人體顯微形態(tài)學(xué)技術(shù)綜合內(nèi)容

1、人體顯微形態(tài)學(xué)技術(shù)綜合內(nèi)容第1頁，共23頁，2022年，5月20日，9點47分，星期日一、動物取材（一）動物處死要求： 動作迅速，及時解剖、取材與固定第2頁，共23頁，2022年，5月20日，9點47分，星期日（二）動物處死的方法： 可采用麻醉法、空氣栓塞法、頸椎脫臼或斷頭、動脈放血等。1、狗用麻醉法或擊頭法2、貓用窒息法3、兔用栓塞法4、小白鼠用斷頸法第3頁，共23頁，2022年，5月20日，9點47分，星期日（三）動物取材選擇 根據(jù)實驗要求首先選擇動物種類，其次選擇組織部位及取材的大小，取材時應(yīng)熟悉組織器官的結(jié)構(gòu)特點。1、動物選擇2、部位選擇3、切面方向選擇第4頁，共23頁，2022年，5

2、月20日，9點47分，星期日（四）取材要求1、新鮮2、小而薄 1.5cm1.5cm 0.5cm 3、保持原有的形態(tài)4、注意環(huán)境溫度的影響5、刀、剪要鋒利第5頁，共23頁，2022年，5月20日，9點47分，星期日二、動物組織固定（一）固定的目的和意義： 防止離體組織、細胞自溶與腐敗，保持組織、細胞與生活時相似的形態(tài)和結(jié)構(gòu)； 使細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪、糖、酶等各種成分轉(zhuǎn)變成不溶性物質(zhì)，使其保持原有的結(jié)構(gòu)； 使組織中的各種物質(zhì)沉淀、凝固后產(chǎn)生不同的折射率，形成光學(xué)上的差異，以便染色后易于觀察和鑒別； 固定劑有硬化作用，可增加組織硬度，便于制片； 保存抗原及DNA、RNA，特別是準備用于做免疫組化染色

3、和核酸原位雜交的標(biāo)本，及時而恰當(dāng)?shù)墓潭ㄓ绕渲匾?第6頁，共23頁，2022年，5月20日，9點47分，星期日（二）動物組織取材與固定1、成年家兔栓塞法處死 取下列組織心肌 （心臟乳頭?。┤階DF液中固定24h骨骼?。ㄉ嗉。┤胫行约兹┑墓潭ㄒ阂褐泄潭?4h神經(jīng)節(jié)（頸胸椎處）入高爾基體固定液中固定18h脊髓（頸胸椎處）入2%的硝酸銀水溶液中固定每班兩只 兩組同學(xué)完成。第7頁，共23頁，2022年，5月20日，9點47分，星期日2、成年貓窒息法處死 取下列組織神經(jīng)節(jié)（頸胸椎處）入高爾基體固定液中固定脊髓（頸胸椎處）入2%的硝酸銀水溶液中固定卵巢 入中性甲醛固定液中固定膈肌入中性甲醛固定液中固定 每

4、班壹只 兩組同學(xué)完成第8頁，共23頁，2022年，5月20日，9點47分，星期日3、一月齡家兔栓塞法處死 取肋間肌，剪成0.2cm0.2cm見方的肌肉顆粒（共剪100顆）。取剪好的肌肉組織入蟻酸溶液中固定15min左右，呈半透明狀即可。不經(jīng)水洗，直接放入1%的氯化金水溶液中浸染15-60min左右，肉眼觀察見肌肉組織呈金黃色即可，如已成棕色表明浸染過度，所以應(yīng)隨時觀察。將已經(jīng)還原好的肌肉組織用蒸餾水滌數(shù)次，放在濾紙上將組織上的水分沾干，再轉(zhuǎn)入甘油酒精（甘油一份，50%酒精一份）中保存?zhèn)溆?。?頁，共23頁，2022年，5月20日，9點47分，星期日4、小白鼠 斷頸法處死 取小腸，用生理鹽水將腸

5、道內(nèi)清洗干凈，剪成2cm長的小段，入Regaud固定液中固定 第10頁，共23頁，2022年，5月20日，9點47分，星期日線粒體切片標(biāo)本的制作1、取材： 小白鼠小腸或肝2、固定：入Regaud固定液固定2天（每天需更換一次固定液）3、媒染：入3%重鉻酸鉀水溶液中媒染7天（每兩天更換一次新液）4、沖洗：先用自來水沖洗24小時，然后用蒸餾水浸洗數(shù)次。第11頁，共23頁，2022年，5月20日，9點47分，星期日5、脫水透明：在酒精中從低濃度到高濃度依次脫水，100%以下的濃度每次1小時，在100%酒精中2次，每次30分鐘，轉(zhuǎn)入二甲苯2次透明，每次30分鐘。6、浸蠟包埋：等量二甲苯與軟蠟1次，軟蠟

6、1次，硬蠟1次，每次30分鐘，用紙盒或金屬包埋盒包埋。（包埋時注意切面方向）第12頁，共23頁，2022年，5月20日，9點47分，星期日7、切片貼片烤片：載玻片上涂少許蛋白甘油，切片厚度2-4微米，在貼片容器中貼片，入37 。C恒溫箱中烘烤24小時。8、脫蠟入水：二甲苯2次，每次10min, 100%酒精中2次,每次5min, 100%以下的濃度每次2min，下行至蒸餾水。9、媒染：入5%鐵明礬水溶液中媒染24小時（ 37 。C恒溫箱中）。10、染色：蒸餾水速洗后入蘇木精染液中染色24小時。第13頁，共23頁，2022年，5月20日，9點47分，星期日11、分色：蒸餾水速洗后入2.5%鐵明礬

7、水溶液中分色，數(shù)秒后，顯微鏡下鏡檢，見細胞核和線粒體呈黑色，細胞質(zhì)呈無色或灰色即可。此步驟非常關(guān)鍵，一定要不間斷鏡檢。12、返藍：自來水浸泡數(shù)小時13、脫水透明：與第8步驟（脫蠟入水）相反方向操作即可。14、鏡檢封固：鏡下檢查，染色合格的切片滴1滴中性樹膠，蓋上蓋玻片。放入涼片盒中。第14頁，共23頁，2022年，5月20日，9點47分，星期日高爾基體切片標(biāo)本的制作1、取材： 貓或兔的神經(jīng)節(jié)2、固定：入高爾基體固定液固定8-18小時3、沖洗：用蒸餾水速洗2次。4、鍍銀：入2%硝酸銀水溶液中鍍銀48小時（室溫下、避光）5、沖洗：用蒸餾水速洗2次6、還原：入硝酸銀還原液中24小時第15頁，共23頁

8、，2022年，5月20日，9點47分，星期日7、沖洗：用蒸餾水速洗2次8、脫水透明：在酒精中從低濃度到高濃度依次脫水，100%以下的濃度每次40分鐘，在100%酒精中2次，每次20分鐘，轉(zhuǎn)入二甲苯2次透明，每次20分鐘。9、浸蠟包埋：等量二甲苯與軟蠟1次，軟蠟1次，硬蠟1次，每次20分鐘，用紙盒或金屬包埋盒包埋。第16頁，共23頁，2022年，5月20日，9點47分，星期日10、切片貼片烤片：載玻片上涂少許蛋白甘油，切片厚度3-6微米，在貼片容器中貼片，入37 。C恒溫箱中烘烤24小時11、脫蠟入水：二甲苯2次，每次10min, 100%酒精中2次,每次5min, 100%以下的濃度每次2mi

9、n，下行至蒸餾水。12、調(diào)色：入1%氯化金水溶液中2小時第17頁，共23頁，2022年，5月20日，9點47分，星期日常規(guī)組織切片制作（HE染色） 組織切片的染色方法很多，最常用的是HE染色法，該方法適用于人體或動物多種組織，對任何液體固定的組織和各種包埋的切片均可使用，所以， HE染色法顯微制片技術(shù)的基本方法。第18頁，共23頁，2022年，5月20日，9點47分，星期日1、取材： 動物多種組織（如：大動脈、大靜脈、腹腔AV伴行處 、疏松結(jié)締組織、膀胱、鼻腔上皮組織 、胃、睪丸、輸精管、體皮、腦垂體、大腦皮質(zhì)、卵巢 等）2、固定：入中性甲醛固定液中固定24小時3、沖洗：自來水沖洗時間24小時

10、。4、脫水透明：在酒精中從低濃度到高濃度依次脫水，100%以下的濃度每次2小時，在100%酒精中2次，每次1.5小時，轉(zhuǎn)入二甲苯2次透明，每次1.5小時。第19頁，共23頁，2022年，5月20日，9點47分，星期日5、浸蠟包埋：等量二甲苯與軟蠟1次，軟蠟2次，硬蠟2次，以上各級每次1-1.5小時，用紙盒或金屬包埋盒包埋。6、切片貼片烤片：載玻片上涂少許蛋白甘油，切片厚度6-8微米，在貼片容器中貼片，入37 。C恒溫箱中烘烤24小時。第20頁，共23頁，2022年，5月20日，9點47分，星期日7、脫蠟入水：二甲苯2次，每次10min, 100%酒精中2次,每次5min, 100%以下的濃度每次2min，下行至蒸餾水。 以下程序按教材材要求進行。 注意事項： 在0.5%的鹽酸酒精中分色過程中，數(shù)秒后，必須要在顯微鏡下鏡檢，見細胞核呈藍色，細胞質(zhì)呈無色或灰色即可。此步驟非常關(guān)鍵，一定要不間斷鏡檢。第21頁，共23頁，2022年，5月20日，9點47分，星期日神經(jīng)元纖維切片的制作1、取材： 貓或兔的脊髓2、固定：入2%硝酸銀水溶液固定3-6d，避光,35 。C恒溫箱中。3、沖洗：用蒸餾水速洗2次。4、還原：室溫入硝酸銀還原液24小時。5、沖洗：用蒸餾水速洗2次6、脫水：入100%酒精脫水24小時第22頁，共23頁，2022年，5月2