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文檔簡介
1、PAGE 分類號: 學(xué)校代碼: 10426 密級: 學(xué)號: 2011050205 碩 士 學(xué) 位 論 文MASTER DEGREE THESIS基于表面增強(qiáng)拉曼技術(shù)的DNA循環(huán)放大生物傳感方法的研究作 者: 郭園園 指導(dǎo)教師: 張書圣 學(xué)科專業(yè): 分 析 化 學(xué) 專業(yè)代碼: 070302 研究方向: 生物化學(xué)分析 2014 年 4 月 10 日 I 基于表面增強(qiáng)拉曼技術(shù)的DNA循環(huán)放大生物傳感方法的研究摘 要 本文主要做了以下幾個方面的工作:一是基于表面增強(qiáng)拉曼光譜(surface enhanced Raman scattering spectrum, SERS)檢測技術(shù)構(gòu)建了一種新型的DNA
2、循環(huán)放大方法,利用DNA酶和目標(biāo)分子結(jié)合后獨特的共反應(yīng)催化剪切活性,實現(xiàn)了高靈敏度檢測小分子物質(zhì)L-組氨酸的方法。二是將納米金粒子上分別修飾Rox分子和Cy3分子,制備了具有SERS活性的兩種納米金生物條碼,基于表面增強(qiáng)拉曼散射分析方法,結(jié)合靶DNA引發(fā)的鏈替代循環(huán)反應(yīng),實現(xiàn)了兩種目標(biāo)DNA的同時檢測。在此基礎(chǔ)上,引入雙功能適體探針,實現(xiàn)了ATP和L-組氨酸的同時檢測。具體介紹如下: 1. 利用DNA酶替代了傳統(tǒng)檢測方法中的目標(biāo)分子識別適體,基于DNA酶與目標(biāo)分子結(jié)合而引發(fā)的共反應(yīng)催化剪切活性釋放引發(fā)鏈,進(jìn)而激發(fā)鏈替代循環(huán)反應(yīng),結(jié)合發(fā)卡探針引發(fā)的循環(huán)放大方法,實現(xiàn)了小分子物質(zhì)L-組氨酸的高靈敏
3、度檢測,檢測限達(dá)0.74 nM (3)。利用引發(fā)鏈的再循環(huán)利用,固定在磁珠上的發(fā)卡探針被不斷的打開,進(jìn)而大量的生物條碼被固定到了磁珠上,實現(xiàn)了高效的源頭信號放大,并通過磁性分離和洗滌,除去過量的納米金生物條碼,降低了檢測體系的背景值,從而實現(xiàn)了L-組氨酸的高靈敏度檢測,可用于實際樣品細(xì)胞勻漿中的L-組氨酸的測定。該方法設(shè)計較為簡單,操作快捷方便,更有廣泛的適用性和良好的選擇性。2. 利用表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)高分辨率的特性,基于DNA鏈之間的堿基互補(bǔ)原理,創(chuàng)建了一種新型的電化學(xué)檢測方法,實現(xiàn)了兩種目標(biāo)DNA的同時檢測。以納米金為增強(qiáng)底物,制備了分別由Rox分子、Cy3分子修飾的兩種不同的生物條碼
4、探針。在目標(biāo)DNA存在下,發(fā)生引物鏈增長-替代反應(yīng),實現(xiàn)了源頭信號放大,使信號顯著增強(qiáng),檢測靈敏度顯著提高。3. 構(gòu)建了一種新型的DNA雙功能適體鏈,結(jié)合DNA循環(huán)放大反應(yīng),提出了一種利用表面增強(qiáng)拉曼技術(shù)同時檢測ATP與L-組氨酸的方法。在金納米粒子上分別修飾上Rox分子與Cy3分子,得到兩種不同的生物條碼。利用DNA雙功能適體鏈與兩種目標(biāo)分析物的特異性結(jié)合,釋放出兩條引物鏈,激發(fā)對應(yīng)發(fā)卡探針的循環(huán)放大反應(yīng),大量的生物條碼被固定到磁珠上。最終通過檢測固定到磁珠上的生物條碼,實現(xiàn)了兩種目標(biāo)分析物質(zhì)ATP與L-組氨酸的高靈敏度檢測。關(guān)鍵詞:適體DNA 表面增強(qiáng)拉曼光譜 納米金生物條碼 循環(huán)放大 I
5、I II BIOSENSING METHOD RESEARCH WITH DNA-RELATED CYCLES AMPLIFICATION USING SERS DETECTION TECHNOLOGYABSTRACTIn this study, a series of SERS signal amplification biosensing methods were developed with high sensitivity, easy operation and good reproducibility. First, a novel SERS method was designed
6、to detect L-histidine based on DNA amplification technique. The DNAzyme as a molecular recognition module will trigger circular hairpin assisted exponential amplification reaction simultaneously. Second, two kinds of differently modified bio-barcodes were prepared to detect the corresponding two kin
7、ds of genes based on autonomous target-displacement polymerization reaction. On this basis, a difunctional aptamer probe was introduced into the system to detect ATP and lysozyme simultaneously. These SERS biosensing method provides a universal method for quantitative analysis of genes, cells and al
8、so proteins, etc, and supplies valuable information for biomedical research.1. A novel SERS method based on DNAzyme which can specifically recognize L-histidine is demonstrated in this assay to detect L-histidine. It was confirmed that the unmodied DNAzyme had characteristic of endonuclease as long
9、as it combined with the target. In the DNA recycling amplification reaction, a large number of bio-barcodes were indirectly captured on the magnetic beads as the hairpin probes immobilized on the magnetic beads were constantly opened. The problem of high background induced by excess bio-barcodes was
10、 solved by magnetic separation. The detection limit of 0.74 nM (3) was gained with the amplification of hairpin assisted exponential amplification reaction. Due to its high sensitivity, excellent specificity and good performance in cellular homogenate, it holds great potential for the development of
11、 ultrasensitive biosensing platform for the applications in bioanalysis. III 2. A sensitive SERS detection method was developed based on hairpin assisted exponential amplification reaction and used to detect two target DNA simultaneously. The amplification process is accomplished by taking advantage
12、 of both two kinds of hairpin assisted exponential amplification reaction. Two different kinds of bio-barcodes which are modified with Rox and Cy3 respectively were prepared while gold nanoparticles works as the enhanced substrate. The rapid and sensitive analysis of target DNA demonstrated the appl
13、ealing bioanalytical features of this method.3. On the basis of the above work, we proposed a new method for detection of ATP and L-histidine simultaneously. A novel difunctional aptamer which can both recognize ATP and L-histidine was first introduced into ultrasensitive SERS biosensing application
14、s based on the DNA amplification method. Compared with the second experiment, two kinds of trigger genes were immobilized on the magnetic beads earlier and then released by the recognition of ATP and L-histidine. The two cycles which were independent and happen simultaneously as an effective amplifi
15、ed replication system were triggered. A large number of biobarcodes were immobilized on the magnetic beads indirectly. With multiple amplification steps and magnetic separation procedures, this new biosensing system exhibits high sensitivity and specificity.KEY WORDS: Aptamer DNA SERS Nano Au biobar
16、code Amplification VIII IV 目錄TOC o 1-4 h u HYPERLINK l _Toc10828 第一章 前 言 XII VI HYPERLINK l _Toc11251 2.4.2 Cy3修飾的納米金生物條碼的制備55 HYPERLINK l _Toc21925 2.5 雙適體DNA修飾的MB的制備55 HYPERLINK l _Toc23115 2.6 兩種發(fā)卡探針DNA修飾的MB的制備56 HYPERLINK l _Toc20119 2.7 循環(huán)放大反應(yīng)56 HYPERLINK l _Toc5288 2.8 SERS檢測ATP與L-組氨酸56 HYPERL
17、INK l _Toc7306 3 結(jié)果與討論57 HYPERLINK l _Toc28118 3.1 基于雙功能適體SERS傳感方法同時檢測ATP和L-組氨酸的工作原理57 HYPERLINK l _Toc6534 3.2 可行性實驗58 HYPERLINK l _Toc26729 3.3 實驗條件的優(yōu)化59 HYPERLINK l _Toc13273 3.3.1緩沖溶液pH的優(yōu)化59 HYPERLINK l _Toc24434 3.3.2實驗溫度的優(yōu)化60 HYPERLINK l _Toc20572 3.3.3 Klenow聚合酶用量的優(yōu)化60 HYPERLINK l _Toc2603 3.
18、3.4 循環(huán)反應(yīng)時間的優(yōu)化 PAGEREF _Toc2603 61 HYPERLINK l _Toc16392 3.4 基于雙功能適體同時檢測SERS傳感方法的檢測靈敏度 PAGEREF _Toc16392 62 HYPERLINK l _Toc6602 3.5 雙功能適體在實際樣品中的檢測64 HYPERLINK l _Toc6602 4 小結(jié)65 HYPERLINK l _Toc27366 參考文獻(xiàn)66 HYPERLINK l _Toc11030 結(jié) 論68 HYPERLINK l _Toc9195 致 謝69 HYPERLINK l _Toc20851 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄70
19、 HYPERLINK l _Toc29752 獨 創(chuàng) 性 聲 明 第一章 前 言1生物傳感方法生物傳感方法自誕生半個世紀(jì)以來得到了迅速的發(fā)展,同時其在食品安全監(jiān)測、臨床檢測、新藥的研發(fā)等領(lǐng)域具有廣闊的研究潛力和應(yīng)用前景。生物傳感方法并不是獨立存在的一項科學(xué)技術(shù),它與很多學(xué)科密切相關(guān),是現(xiàn)代先進(jìn)生物技術(shù)與化學(xué)、物理學(xué)、環(huán)境科學(xué)、生命科學(xué)、材料科學(xué)等諸多學(xué)科相互融合共同組成的,且在很多科研領(lǐng)域有著不可替代的作用。近些年來,化學(xué)、材料科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、生物信息學(xué)的迅猛發(fā)展為生物分析方法的不斷拓展奠定了堅實的基礎(chǔ),對相關(guān)物質(zhì)的分析不再滿足于“是什么物質(zhì)”和“含量有多少”這兩個簡單的問題,這就對分析技術(shù)的
20、精度提出了更高的要求。生物傳感分析方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點,且分析前對樣品只需簡單處理,操作簡單易行,響應(yīng)迅速,檢測時間短,檢測結(jié)果可靠且可信。1.1 生物傳感方法的檢測原理生物傳感分析方法的工作依賴于待測物質(zhì)與其識別物質(zhì)的結(jié)合,因此我們在設(shè)計一種生物傳感分析方法的時候,最重要的工作就是設(shè)計一種合適的對應(yīng)于待測物質(zhì)的分子識別適體,組織、酶、抗體、細(xì)胞、核酸等,都是生物體生命活動中進(jìn)行特異性的選擇辨別的物質(zhì)基礎(chǔ)。這些物質(zhì)通過與待測目標(biāo)物質(zhì)發(fā)生特異性識別過程相結(jié)合,進(jìn)而兩者形成一種復(fù)合物,例如基質(zhì)與酶的結(jié)合、適體與目標(biāo)分子的結(jié)合、生物抗原和抗體的結(jié)合等。信號轉(zhuǎn)換裝置的選擇也是研發(fā)高精確度、
21、高靈敏度的優(yōu)質(zhì)生物傳感器的關(guān)鍵環(huán)節(jié),通常我們依據(jù)敏感元件所引發(fā)的化學(xué)變化或者物理變化來選擇生物傳感體系的信號轉(zhuǎn)換部分。敏感元件化學(xué)反應(yīng)過程中相關(guān)物質(zhì)的生成及消耗、光以及熱都會隨著反應(yīng)的進(jìn)行產(chǎn)生一系列的變化,依據(jù)這些變化,我們可以去選擇合適的適宜于實驗體系的信號轉(zhuǎn)換裝置。由于生物的化學(xué)反應(yīng)非常復(fù)雜,因此其所產(chǎn)生的生物化學(xué)信號也是多種多樣且極難追蹤檢測,現(xiàn)代生物傳感技術(shù)的研究變得尤為重要,近些年其研究成果為檢測生物化學(xué)信息提供了極為豐富的手段。1.2生物傳感方法的分類目前,已經(jīng)研究出很多種生物傳感分析方法,根據(jù)分類標(biāo)準(zhǔn)不同,可以分成不同的類別:例如根據(jù)功能分子材料的的不同分類有:DNA生物傳感分析
22、方法、酶生物傳感方法、微生物傳感方法、活體組織傳感方法、細(xì)胞生物傳感方法、免疫傳感方法等。 1.2.1 酶生物傳感方法酶傳感方法是最早發(fā)展和研究的一類生物傳感分析方法,因此酶傳感分析技術(shù)也相對比較成熟1-6。它的工作原理是通過酶的催化作用,結(jié)合換能裝置記錄生物分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)引起的變化,進(jìn)而得到待測物質(zhì)的實際濃度等信息。目前所研制的生物葡萄糖傳感分析方法已經(jīng)用到臨床分析中。它的工作原理是將生物酶電極插到待測溶液中,溶液中所含的葡萄糖會擴(kuò)散到酶電極的表面上,進(jìn)而葡萄糖發(fā)生化學(xué)反應(yīng),在葡萄糖氧化酶的作用下被氧化生成葡萄糖酸,同時反應(yīng)消耗了一定量的氧氣,最后通過氧電極來測定溶液中所含氧氣濃度的變化,
23、從而計算出樣品中所含葡萄糖的濃度。1.2.2免疫傳感分析方法免疫傳感分析方法的基本工作原理:免疫傳感分析方法是利用抗原與抗體的特異性結(jié)合效應(yīng),先使酶與待測樣品相連接,之后酶與反應(yīng)底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng),進(jìn)而達(dá)到定量測定目標(biāo)物質(zhì)的目的。免疫傳感分析方法在生物免疫研究領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用7-11。使用免疫傳感方法這種測定技術(shù)大體主要需要三種試劑:酶作用底物、標(biāo)記物(酶標(biāo)記抗原或者抗體)、免疫吸附劑(固相抗原或者抗體)。免疫傳感分析方法主要有三種構(gòu)成方法:雙抗體夾心法、間接法、競爭法。1.2.3 細(xì)胞傳感方法細(xì)胞傳感方法因以動植物活細(xì)胞為探測單元,故由此得名。細(xì)胞傳感方法敏感性高,故其應(yīng)用范圍很廣12-15
24、,特別是在癌癥的早期診斷上:利用三乙酸纖維素膜把人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞固定于離子選擇性電極上,可以達(dá)到一個很好的腫瘤細(xì)胞傳感檢測器的作用。此時,腫瘤細(xì)胞所釋放的VEGF會刺激細(xì)胞,同時,離子選擇性電極的電位也會隨之發(fā)生相應(yīng)的變化,由此可以用來診斷早期癌癥。1.2.4 DNA生物傳感分析方法 DNA生物傳感分析方法是以DNA為分子識別元件的生物傳感方法,由于其依據(jù)DNA分子之間的相互作用或者DNA分子與其他相應(yīng)物質(zhì)的反應(yīng),因此對于分子水平的檢測具有超靈敏的效應(yīng)。將檢測探針設(shè)計為與被測目標(biāo)分子特異性識別或者與目標(biāo)DNA分子對應(yīng)堿基互補(bǔ)的單鏈DNA分子,即可實現(xiàn)對探針與目標(biāo)物之間反應(yīng)的跟蹤分析,最終可完
25、成對目標(biāo)物的分析檢測。DNA生物傳感分析方法檢測快速便捷、靈敏度高、穩(wěn)定性強(qiáng)、可重復(fù)操作,逐漸成為當(dāng)今生物分析檢測領(lǐng)域的研究熱點。2 DNA生物傳感方法簡介2.1 DNA簡介由大量核苷酸聚合而成的生物大分子化合物叫做核酸,核酸是生物體正常生命活動的基本物質(zhì)之一,其在生物體內(nèi),常被用做攜帶遺傳信息,核酸廣泛存在于動物細(xì)胞、植物細(xì)胞以及微生物細(xì)胞體內(nèi)。根據(jù)核苷酸排列順序的不同,可以分為不同的核酸。而根據(jù)其化學(xué)組成的不同,核酸又分為脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid, 簡稱DNA)與核糖核酸(Ribonucleic acid,簡稱 RNA)和。DNA在遺傳信息的貯存、傳遞以及復(fù)
26、制過程中起著重要的作用,是生物代代遺傳的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。而RNA也具有傳遞遺傳信息的作用,其主要通過自發(fā)組裝或者在生物體內(nèi)自復(fù)制來表達(dá)或傳遞遺傳信息,除此之外,RNA還在蛋白質(zhì)的合成過程中起著至關(guān)重要的作用。2.2 DNA組成和結(jié)構(gòu) DNA是一種長鏈聚合物,它的相對分子質(zhì)量非常大,大體在幾十萬甚至幾百萬,而構(gòu)成DNA的基本單元主要有三種,分別為脫氧核糖、核苷酸堿基和磷酸。DNA的長鏈骨架由脫氧核糖(即五碳糖)與磷酸分子之間以酯鍵相連構(gòu)成,排列在外側(cè),而構(gòu)成DNA的四種堿基則排列在內(nèi)側(cè)。堿基與五碳糖分子一一相連,根據(jù)遺傳密碼可指導(dǎo)合成HYPERLINK /view/15472.htm蛋白質(zhì)。 核苷
27、酸堿基分為四種,兩種嘌呤分別是鳥嘌呤(guanine G)和腺嘌呤(adenine A),兩種嘧啶分別是胞嘧啶(cytosine C)和胸腺嘧啶(thymine T)。生物之所以能夠分成不同物種,歸根結(jié)底是因為DNA的堿基組成有所不同,但是總體仍然遵循一定的規(guī)則,即HYPERLINK /view/62922.htm腺嘌呤總數(shù)必等于其HYPERLINK /view/476385.htm胸腺嘧啶總數(shù)(A=T),而HYPERLINK /view/125105.htm鳥嘌呤總數(shù)也必然等于胞嘧啶總數(shù)(G=C),因而HYPERLINK /view/1006.htm嘌呤總數(shù)之和必等于嘧啶總數(shù)之和。DNA從結(jié)
28、構(gòu)方面來講,一般可以劃分為一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和四級結(jié)構(gòu)四個水平。DNA分子的一級結(jié)構(gòu)是指DNA分子結(jié)構(gòu)中核苷酸的排列順序,即核苷酸之間通過3,5-磷酸二酯鍵連接且沒有支鏈的環(huán)狀的或者直線形結(jié)構(gòu);二級結(jié)構(gòu)則是指是指由兩條脫氧核苷酸鏈以反向平行扭曲盤繞得形式最終而形成的雙螺旋結(jié)構(gòu);DNA的三級結(jié)構(gòu)是指DNA在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)之上進(jìn)一步扭曲盤繞所形成的特定的空間結(jié)構(gòu),也稱之為超螺旋結(jié)構(gòu);DNA的四級結(jié)構(gòu)則是指HYPERLINK /view/28220.htm核酸以反式作用存在(例如核糖體、剪接體)。 HYPERLINK /v6624473.htm?ch=ch.bk.innerlinkDNA分
29、子結(jié)構(gòu)中,由于堿基之間的HYPERLINK /v215102.htm?ch=ch.bk.innerlink氫鍵具有固定的數(shù)目,并且HYPERLINK /v118459.htm?ch=ch.bk.innerlinkDNA兩條鏈之間的距離也保持固定不變,因此堿基配對需遵循一定的規(guī)律,不同堿基之間的這種一一對應(yīng)的規(guī)律叫做堿基互補(bǔ)配對原則,即Adenine(A,HYPERLINK /v277302.htm?ch=ch.bk.innerlink腺嘌呤)一定會與Thymine(T,HYPERLINK /v277235.htm?ch=ch.bk.innerlink胸腺嘧啶)配對,Guanine(G,HYPE
30、RLINK /v277227.htm?ch=ch.bk.innerlink鳥嘌呤)一定會與Cytosine(C,HYPERLINK /v277221.htm?ch=ch.bk.innerlink胞嘧啶)配對,反之亦然。 圖1-1 DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型Fig. 1-1 The structure of DNA double helix構(gòu)成DNA鏈的通過堿基間配對連接的長鏈,稱為互補(bǔ)鏈(complementary chain)。兩條互補(bǔ)鏈呈現(xiàn)出反向平行的螺旋結(jié)構(gòu),每一螺距長度為3.4 nm,內(nèi)包括10個堿基對。雖然使堿基間配對連接的氫鍵作用力非常弱,但是由于互補(bǔ)鏈之間存在著大量的堿基對,所以在
31、自然生理條件下兩條鏈不會自發(fā)地分開。但是,如果將其置于高溫下,DNA分子內(nèi)的氫鍵將會遭到破壞,于是雙螺旋結(jié)構(gòu)解離成兩條互補(bǔ)單鏈。這一過程稱為高溫變性(denaturation)。如果將變性后的兩條互補(bǔ)鏈再置于正常溫度條件下,他們又會重新自發(fā)連接形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。這一過程又稱作復(fù)性(renaturation)。由于A-T之間存在兩個氫鍵,而G-C之間存在三個氫鍵,所以就變性和復(fù)性而言,G-C所需能量比A-T高。大部分DNA自然狀態(tài)下以雙螺旋結(jié)構(gòu)存在,但一經(jīng)熱處理或堿處理就會變性為單鏈狀態(tài)。2.3 DNA酶簡介根據(jù)其功能的不同,可將DNA酶分為不同類別:DNA聚合酶、DNA連接酶、DNA限制性內(nèi)切酶
32、、DNA修飾酶、DNA解旋酶等。隨著人類基因組計劃的啟動,各種不同類別的DNA酶也得到了廣泛的應(yīng)用和研究。在DNA片段分析、重組DNA技術(shù)、基因診斷、現(xiàn)代醫(yī)學(xué)臨床實驗中,DNA酶起到了非常重要的作用。在DNA復(fù)制過程中,以一條單鏈DNA為模板,在DNA聚合酶的作用下,將單個脫氧核苷酸通過磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈,形成鏈與母鏈構(gòu)成一個DNA分子。限制性核酸內(nèi)切酶主要存在于微生物如細(xì)菌、霉菌等中。一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列,并且能在特定的切點上切割DNA分子。其最早發(fā)現(xiàn)于原核生物體內(nèi),現(xiàn)已分離出100多種,幾乎所有的原核生物都含有這種酶。2.4 核酸適體簡介近些年來經(jīng)科
33、學(xué)研究發(fā)現(xiàn),DNA和RNA除了起到遺傳信息傳遞與存儲的作用外,還有許多其他的非常重要的作用,例如經(jīng)過SELEX體外篩選技術(shù)(指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化)而篩選出的寡聚核苷酸片段,具有能特異結(jié)合細(xì)胞、蛋白質(zhì)大分子或其他小分子物質(zhì)的功能,這就是核酸適體。核酸適體能夠借助自身所形成的特異性的空間結(jié)構(gòu)與其它類型的靶分子相互作用,而利用寡核苷酸間的嚴(yán)格的識別能力與高度的親和力成功制備了人工合成寡核苷酸適體(aptamer),這種人工合成核酸適體的出現(xiàn),使抗體抗原特異性反應(yīng)發(fā)生了新的革命性的變化,彌補(bǔ)了現(xiàn)有自然存在抗體的不足,也為生物傳感器的長遠(yuǎn)發(fā)展開辟了一條嶄新的道路。核酸適體(aptamer)是由大約25-
34、80個堿基組成的寡聚核苷酸片段,能與蛋白質(zhì)、細(xì)胞、生物活性小分子等靶物質(zhì)特異性結(jié)合,對靶物質(zhì)具有高度的親和性與特異性的識別能力,既可以是DNA單鏈也可以是RNA單鏈16,17。而結(jié)合核酸適體所提出的生物傳感分析方法則是利用核酸適體與靶物質(zhì)之間的特異性識別能力進(jìn)行相關(guān)靶物質(zhì)的檢測的生化分析方法。核酸適體是一種作用類似于抗體的核酸單鏈分子。通過SELEX技術(shù)(即指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù))可以從人工構(gòu)建的隨機(jī)單鏈寡核苷酸文庫里篩選出來具有一定功能的核酸適體。首先可以利用SELEX技術(shù)從核酸文庫中篩選得到寡核苷酸片段,再將寡核苷酸片段進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reactio
35、n,PCR)進(jìn)行擴(kuò)增,最后將其排列成一個特定的識別單元18-20。1990 年,Tuerk課題組21首先利用SELEX 篩選技術(shù)得到了特異性識別噬菌體T4 DNA聚合酶的RNA適體,自此之后這項篩選技術(shù)就成為了各國科研學(xué)者的研究熱點,進(jìn)而為化學(xué)、生物以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究不斷提供大量的特異性核酸適體,增加了檢測手段,提高了待檢物質(zhì)的范圍,同時也大大提高了檢測限和檢測效率。利用SELEX 技術(shù)從庫容量為1015 左右的隨機(jī)的寡核苷酸序列庫中篩選到與待測靶分子能夠特異性識別的一系列核苷酸序列,然后繼續(xù)將這一序列通過數(shù)輪的篩選、分離與擴(kuò)增,最終得到與靶物質(zhì)結(jié)合能力最強(qiáng)的DNA單鏈或RNA單鏈。核酸適體主
36、要具有以下幾個方面的特點:(1)嚴(yán)格的識別能力與高度的親和力:寡聚單鏈DNA或者RNA可以形成多種具有熱力學(xué)穩(wěn)定性的三維空間結(jié)構(gòu),因此它與靶分子有高度的親和力。相比于其它種類的配體,核酸適體對目標(biāo)物質(zhì)的親和力解離常數(shù)約在10-12 M 10-9 M范圍之間22,23,并且有些適體的結(jié)合能力甚至超出了其天然配體。例如角質(zhì)細(xì)胞生長因子與其對應(yīng)的核酸適體結(jié)合的解離常數(shù)竟高達(dá)300 fM,是迄今為止發(fā)現(xiàn)的親和力最高的適配體對24。(2)目標(biāo)物質(zhì)范圍廣:適體所結(jié)合的靶分子不僅僅限于蛋白質(zhì)和核酸,還同樣適用于生長因子、酶、基因調(diào)節(jié)因子、植物凝集素、抗體、完整的病毒顆粒以及病原菌等。同時適體也可以用作小分子
37、量目標(biāo)分子的檢測,包括輔因子、藥物、金屬離子、氨基酸、氨基糖苷、以及抗生素等。(3)人工合成、便于修飾。經(jīng)過篩選后的核酸片段可以通過人工合成路徑得到,不依賴于細(xì)胞或者動物,所需費用低??筛鶕?jù)其用途在特定的位置修飾上標(biāo)記物或者官能團(tuán)且不影響核酸適體本來的生物活性,例如生物素標(biāo)記、熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記、放射性標(biāo)記,從而實現(xiàn)核酸適體分子由單功能向多功能的轉(zhuǎn)化。(4)用于診斷性實驗的廣泛性:適體與靶分子之間的的特異性結(jié)合類似于抗原抗體特異性識別所形成的復(fù)合物,其結(jié)合信號能通過多種方式表現(xiàn)出來,因此可以應(yīng)用分子信標(biāo)、流式細(xì)胞技術(shù)、熒光偏振、傳感器以及毛細(xì)管電泳等多種檢測手段,其應(yīng)用的普遍性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過抗體。(5
38、)穩(wěn)定性好:核酸適體具有良好的穩(wěn)定性,可以反復(fù)變性、復(fù)性而不損傷其生物活性。因此將核酸適體凍成干粉后可以保存數(shù)年,取出后適當(dāng)溶解又可以立刻恢復(fù)其生物功能,因此核酸適體與抗體相比具有很多優(yōu)勢。近幾年來,核酸適體生物傳感器的研究得到了迅猛的發(fā)展,在新型核酸適體傳感器的設(shè)計方面、其分析特征例如靈敏度、穩(wěn)定性以及線性范圍的改善方面,以及其應(yīng)用范圍的拓展等研究領(lǐng)域均取得了顯著的成果25。3 表面增強(qiáng)拉曼散射光譜3.1 拉曼散射光譜簡介3.1.1 拉曼散射光譜簡介1928年,印度物理學(xué)家拉曼(ChandrasekharaV.Raman)在研究苯的光散射時,發(fā)現(xiàn)當(dāng)光透過透明介質(zhì)時,被散射的光頻率發(fā)生了變化,
39、這一現(xiàn)象稱為拉曼散射現(xiàn)象,即在散射光中不僅包括頻率與入射光相同的譜線,而且還包括頻率不同于入射光且強(qiáng)度極其微弱的譜線。人們將這一光譜以發(fā)現(xiàn)者拉曼的名字命名,稱為拉曼散射光,與之對應(yīng)的這種光現(xiàn)象稱作拉曼效應(yīng)26,27。1930年,拉曼先生因這一發(fā)現(xiàn)獲得諾貝爾物理學(xué)獎。1960年,激光的出現(xiàn),致使拉曼光譜這一分子振動光譜技術(shù)得到了前所未有的飛速發(fā)展,進(jìn)而逐漸成為研究各類物質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)以及分子結(jié)構(gòu)的重要手段,從而得到了化學(xué)家、物理學(xué)家以及生物學(xué)家等的廣泛關(guān)注。光散射是自然界中普遍存在的現(xiàn)象。波數(shù)為0的單色光照到分子時,會和其中的電子發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用,致使分子極化,因此產(chǎn)生了散射光。當(dāng)作為散射中心的
40、分子與激發(fā)光的光子相互作用時,可能發(fā)生兩種情況,即彈性碰撞與非彈性碰撞。如果發(fā)生彈性碰撞,光子與分子之間不存在能量交換現(xiàn)象,這時的散射光僅改變反射方向,不改變光的頻率,這種光散射過程被稱為瑞利散射,瑞利散射是一種彈性散射。而另外的少數(shù)入射光發(fā)生非彈性碰撞,過程中產(chǎn)生的散射光大約占總散射光的10-610-8,這部分光子與分子之間會發(fā)生能量交換,光量子會或者轉(zhuǎn)移一部分能量給散射分子,或者從散射分子束中吸收一部分能量,因此最終這部分光不僅改變了傳播方向,也改變了頻率。這種頻率發(fā)生變化的散射稱為拉曼(Raman)效應(yīng),拉曼散射是一種非彈性散射28。 如圖1-2所示,在入射光照射下,分子由基態(tài)(或振動激
41、發(fā)態(tài)E1)被激發(fā),躍遷到一個受激虛態(tài)(virtual state),該狀態(tài)是介于基態(tài)與電子第一激發(fā)態(tài)之間的一個態(tài)勢,之后發(fā)出光子,分子又躍遷重新回到振動激發(fā)態(tài)E1(或基態(tài)E0),這個過程對應(yīng)于彈性碰撞,光子得到或失去的能量與分子得到或失去的能量相等,這種散射線即叫做瑞利散射線?;瘜W(xué)鍵或基團(tuán)不同,其振動能級也會不同,E代表指定能級的相應(yīng)變化。與其相對應(yīng)的光子的頻率變化也是特異性的,根據(jù)對應(yīng)光子頻率的變化的不同可以判斷出分子所包含的化學(xué)鍵的類別或基團(tuán)的類別。不同的物質(zhì)有自己的特征拉曼光譜,因此拉曼光譜可以用于物質(zhì)的定性或者表征。拉曼譜線會成對出現(xiàn)且其譜線寬度一般比較窄,短于入射光波長(0+)一邊的
42、譜線定義為反斯托克斯(anti-Stokes)線,長波長(0-)一邊的定義為斯托克斯線(Stokes)。斯托克斯線(Stokes)和反斯托克斯線(Anti-stokes)在常態(tài)下同時存在,且分為高能態(tài)與低能態(tài),但是由于分子總能量遵守Boltzmann定律,因此處于低能態(tài)的分子總數(shù)總是比處于高能態(tài)上的分子總數(shù)多,所以通常斯托克斯線強(qiáng)度會比反斯托克斯線要強(qiáng)很多29。圖1-2 能級示意圖Figure 1-2 the schematic diagram of energy level model3.1.2拉曼散射的特點與紅外吸收光譜類似,從拉曼光譜中,我們也可以得到關(guān)于分子振動或者轉(zhuǎn)動的信息,但這兩種
43、光譜在原理上卻有很大的差別。拉曼光譜是一種散射光譜,而紅外光譜則是一種吸收光譜;拉曼散射的產(chǎn)生原理是由于分子振動時極化率會發(fā)生變化,而紅外光譜的產(chǎn)生原理卻是由于分子振動時偶極矩發(fā)生變化;拉曼光譜與紅外光譜實際中經(jīng)?;パa(bǔ),測試具有對稱中心的分子,如果得到的拉曼散射是非活性的,則其紅外吸收光譜往往是活性的;反之,如果拉曼散射是活性的,則紅外吸收光譜往往呈現(xiàn)非活性。對于很多特殊基團(tuán),常常同時具有紅外活性與拉曼活性。目前拉曼光譜分析技術(shù)已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用,對于物質(zhì)的鑒定、分子結(jié)構(gòu)的研究,拉曼光譜提供了一種有效的鑒定手段。拉曼散射光譜具有以下特點:(1)雖然拉曼散射光譜的波數(shù)會隨著入射光波數(shù)的不同而變
44、化,但是對于同一樣品,同一拉曼譜線的位移則只與樣品的振動轉(zhuǎn)動能級有關(guān),而與入射光的波長無關(guān);(2)如果以波數(shù)為變量制作拉曼光譜圖,則斯托克斯線和反斯托克斯線會對稱地分布于瑞利散射線的兩側(cè)。(3)一般情況下,斯托克斯線的強(qiáng)度會比反斯托克斯線的強(qiáng)度大。這是由于Boltzmann分布定律,處于振動基態(tài)上的粒子總數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于處于振動激發(fā)態(tài)上的粒子總數(shù)。拉曼光譜技術(shù)具有很多優(yōu)點:(1)拉曼光譜檢測技術(shù)快速、操作過程簡單且可重復(fù)操作、對樣品無損傷、所需樣品量微,可對痕量樣品進(jìn)行定性和定量分析,拉曼光譜分析無需樣品準(zhǔn)備,可將樣品直接通過光纖探頭測量或者通過光纖、玻璃和石英測量。(2)由于水的拉曼散射線強(qiáng)度微弱
45、,因此拉曼光譜是研究溶解于水中的生物樣品或者化合物的理想工具。(3)拉曼光譜可以一次同時覆蓋50-4000波數(shù),操作時只需根據(jù)需要設(shè)置相應(yīng)波數(shù)區(qū)間即可,可對無機(jī)物及有機(jī)物進(jìn)行分析。相反,紅外光譜若想一次同時覆蓋相同的區(qū)間,則必須通過改變?yōu)V波器、光柵、檢測器和光束分離器,操作過程相對繁瑣。(4)拉曼光譜譜峰形狀尖銳清晰,更適合用于數(shù)據(jù)庫搜索、定量研究以及根據(jù)特征譜圖進(jìn)行定性研究。(5)因為激光束的直徑非常微小,其在自身聚焦部位通常只有0.2-2毫米大小,因此只需少量的樣品就可以得到其特征拉曼光譜。而且,結(jié)合拉曼顯微鏡物鏡,可將激光束進(jìn)一步進(jìn)行聚焦最終達(dá)到1-20微米的程度,可分析面積微小的樣品。
46、3.2表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)3.2.1表面增強(qiáng)拉曼散射簡介拉曼光譜能夠提供測試分子的結(jié)構(gòu)化學(xué)鍵或者基團(tuán)的信息,并且測試結(jié)果不受水溶劑的影響,還可以根據(jù)不同的樣品選擇不同波長的激發(fā)光。但是拉曼光譜也存在一些局限性,例如其測試靈敏度低、空間分辨率易受衍射極限的限制等。并且在散射光中,拉曼光譜的光強(qiáng)大約僅僅是入射光強(qiáng)度的10-610-9。因此普通拉曼光譜的信號強(qiáng)度非常低,而且激光激發(fā)分子在產(chǎn)生拉曼散射信號的同時,常常也會伴有熒光信號的產(chǎn)生,因此拉曼信號很容易被熒光信號所掩蓋,在實際操作中難以得到理想的拉曼散射光譜圖像,所以拉曼信號的靈敏度太小,遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足研究分子的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的需求。綜合以上原因,拉曼
47、光譜在最初被發(fā)現(xiàn)以后,應(yīng)用范圍很窄,在表面科學(xué)中的應(yīng)用極少,起初僅僅被用作紅外光譜的補(bǔ)充,用以鑒別部分有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)、構(gòu)象以及官能團(tuán)。之后,隨著表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)的出現(xiàn),上述研究中拉曼光譜的局限被逐一克服,拉曼光譜在表面科學(xué)中的應(yīng)用飛速發(fā)展起來。由于具有拉曼效應(yīng)的體系易受多方面因素的影響且組成一般比較復(fù)雜,因此SERS理論發(fā)展也一直比較遲緩。各國科研人員雖從各種角度對表面增強(qiáng)拉曼光譜效應(yīng)做出解釋,但截至目前為止,學(xué)術(shù)界對表面增強(qiáng)拉曼光譜效應(yīng)的增強(qiáng)機(jī)理的解釋仍未達(dá)成共識30。但是目前就總的來說,能夠被人們廣泛接受的SERS增強(qiáng)機(jī)理主要有兩種,即電磁場增強(qiáng)和化學(xué)增強(qiáng)31,將這兩種機(jī)理結(jié)合能很好
48、的解釋拉曼光譜效應(yīng)的增強(qiáng)原理。依據(jù)電磁場增強(qiáng)機(jī)制說,納米粒子附近電場的強(qiáng)度被大大增強(qiáng)32。而依據(jù)化學(xué)增強(qiáng)機(jī)制說,由于納米粒子與分子之間相互作用,導(dǎo)致分子電子態(tài)產(chǎn)生了變化,進(jìn)而導(dǎo)致分子激發(fā),亦或是納米粒子與分子電荷相互轉(zhuǎn)移的共振增強(qiáng)33。學(xué)者們一般認(rèn)為 SERS 增強(qiáng)效應(yīng)中電磁場對其貢獻(xiàn)較多,而化學(xué)增強(qiáng)貢獻(xiàn)較少。正是由于這一原因,電磁場增強(qiáng)學(xué)說在 SERS 研究領(lǐng)域中備受關(guān)注。 表面增強(qiáng)拉曼光譜作為一種分析檢測手段,具有相對于其他分析方法的明顯優(yōu)勢,主要可總結(jié)為以下三個方面: (1)靈敏度高:表面增強(qiáng)拉曼光譜其增強(qiáng)因子最高可達(dá)10141015,因此結(jié)合SERS可進(jìn)行單分子檢測,并且和其他分析方法
49、相比,其檢測靈敏度絲毫不遜色。 (2)選擇性高:因可在待測樣品表面直接選擇測試點,結(jié)合光譜共振增強(qiáng)的特性,表面增強(qiáng)拉曼光譜可在極其復(fù)雜的體系中選擇性地僅增強(qiáng)目標(biāo)分子或分子基團(tuán),使最終得到的光譜信息明了簡單。 (3)檢測條件溫和:由于溶劑水對SERS基本無影響,因此SERS能夠直接用于檢測水溶液體系,而且樣品的狀態(tài)不受限制,可以是固態(tài)、液態(tài)甚至是汽態(tài)。SERS在生化分析研究領(lǐng)域應(yīng)用的諸多獨特優(yōu)點34,35,現(xiàn)概括如下:1、SERS作為一種振動光譜技術(shù),具有非??斓墓庾V采集速度。2、將SERS的分析物質(zhì)修飾或者固著在在貴金屬的表面,可以達(dá)到猝滅背景熒光的作用。3、拉曼與紅外互補(bǔ)作用:因SERS具有
50、嚴(yán)格的特異性,所以一些低頻振動峰若超出紅外吸收范圍,在一定條件下可以被SERS觀測到,因此在分析領(lǐng)域可將紅外與SERS結(jié)合使用。4、SERS是一種近場效應(yīng),只有當(dāng)接近或者直接位于表面的分子才可以被檢測到,由于這一性質(zhì),SERS成為生物分子間相互作用研究、痕量分析以及表面研究等的有力工具。5、由于水分子的SERS效應(yīng)很弱,因此可以將SERS很好的應(yīng)用于實際生物環(huán)境中。6、SERS的半峰寬較窄,分辨率很高,因此可以用于多元分析。 1974年,F(xiàn)leisschman等人通過將光滑的銀電極表面進(jìn)行粗糙化處理,首次獲得了高信噪比的吡啶分子的拉曼光譜,之后通過對這一現(xiàn)象進(jìn)行分析,得出由于經(jīng)過粗糙化處理的電
51、極表面面積大大增加,使電極表面附著了更多的吡啶分子,因此最終得到的拉曼信號強(qiáng)度大大增強(qiáng),這一猜想并沒有把信號增強(qiáng)的原因歸于電極粗糙表面本身,但卻為表面拉曼增強(qiáng)光譜的發(fā)展奠定了良好的基礎(chǔ)。 1977年, Van Duyne和Creighton等人重復(fù)了Fleisschman的實驗操作,發(fā)現(xiàn)如果將吡啶分子吸附在粗糙銀電極表面,那么所得到的單個吡啶分子的拉曼信號要比在溶液中的單個吡啶分子的拉曼信號強(qiáng)大約106倍。1979年,Creighton等人將吡啶分子置于銀溶膠和金溶膠中進(jìn)行研究,最后也觀測到了拉曼散射信號增強(qiáng)的現(xiàn)象。之后的許多研究都證實,當(dāng)待測分子被吸附到金、銀或者銅的粗糙化表面時,拉曼信號都
52、會被顯著地增強(qiáng)。1997年,Nie小組36利用氬離子激光器結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼光譜進(jìn)行研究,采用514.5 nm激發(fā)光,將羅丹明6G染料分子吸附于單個的銀納米顆粒上的表面上,最終得到了其增強(qiáng)共振拉曼光譜圖(SERS),經(jīng)計算發(fā)現(xiàn)羅丹明分子的增強(qiáng)因子高達(dá)1014-1015。以上一系列重要的研究進(jìn)展大大促進(jìn)了SERS在生化分析中的應(yīng)用。由于表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)具有高靈敏度和高選擇性的優(yōu)點,其在食品檢測領(lǐng)域也得到了廣泛的應(yīng)用。Theodore P. Labuza小組37利用適體的特異性結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)用于食品中蓖麻毒蛋白的檢測。如圖1-3所示,將適體探針固定在銀枝晶體結(jié)構(gòu)上,通過目標(biāo)分析物質(zhì)蓖麻
53、毒蛋白與適體結(jié)合前后拉曼信號的變化來測定目標(biāo)分析物的含量。體系中適體探針的使用簡化了操作流程,提高了分析靈敏度,在PBS中檢測限低達(dá)10 ngmL-1,在實際樣品橙汁中檢測限達(dá)50ngmL-1。圖1-3 SERS適體傳感器檢測蓖麻毒蛋白原理示意圖Figure 1-3 Schematic illustration of the SERS aptamer-based biosensor for ricin detection樊春海38等人將納米滾環(huán)復(fù)制放大方法與表面增強(qiáng)拉曼散射結(jié)合,用于蛋白質(zhì)微陣列的檢測之中。如圖1-6所示,實驗中,將蛋白質(zhì)和單鏈DNA同時固定到金納米粒子基底上,單鏈DNA作為引
54、物生長出DNA長鏈,因此大量的SERS活性探針被固載到納米基底上,使之繼續(xù)參與到生物分子的識別檢測中。如圖1-4所示,拉曼信號大大增強(qiáng),檢測靈敏度大大提高。圖1-4 納米滾環(huán)復(fù)制增強(qiáng)SERS光斑效應(yīng)在蛋白質(zhì)微陣列檢測中的應(yīng)用Figure 1-4 Schematic illustration of enhanced SERS hot spots in protein microarray analysis表面增強(qiáng)拉曼散射雖然具有很多優(yōu)點,但是也同時存在很多限制,例如:對特定目標(biāo)分析物信號放大倍數(shù)不高、信號分布不均勻、吸附效應(yīng)明顯等。因此,在本課題中,將表面增強(qiáng)拉曼與DNA循環(huán)放大技術(shù)相結(jié)合,大大
55、提高了檢測的靈敏度,避免了上述不足。4 DNA循環(huán)放大技術(shù)在DNA 生物傳感器實際應(yīng)用過程中,人們通常會引入DNA 循環(huán)放大技術(shù),該技術(shù)能夠有效的提高檢測的靈敏度,其中包括一些常用的放大技術(shù),如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、聚合酶鏈置換反應(yīng)、滾環(huán)復(fù)制放大反應(yīng)、鏈取代反應(yīng)等。4 .1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(即Polymerase Chain Reaction,PCR)是在生物體外放大擴(kuò)增特定的DNA片段的常用方法。由于DNA在自然狀態(tài)下呈現(xiàn)雙鏈結(jié)構(gòu),在體外溫度高于95 時會解鏈成兩條單鏈,這時加入引物鏈,退火使引物鏈與母鏈根據(jù)堿基互補(bǔ)配對的原則雜交結(jié)合,在DNA聚合酶的作用下,沿著磷酸到
56、五碳糖的方向合成其互補(bǔ)鏈。經(jīng)過 HYPERLINK /view/20616.htm t _blank 高溫變性、低溫退火以及適溫延伸這幾個簡單步驟周期循環(huán)進(jìn)行,最終使目的DNA得以迅速擴(kuò)增,這種DNA擴(kuò)增方法具有靈敏度高、 HYPERLINK /view/552529.htm t _blank 特異性強(qiáng)、對樣品純度要求低,省時且操作簡單等優(yōu)點。目前很多領(lǐng)域都應(yīng)用到了PCR技術(shù),它不僅可以檢測基因序列、體外檢測基因突變、幫助擴(kuò)增特定DNA片段,還可以用于疾病的診斷,例如直接用于臨床標(biāo)本包括毛發(fā)、細(xì)胞、活生物組織、血液、體液等DNA擴(kuò)增檢測。4 .2 雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)雜交鏈?zhǔn)?HYPERLINK /f
57、anying_107169/ o 醫(yī)學(xué)百科:反應(yīng) 反應(yīng)(hybridizationchainreaction, HCR)在生化分析領(lǐng)域應(yīng)用廣泛,其原理是基于自然狀態(tài)下處于 HYPERLINK /yawentai_119500/ o 醫(yī)學(xué)百科:亞穩(wěn)態(tài) 亞穩(wěn)態(tài)的發(fā)夾DNA,在體系中加入與發(fā)卡DNA部分互補(bǔ)的一條單鏈DNA啟動分子,當(dāng)單鏈DNA啟動分子與亞 HYPERLINK /wentai_107137/ o 醫(yī)學(xué)百科:穩(wěn)態(tài) 穩(wěn)態(tài)的發(fā)夾DNA結(jié)合時,發(fā)夾 HYPERLINK /jiegou_119288/ o 醫(yī)學(xué)百科:結(jié)構(gòu) 結(jié)構(gòu)被打開,因此DNA發(fā)夾的空間構(gòu)象因而 HYPERLINK /fash
58、eng_16282/ o 醫(yī)學(xué)百科:發(fā)生 發(fā)生改變,發(fā)卡末端暴露在體系中,之后不斷地結(jié)合并打開新的DNA發(fā)夾,最終得到一條條的長雙鏈聚合體。Dietmar Knopp39等人利用雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)設(shè)計了一種高效檢測人體免疫球蛋白IgG的方法。如圖1-5所示,當(dāng)IgG出現(xiàn)時,在金膠納米粒子上即形成了夾心型免疫復(fù)合物,同時,由于金膠納米粒子上眾多DNA引發(fā)鏈的存在,即發(fā)生雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)HCR,大量的修飾了二茂鐵分子的發(fā)卡結(jié)構(gòu)被固定到了金膠粒子上,最終實現(xiàn)了信號的放大。此方案還有廣泛的適用性,稍加改動即可實現(xiàn)其他蛋白質(zhì)或者生物信標(biāo)的檢測。圖1-5 雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的工作原理示意圖43Figure 1-5 Sch
59、ematic diagrams showing the design and operating principles of HCR43 4 .3 聚合酶鏈置換反應(yīng)聚合酶鏈置換反應(yīng)是指,在體系中加入一種含有內(nèi)切酶特定識別位點的DNA單鏈模板、與模板部分互補(bǔ)的前體鏈(primer)以及特異性單鏈DNA內(nèi)切酶、DNA聚合酶和單體脫氧核苷酸dNTPs,這時前體鏈primer DNA在聚合酶的作用下沿模板鏈向前生長,形成與模板鏈堿基完全互補(bǔ)的雙鏈結(jié)構(gòu),此時在DNA內(nèi)切酶的作用下,所形成的與模板互補(bǔ)的單鏈在內(nèi)切酶特定識別位置被剪切,而前體鏈繼續(xù)生長,進(jìn)而替代原先形成的單鏈DNA,如此循環(huán)反應(yīng),最終可得到
60、大量的單鏈DNA。圖1-6 基于聚合酶鏈置換反應(yīng)檢測端粒酶示意圖Figure 1-6 Analysis of telomerase based on Strand-Displacement Polymerization Reaction 我們課題組40設(shè)計了一種利用聚合酶鏈置換反應(yīng)檢測端粒酶的方案,如圖1-6所示,體系中加入兩條引物鏈,在引物鏈1和端粒酶的共同作用下,末端修飾著熒光基團(tuán)的發(fā)卡探針被打開,發(fā)出熒光,同時,由于系統(tǒng)中還存在引物鏈2,將發(fā)生聚合酶鏈置換反應(yīng),將引物鏈1置換重新進(jìn)入體系中參與循環(huán)。4 .4 滾環(huán)復(fù)制循環(huán)放大反應(yīng)在以這種機(jī)制進(jìn)行的復(fù)制中,DNA聚合便可以將脫氧核糖核苷酸聚
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