tm值? HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP

16、 l TOP#TOP TOP Tm(解鏈溫度度)是指550%雙鏈鏈被解開(kāi)成成單鏈時(shí)的的溫度。寡寡核苷酸濃濃度和鹽濃濃度會(huì)影響響Tm值的的大小。Tm 值值 有 多 種 計(jì) 算 方 法 。我我 們 使使 用 近 鄰鄰 法 ( P N A S 88 3 ,3 7 4 6- 5 00 )來(lái)計(jì)計(jì)算。用這這種方法計(jì)計(jì)算前，也也有多種方方法來(lái)估測(cè)測(cè)。如果是是15個(gè)堿堿基以下，那那么有一種種好的方法法來(lái)估算，對(duì)對(duì)于A和TT，可以乘乘以2癈，對(duì)對(duì)于C和GG，可以乘乘以4癈然然后相加，這這叫做Waallacce法則。 Tm= 22 (A + T) + 44 (G + C)另一種方法法來(lái)估計(jì)長(zhǎng)長(zhǎng)鏈中GCC含量Tm

17、= 81.55 + 00.41(%GC) - 5500/LL + 116.6 logM(L:寡核核苷酸的長(zhǎng)長(zhǎng)度；M:1價(jià)陽(yáng)離離子的濃度度) 但這些些方法不能能消除堿基基堆積的影影響，結(jié)果果并不準(zhǔn)確確，所以近近鄰法被廣廣泛的應(yīng)用用。但是，對(duì)對(duì)于在600-70 bp或115bp以以下的寡核核苷酸的測(cè)測(cè)定，近鄰鄰法還是有有缺點(diǎn)。 Biooneerr使用的近近鄰法具有有新的特點(diǎn)點(diǎn)。它考慮慮到在退火火過(guò)程中不不同的堿基基序列的影影響，并且且通過(guò)熱力力學(xué)來(lái)測(cè)定定，可以更更有效的測(cè)測(cè)定Tm值值。比如55 -GGC-3 和5 -CGG-3的的序列用熱熱力學(xué)方法法測(cè)定結(jié)果果是不同的的。計(jì)算方方法如下： 依靠熱熱

18、力學(xué)方法法，焓和熵熵通過(guò)兩個(gè)個(gè)堿基來(lái)確確定。ssalt是指一價(jià)價(jià)陽(yáng)離子的的濃度，Oliggo是指指反應(yīng)過(guò)程程中的寡核核苷酸濃度度。R是指指氣體常數(shù)數(shù)(1.9987 ccalKK-1mool-1)。Biooneerr用近鄰法法計(jì)算Tmm值時(shí)，使使用的是550 mMM的鹽濃度度和1 nnM的寡核核苷酸的濃濃度。 Biooneerr會(huì)給每一一個(gè)用戶提提供Tm值值，但這只只是估計(jì)值值，我們不不能保證精精確性，因因此這個(gè)值值僅供用戶戶參考。如果沒(méi)有擴(kuò)擴(kuò)增出產(chǎn)物物，你可以以把退火溫溫度降到TTm值以下下45癈癈。如果有有許多非特特異性的產(chǎn)產(chǎn)物，你需需要改變實(shí)實(shí)驗(yàn)條件如如提高退火火溫度以得得到正確的的產(chǎn)物。

19、Q12. 為什么BBioneeer提供供的Tm值值和我們的的Tm值不不同? HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP Biooneerr使用的TTm值的計(jì)計(jì)算方法和和我們通常常的計(jì)算方方法是不同同的。我們們通常只是是簡(jiǎn)單的乘乘以A、GG、C、TT的數(shù)目，但但序列不同同堿基的TTm值亦會(huì)會(huì)不同。如如Tm值取取決于序列列中的每一一個(gè)堿基，即即使堿基數(shù)數(shù)相同但序序列不同時(shí)時(shí)，Tm值值也將不同同。Q13. 用什么方方法調(diào)整寡寡核苷酸的的濃度？ HYPERLINK /faq5.asp#T

20、OP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 首先，在在Bionneer提提供的數(shù)據(jù)據(jù)表或報(bào)告告單中的1100 ppmol/靗，是用用來(lái)加入TTE緩沖液液或無(wú)菌水水，以使管管中寡核苷苷酸的終濃濃度達(dá)到1100 ppmol/靗。例如如,數(shù)據(jù)表表或報(bào)告單單中是1889.0和和209.2時(shí)，則則應(yīng)向兩個(gè)個(gè)管中分別別加入相應(yīng)應(yīng)量的無(wú)菌菌水,即可可使每個(gè)管管中的寡核核苷酸濃度度達(dá)到1000 pmmol/l。每一一個(gè)管中寡寡核苷酸含含量通過(guò)下下式可以計(jì)計(jì)算如下：189.00l1100 ppmol/l = 18,900 pmoll =

21、118.9 nmoll,209.22l1100 ppmol/l = 20,920 pmoll = 220.922 nmool如果所要的的終濃度是是0.5M，pmmol/l需要換換M。100 ppmol/l = 1000 1006pmmol/1106ll = 11001106 10-112mool/L = 100-4mmol/LL= 10-41106 mol/L= 1022moll /L= 1000 M終濃度換算算為1000M，如如果需要的的濃度是00.5MM的，加入入終體積的的1/2000的引物物量，以使使引物終濃濃度為0.5M。PCR反應(yīng)應(yīng)的終體積積是50l，所以以需要加550/2000 =

22、 0.255l的引引物，以使使終濃度達(dá)達(dá)到0.55M。Q14. 單位換算算表 HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP科學(xué)系統(tǒng)單單位: 10-1 = decii d 1011 = ddeca da 10-2 = centti cc 1022 = hhectoo h 10-3 = millli mm 1033 = kkilo k 10-6 = micrro mm 1066 = mmega M 10-9 = nanoo n 1099 = ggiga G 10-12 = picco

23、pp 10112 = teraa T 10-15 = femmto f 10115 = petaa P 10-18 = attto aa 10118 = exa E 10-21 = zeppto z 10221 = zettta ZZ 10-24 = yoccto y 10224 = yottta YY寡核苷酸單單位換算的的例子:1 pmool/ll= 1110-122 moll/1110-6LL= 1110-6 mol/L= 1mmol/LL= 1MMQ15. 如何合成成寡核苷酸酸? HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.

24、asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 目前最最流行的用用于合成寡寡核苷酸的的方法是通通過(guò)使用“亞磷酸三三脂”方 法 將將 單 體體 連 接接 ，形 成 天 然的 3-55磷 酸 二二 脂 鍵 。Kosster發(fā)發(fā)現(xiàn)了-氰乙基亞亞磷酰胺并并作為構(gòu)建建單體，現(xiàn)現(xiàn)在普遍的的用于寡核核苷酸的合合成(Nuucl. Acidds Rees. 11984, 12,45399; Teetrahhedroon Leett. 19833, 244,58443)。通通過(guò)“亞磷磷酸三脂”的方法使使用-氰氰乙基亞磷磷酰胺，合合成效率能能夠達(dá)到(98%)而合成時(shí)時(shí)間比其它它寡核苷酸酸的合成方方法更短。而且，

25、由由于單體-氰乙基基亞磷酰胺胺在激活以以前很穩(wěn)定定，這是對(duì)對(duì)合成寡核核苷酸來(lái)說(shuō)說(shuō)所必需的的，他們能能儲(chǔ)存更長(zhǎng)長(zhǎng)的時(shí)間。當(dāng)寡核苷苷酸共價(jià)的的連接在固固相載體上上就可以使使其不被過(guò)過(guò)量溶解-氰乙基基亞磷酰胺胺和結(jié)合試試劑的作用用下，寡核核苷酸被合合成。在各各種各樣的的固相載體體中，可控控孔度玻片片已經(jīng)在近近年廣泛使使用了，這這種玻片是是由均勻的的玻璃基質(zhì)質(zhì)組成，上上面有固定定尺寸的孔孔。 整個(gè)寡寡核苷酸的的合成通過(guò)過(guò)一系列的的反應(yīng)完成成，其中包包括四個(gè)循循環(huán)反應(yīng)：脫保護(hù)，連連接，氧化化，加帽。脫保護(hù) 通過(guò)第第一個(gè)循環(huán)環(huán)脫保護(hù)護(hù)，CPGG裂解出55保護(hù)基基團(tuán)DMTT。酸性條條件對(duì)于脫脫保護(hù)是必必需的

26、，通通常使用33三氯乙乙酸。據(jù)報(bào)報(bào)道，寡核核苷酸在酸酸性環(huán)境中中易脫嘌呤呤，尤其是是對(duì)于腺苷苷。因?yàn)槿纫宜嵊杏泻軓?qiáng)的酸酸性，所以以用三氯乙乙酸脫保護(hù)護(hù)時(shí)，反應(yīng)應(yīng)時(shí)間不應(yīng)應(yīng)該太長(zhǎng)。比起三氯氯乙酸，二二氯乙酸酸酸性較弱，能能夠在一些些情況下避避免脫嘌呤呤問(wèn)題。脫脫保護(hù)后產(chǎn)產(chǎn)生的DMMT陽(yáng)離子子呈現(xiàn)出一一種深橘色色。通過(guò)測(cè)測(cè)定吸光度度，來(lái)監(jiān)測(cè)測(cè)反應(yīng)效率率。連接 脫保護(hù)護(hù)后，CPPG上的55-羥基基暴露，結(jié)結(jié)合核苷-氰乙基基亞磷酰胺胺，三亞磷磷酸酯氧化化變成磷酸酸三脂，然然后按順序序連接。對(duì)對(duì)于核苷-氰乙基基亞磷酰胺胺，為了避避免合成寡寡核苷酸過(guò)過(guò)程中負(fù)反反應(yīng)的發(fā)生生，堿基的的環(huán)外氨基基被保護(hù)以以

27、免形成酰酰胺結(jié)構(gòu)。苯甲?；糜诒Ｗo(hù)護(hù)酰苷和胞胞苷。另一一方面，異異丁?；糜糜邙B(niǎo)苷堿堿基保護(hù)。胸苷堿基基中沒(méi)有環(huán)環(huán)外的胺基基，所以不不需要保護(hù)護(hù)。-氰氰乙基亞磷磷酰胺用于于保護(hù)所有有核苷的55-羥基基。 因?yàn)楹撕塑?-氰氰乙基亞磷磷酰胺在正正常條件下下非常穩(wěn)定定，不能直直接和正在在合成鏈上上游離的55-羥基基功能基團(tuán)團(tuán)發(fā)生反應(yīng)應(yīng)。所以，它它們必須首首先通過(guò)一一種弱酸性性激活劑激激活。在各各種激活劑劑中，四唑唑作為標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)激活劑具具有很強(qiáng)的的激活作用用。四唑已已經(jīng)被認(rèn)為為具有雙重重作用：它它質(zhì)子化22-氰乙基基亞磷酰胺胺的二異丙丙氨基，產(chǎn)產(chǎn)生親核基基團(tuán)，形成成具有活性性的四唑膦膦中間產(chǎn)物物。用這

28、種種被激活的的核苷亞磷磷酰胺試劑劑耦聯(lián)反應(yīng)應(yīng)快(不到到2分鐘)，產(chǎn)量高高。氧化 新合成成的亞磷酸酸鹽和核苷苷酸之間的的鍵合不穩(wěn)穩(wěn)定，對(duì)酸酸和堿均很很敏感。因因此，三價(jià)價(jià)的亞磷酸酸三脂被氧氧化成五價(jià)價(jià)的磷酸三三脂。碘是是溫和的氧氧化劑，在在堿性的四四氫呋喃溶溶液中作為為氧的供體體。此步反反應(yīng)非?？炜?，在三十十秒內(nèi)就可可以完成。加帽 因?yàn)榻Y(jié)結(jié)合反應(yīng)在在特定的時(shí)時(shí)間內(nèi)不能能夠定量，在在每一步結(jié)結(jié)合反應(yīng)中中都有一小小段提前終終止的序列列產(chǎn)生。如如果這些序序列進(jìn)一步步參與反應(yīng)應(yīng)，產(chǎn)物將將很難從混混合序列中中分離出來(lái)來(lái)。通過(guò)加加帽，即將將自由羥基基乙?；饨鉀Q了這個(gè)個(gè)問(wèn)題。乙乙?；捎捎蓮?qiáng)的乙酰?；噭?/p>

29、完完成，該試試劑是由等等摩爾的醋醋酸酐和NN-甲基咪咪唑組成，反反應(yīng)可在330秒內(nèi)完完成。氧化化后，核苷苷酸加入，循循環(huán)完成。寡核苷酸酸合成后，移移去增長(zhǎng)鏈鏈5-末末端的DMMT基團(tuán)，下下一個(gè)核苷苷酸的聚合合循環(huán)開(kāi)始始。整個(gè)寡寡核苷酸合合成后，借借助濃氨水水的處理，寡寡核苷酸從從固相載體體上分離，同同時(shí)堿基和和磷酸基去去保護(hù)。Q16. 標(biāo)準(zhǔn)寡核核苷酸結(jié)構(gòu)構(gòu) HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOPQ17. Bionneer能能合成的最最長(zhǎng)的寡核核苷酸是多多長(zhǎng)? HYPERLIN

30、K /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP合成量0.025 moll: 500 merr合成量0.05 mol: 50 mer合成量0.1 mmol: 100 mer合成量0.2 mmol: 100 mer合成量1.0 mmol: 130 merQ18. 當(dāng)我預(yù)訂訂50nmmol的寡寡核苷酸，產(chǎn)產(chǎn)品卻不足足50 nnmol，為為什么? HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 5

31、0 nmoll的寡核苷苷酸合成不不意味著能能得到500 nmool的最終終產(chǎn)品。550 nmmol是指指在寡核苷苷酸合成開(kāi)開(kāi)始時(shí)固相相載體負(fù)荷荷的數(shù)量。寡核苷酸酸通常是反反應(yīng)所要求求的量而不不是最終產(chǎn)產(chǎn)率，用戶戶得到的核核苷酸的數(shù)數(shù)量自然要要比要求的的少。終產(chǎn)產(chǎn)率受寡核核苷酸長(zhǎng)度度、堿基組組成和連接接效率的影影響。Q19. 能合成出出高百分比比“G”的的寡核苷酸酸嗎? HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 眾所周周知，含高高百分比的的“G”寡寡核苷酸不不容易被合合成，特別別

32、是序列中中包含一行行“G”。有報(bào)道，如如果有四個(gè)個(gè)或更多的的“G”排排成一行，寡寡核苷酸將將趨向形成成鳥(niǎo)嘌呤四四聚體(PPoon and MacGGregoor,Biiopollymerrs, 19988, 455, 4227 -4434)。通過(guò)次黃黃嘌呤核苷苷置換部分分G，就能能避免四聚聚體鳥(niǎo)苷的的形成。Q20. 能提供寡寡核糖核酸酸(RNAA)合成嗎嗎？ HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 是的，我我們能合成成。我們能能提供2-OH或或/和2-O-甲基基結(jié)構(gòu)的寡寡核糖

33、核苷苷酸，也能能合成由DDNA和RRNA組成成的寡核苷苷酸。Q21. 合成的寡寡核苷酸在在3 或或5位有有磷酸基嗎嗎？ HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 如果沒(méi)沒(méi)有殊要求求,合成的的寡核苷酸酸在3或或5端均均無(wú)磷酸基基。如果你你想要3或5有有磷酸基的的寡核苷酸酸，你應(yīng)該該在訂單上上標(biāo)注清楚楚在3或或5端進(jìn)進(jìn)行磷酸化化修飾。Q22. 簡(jiǎn)并引物物及通用引引物是什么么？ HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5

34、.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOPR - a 或 gY - c 或 tM - a 或 cK - g 或 tS - g 或 cW - a 或 tV - a, cc或 gH - a, tt或 cB - g, tt或 cD - g, aa或 tN II:A I:TT=I:GG.形成穩(wěn)穩(wěn)定的堿基基配對(duì)。包包含肌苷的的寡核苷酸酸借助PCCR或探針針雜交可用用于檢測(cè)或或分析不同同的或相似似的DNAA序列。硫磷酰修飾飾法： 經(jīng)硫磷磷酰基化的的寡核苷酸酸對(duì)核酸內(nèi)內(nèi)切酶和核核酸外切酶酶的降解有有很好的抵抵抗作用，這這種特性能能增加反義義寡核苷酸酸鏈在細(xì)胞胞內(nèi)的效果果。我們可可以依據(jù)用用戶的需要

35、要，在寡核核苷酸部分分序列中用用硫磷?；脫Q核苷苷酸內(nèi)部的的磷酸基(在磷酸基基中用一個(gè)個(gè)硫原子代代替一個(gè)氧氧原子)。雙重修飾法法(5熒熒光素3 Dabbsyl & 5熒光素鈉鈉3 TTAMRAA 修飾)： 雙重標(biāo)標(biāo)記的寡核核苷酸可在在實(shí)時(shí)PCCR中用來(lái)來(lái)檢測(cè)DNNA的擴(kuò)增增。他們或或者在反應(yīng)應(yīng)中裂開(kāi)(如TaqqMan探探針)或者者在互補(bǔ)目目的DNAA存在的情情況下經(jīng)歷歷一種構(gòu)型型變化(如如分子信標(biāo)標(biāo))。許多多探針利用用寡核苷酸酸形成反向向環(huán)構(gòu)型的的特征進(jìn)行行設(shè)計(jì)。實(shí)實(shí)際上，通通過(guò)除去供供體熒光基基團(tuán)的淬滅滅作用，探探針可指示示反應(yīng)的發(fā)發(fā)生。PCR檢測(cè)測(cè)的5 核酸酶測(cè)測(cè)定法(TTaqMaan探

36、針)： 5核核酸酶測(cè)定定法被用來(lái)來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)測(cè)反應(yīng)。這這種測(cè)定法法利用耐熱熱性DNAA聚合酶的的5核酸酸外切酶的的活性來(lái)檢檢測(cè)正在進(jìn)進(jìn)行的反應(yīng)應(yīng)。耐熱性性DNA聚聚合酶能夠夠從鏈狀DDNA的55端水解解核苷酸，舊舊鏈在合成成一條新鏈鏈時(shí)被置換換。裂解主主要發(fā)生在在置換的單單鏈部分和和DNA配配對(duì)的雙鏈鏈部分的連連接處。這這導(dǎo)致單核核苷酸和寡寡核苷酸從從置換的DDNA鏈的的5末端端被釋放。DNA聚聚合酶的這這種特性被被用來(lái)監(jiān)測(cè)測(cè)反應(yīng)。在在5端核核酸酶檢測(cè)測(cè)法中FRRET DDNA雙重重探針是短短的寡核苷苷酸，與擴(kuò)擴(kuò)增DNAA靶序列和和修飾的33端互補(bǔ)補(bǔ)，以至于于他們不能能在3端端延長(zhǎng)。他他們?cè)?和

37、5末末端用熒光光基團(tuán)標(biāo)記記。報(bào)告熒熒光染料被被放置在55末端，粹粹滅劑被放放置在探針針的3末末端。在完完整的探針針中，染料料的熒光性性被消除，在在PCR反反應(yīng)中探針針與靶序列列雜交 ，借借助耐熱性性DNA聚聚合酶的55核酸酶酶的活性，淬淬滅劑與報(bào)報(bào)告基因分分離，從而而恢復(fù)報(bào)告告基因的熒熒光性。兩兩個(gè)探針被被使用，一一個(gè)用于正正常序列，另另一個(gè)用于于3 bpp缺失的互互補(bǔ)序列。每個(gè)探針針在5末末端有不同同的報(bào)告熒熒光，并且且一個(gè)相同同的粹滅劑劑染料連接接在從5末端數(shù)的的第七個(gè)核核苷酸上。靶DNAA的鑒定由由熒光發(fā)射射光譜決定定。分子信標(biāo)： 嚴(yán)格的的說(shuō)，熒光光淬滅在使使用DABBCYL分分子指示標(biāo)

38、標(biāo)中不是FFRET相相關(guān)的，因因?yàn)樗荒苣軡M足重疊疊光譜的標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)。然而而，以FRRET為基基礎(chǔ)的淬滅滅也能被使使用。分子子信標(biāo)被作作為雜交探探針后不久久被應(yīng)用于于PCR，利利用它們能能夠同互補(bǔ)補(bǔ)DNA雜雜交的原理理，它們能能夠被用來(lái)來(lái)監(jiān)測(cè)一個(gè)個(gè)正在進(jìn)行行中的反應(yīng)應(yīng)和在實(shí)時(shí)時(shí)PCR中中區(qū)別等位位基因。反反應(yīng)完成后后，反應(yīng)物物加入固定定有分子信信標(biāo)的微量量滴定孔中中，借助讀讀取產(chǎn)生的的熒光檢測(cè)測(cè)產(chǎn)物?；蚧蛘哌€可用用封閉試管管和實(shí)時(shí)程程序來(lái)檢測(cè)測(cè)。在這種種情況下，分分子信標(biāo)被被直接加入入到PCRR混合物并并且與擴(kuò)增增反應(yīng)中新新合成的DDNA雜交交。與TaaqMann探針相比比，分子信信標(biāo)優(yōu)勢(shì)在在于能

39、夠進(jìn)進(jìn)行多重PPCR檢測(cè)測(cè)，因?yàn)?，在在理論上，他他們能同時(shí)時(shí)測(cè)定更多多的產(chǎn)品。Q26. 作為反義義脫氧寡核核苷酸的硫硫磷酰化寡寡核苷酸 HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP HYPERLINK /faq5.asp#TOP#TOP l TOP#TOP TOP 隨著我我們對(duì)分子子生物學(xué)的的理解不斷斷加深，我我們慢慢獲獲得對(duì)分子子水平疾病病的認(rèn)識(shí)。合理的藥藥物設(shè)計(jì)變變得更加可可行。特別別是在蛋白白質(zhì)水平上上分子間的的反應(yīng)能夠夠被完美的的設(shè)計(jì)，通通過(guò)生物合合理的途徑徑來(lái)提高結(jié)結(jié)合性，分分子間的相相互作用成成功的被應(yīng)應(yīng)用和被最最佳化。合合成的脫氧氧寡核苷酸酸(ODN

40、Ns)已經(jīng)經(jīng)被Zammecniik和Sttepheensonn提出作為為一種新的的潛在的治治療方法，這這種方法以以一種合理理的方式與與信使RNNA疾病關(guān)關(guān)聯(lián)蛋白相相互作用，并并且特異的的抑制它的的合成。 這種被被稱為反義義策略的方方法的優(yōu)勢(shì)勢(shì)在于，通通過(guò)眾所周周知的Waatsonn-Criick堿基基配對(duì)法則則，即單鏈鏈核酸與互互補(bǔ)的寡核核苷酸鏈相相互作用形形成雙螺旋旋結(jié)構(gòu)。每每個(gè)蛋白分分子均遵循循分子生物物學(xué)的基本本機(jī)制合成成：一個(gè)基基因(雙鏈鏈DNA)攜帶一種種特定蛋白白質(zhì)的遺傳傳信息，被被轉(zhuǎn)錄成作作為信息攜攜帶者的單單鏈mRNNA，再以以此作為模模板在核糖糖體指導(dǎo)蛋蛋白質(zhì)的合合成(翻譯譯

41、)。因此此，反義策策略不被限限制于特定定類型的疾疾病而能夠夠被廣泛地地應(yīng)用。天天然的寡核核苷酸(DDNA和RRNA)不不能夠達(dá)到到作為反義義藥物候選選物的標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)，不同的的化學(xué)修飾飾將克服現(xiàn)現(xiàn)存的障礙礙，它將被被細(xì)胞吸收收，抵抗核核酸酶的降降解和提高高與mRNNA的親和和力。首先先，脫氧寡寡核苷酸(ODNss)必須能能夠穿越細(xì)細(xì)胞膜到達(dá)達(dá)細(xì)胞質(zhì)或或細(xì)胞核。一旦進(jìn)入入細(xì)胞內(nèi)部部，ODNNs就必須須抵抗核酸酸酶的降解解。最后，為為了抑制致致病基因的的表達(dá)，OODNs必必須能夠特特異性結(jié)合合并對(duì)靶mmRNA有有高度的親親和力。早早期在組織織培養(yǎng)中觀觀察到的OODNs的的活性后曾曾認(rèn)為，這這些理論上上的障礙不不值得擔(dān)心心。然而，最最近文章的的數(shù)據(jù)分析析顯示這些些理論上的的障礙確實(shí)實(shí)存在。 最近的的研究焦點(diǎn)點(diǎn)在于用化化學(xué)方法改改善ODNNs的特性性，主要集集中在核苷苷酸酶抵抗抗力和mRRNA親和和力的提高高方面。mmRNA親親和力對(duì)于于反義策略略非常重要要，它常常常