分子生物學(xué)-分子生物學(xué)技術(shù)的臨床應(yīng)用

1、第十三章分子生物學(xué)技術(shù)的臨床應(yīng)用基因診斷（gene diagnosis）是以探測(cè)基因的存在，分析基因的類型和缺陷及其表達(dá)功能是否正常，從而達(dá)到診斷疾病的一種方法。它是繼形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)診斷之后的第四代診斷技術(shù)。是一種病因?qū)W診斷方法 疾病基因診斷的基礎(chǔ)基因變化是大多數(shù)疾病的主要病因。人類疾病可大致分為3類: 單基因?。ㄓ梢粋€(gè)基因位點(diǎn)突變引起） 多基因?。ㄈ绺哐獕骸⑻悄虿『湍[瘤等） 獲得性基因?。ǜ腥拘约膊。┰诨蛩缴峡蓪?duì)大多數(shù)疾病作出診斷。 第一節(jié) 基因診斷常用技術(shù)核酸分子雜交技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)基因測(cè)序基因芯片PCR-等位基因特異寡核苷酸探針 (allele specific

2、 oligonucleotide, ASO)單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(single strand conformation polymorphism, SSCP)PCR-DNA多態(tài)性分析 短串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性分析（short tandem repeat，STR） 串聯(lián)重復(fù)可變數(shù)目分析（variable number tandem repeats，VNTR） 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(restriction fragment length polymorphism, RLFP)ASO探針法ACTGASO探針正常病人PCR-ASO檢測(cè)基因點(diǎn)突變:主是利用PCR技術(shù)擴(kuò)增靶基因的適當(dāng)片段,然后用人工合成的含突變

3、位點(diǎn)的標(biāo)記寡核苷酸探針雜交疾病種類重復(fù)的核苷酸序列突變區(qū)域脆性X綜合征CGG5UTR強(qiáng)直性肌萎縮CTG5UTR亨廷頓舞蹈病小腦脊髓共濟(jì)失調(diào)馬赫多-約瑟夫病延髓脊髓肌萎縮CAGCAGCAGCAG編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)動(dòng)態(tài)突變遺傳病X染色體（xq27.3）的脆性位點(diǎn) 脆性X綜合征是遺傳性智力缺陷疾病。普通男性群體中的患病率為1/4000。普通女性群體中的患病率為1/6000。致病基因FMR-1的5端有CGG三核苷酸重復(fù)區(qū)。患者智力低下、語(yǔ)言障礙、行為異常、呈特殊 面容。正常個(gè)體：CGG重復(fù)次數(shù)652次，中國(guó)人群以(CGG)28為多見。前突變(premutation)： (CGG) 53230為攜

4、帶者，雖表型正常，但在傳 遞過程中易發(fā)生進(jìn)一步擴(kuò)展，使后代的CGG重復(fù)次數(shù)大大增加，并 有異常表型。全突變： (CGG) 230時(shí)，100%的男性表現(xiàn)為典型的脆性X綜合征, 53%的女性表現(xiàn)為程度不同的智力低下。第二節(jié) 基因診斷策略一、直接診斷策略 基因診斷的直接策略是通過各種分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)致病基因本身的異常，以探查基因有無突變、缺失或插入、基因重排和基因擴(kuò)增等異常及其性質(zhì)，或病原體基因是否存在，它適用于被檢測(cè)基因的正常序列和結(jié)構(gòu)已被闡明。 直接診斷直接揭示遺傳缺陷，因而比較可靠。直接診斷所采用的技術(shù)Southern 印跡技術(shù)多重PCR技術(shù)PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）等

5、位基因特異性寡核苷酸（ASO）DNA芯片技術(shù)（DNA chip）單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）變性梯度凝膠電泳（DGGE）DNA序列分析（DNA sequencing）二、間接診斷策略當(dāng)致病基因雖然已知但其異常尚屬未知時(shí)，或致病基因本身尚屬未知時(shí)，在家系中進(jìn)行連鎖分析。通過分析可確定個(gè)體來自雙親的同源染色體中的哪一條為致病染色體，從而判斷該個(gè)體是否帶有致病基因。間接診斷不是直接尋找 DNA 的遺傳缺陷，而是通過分析DNA的遺傳標(biāo)記的多態(tài)性，估計(jì)被檢者患病的可能性。間接診斷所采用的技術(shù)間接診斷就是分析DNA的遺傳標(biāo)志的多態(tài)性 （1）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP） 檢測(cè)方法：Southern印跡技術(shù)

6、、PCR-RFLP、RAPD。 （2）DNA指紋圖 串聯(lián)重復(fù)可變數(shù)目（VNTR）多態(tài)性 檢測(cè)方法：Southern 印跡技術(shù)、PCR技術(shù) 。 短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)多態(tài)性 檢測(cè)方法：PCR技術(shù)、基因指紋圖譜掃描 。 （4）單核苷酸多態(tài)性(SNP) 檢測(cè)方法：DNA芯片技術(shù)。間接診斷的不確定性遺傳標(biāo)志所帶的信息有限新突變基因重組家系成員不夠完整三、基因異常與診斷方法的選用點(diǎn)突變的檢測(cè)方法DNA大片段的缺失、插入及擴(kuò)增檢測(cè)方法動(dòng)態(tài)突變的檢測(cè)方法多基因或多位點(diǎn)突變的檢測(cè)方法感染性疾病基因檢測(cè)方法基因表達(dá)異常的檢測(cè)方法點(diǎn)突變的檢測(cè)方法PCR-RFLPPCR-ASOPCR-SSCPDGGE(變性梯度凝

7、膠電泳)融點(diǎn)曲線分析PCR-序列分析DNA大片段的缺失、插入及局部擴(kuò)增檢測(cè)方法核酸分子雜交技術(shù)（Southern雜交、斑點(diǎn)雜交、原位雜交、FISH）PCR多重-PCRDNA序列測(cè)定動(dòng)態(tài)突變的檢測(cè)方法PCR核酸分子雜交技術(shù)DNA測(cè)序多基因或多位點(diǎn)突變的檢測(cè)方法多重-PCR感染性疾病基因檢測(cè)方法意義：菌種鑒定、確定病毒感染及病毒載量、病毒分型、細(xì)菌耐藥檢測(cè)和分子流行病學(xué)調(diào)查方法：PCR、熒光定量PCR、核酸雜交技術(shù)、基因芯片技術(shù)舉例：HBV-DNA檢測(cè)的方法及臨床意義 病毒載量：熒光定量PCR、支鏈DNA技術(shù) 病毒分型：核酸雜交技術(shù)、基因芯片技術(shù) 耐藥檢測(cè)：PCR-RFLP、基因芯片技術(shù)、測(cè)序 反向雜交HBV分型根據(jù)HBV全基因序列異源性8%或S基因區(qū)序列異源性4%，將HBV分為8個(gè)基因型：AHHPV-拉米夫定耐藥YMDD 基序是指HBV DNA聚合酶催化部位一個(gè)高度保守區(qū) “酪氨酸（Y）、蛋氨酸(M)、天冬氨酸(D)、天冬氨酸(D)”長(zhǎng)