分子標(biāo)記及其在植物遺傳育種中的應(yīng)用

1、分子標(biāo)記及其在植物遺傳育種中的應(yīng)用第1頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一遺傳標(biāo)記（genetic marker）具有多型性易于鑒別與目標(biāo)基因緊密連鎖 性狀標(biāo)記 色澤， 形態(tài) 細(xì)胞學(xué)標(biāo)記 倒位，易位，G/N/C帶 生化標(biāo)記 同功酶 分子標(biāo)記 RFLP、RAPD、SSR、AFLP、SNP 基礎(chǔ)-基因表達(dá)結(jié)果表現(xiàn)型DNA堿基序列變異第2頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一形態(tài)標(biāo)記遺傳學(xué)上穩(wěn)定、可見的外部特征-遺傳與環(huán)境、結(jié)構(gòu)基因與調(diào)控基因綜合作用的結(jié)果。如穗形、芒長(zhǎng)、穗長(zhǎng)、粒色、穗形、矮稈、卷葉等。特點(diǎn)：直觀簡(jiǎn)單從基因型到表現(xiàn)型存在基因表達(dá)、調(diào)控、個(gè)體發(fā)

2、育等環(huán)節(jié)，表型差異有時(shí)難以反映基因型差異。 第3頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一細(xì)胞學(xué)標(biāo)記染色體數(shù)目變異及結(jié)構(gòu)變異，表現(xiàn)在染色體核型（數(shù)目、大小、隨體、著絲點(diǎn)位置等）和帶型（C帶、N帶、G帶等）。隨著分帶、細(xì)胞原位雜交等研究技術(shù)的發(fā)展，可在染色體水平揭示更多遺傳變異。特點(diǎn)：直觀、快速而經(jīng)濟(jì)，但變異十分有限，當(dāng)染色體數(shù)目形態(tài)相似時(shí)難以分辨。 第4頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一生化標(biāo)記貯藏蛋白和同工酶貯藏蛋白同工酶特點(diǎn)：經(jīng)濟(jì)、方便、成本較低結(jié)構(gòu)基因表達(dá)產(chǎn)物，對(duì)非結(jié)構(gòu)基因無(wú)能為力；所檢測(cè)位點(diǎn)只是基因組一部分；數(shù)量有限，有時(shí)受發(fā)育時(shí)期和環(huán)境影響。第

3、5頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一分子標(biāo)記本質(zhì)是以核苷酸序列作為標(biāo)記，一般特點(diǎn)：（1）不受季節(jié)、環(huán)境、基因表達(dá)與否的限制；（2）多態(tài)性高，存在著豐富的等位變異； （3）數(shù)量豐富，多態(tài)性遍及整個(gè)基因組；（4）表現(xiàn)為“中性”，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)，與不良性狀無(wú)必然的連鎖；（5）許多分子標(biāo)記表現(xiàn)共顯性，能鑒別純合雜合基因型，提供完整的信息。第6頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一分子標(biāo)記的分類（Staub等1996）分子標(biāo)記以Southern為基礎(chǔ)如RFLP以PCR為基礎(chǔ)單引物PCR標(biāo)記 有RAPD、 AP-PCR、DAF、ISSR等雙引物選擇性擴(kuò)增P

4、CR 主要指AFLP需克隆、測(cè)序構(gòu)建特殊雙引物PCR標(biāo)記如SSR、STS等第7頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一植物遺傳研究中常用的分子標(biāo)記RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism RAPDRandom Amplified Polymorphic DNAs (DAF, AP-PCR)SSR Simple Sequence RepeatAFLP Amplified Fragment Length Polymorphism第8頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一RFLP原理： DNA限制性內(nèi)切酶酶切 電

5、泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜同位素或非放射標(biāo)記（如地高辛等）的探針雜交膠片放射自顯影，顯示酶切片段大小第9頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一酶切：3-5ug DNA，以10U內(nèi)切酶酶切5小時(shí) 電泳：0.6-0.8%瓊脂糖膠70V電泳16小時(shí) 染色：EtBr染色20分鐘 變性：0.25M HCl 20分鐘，抽真空，水冼印跡：加入0.4N NaOH，進(jìn)行Southern 印跡沖洗：以2SSC 冼膠，風(fēng)干酶切電泳印跡第10頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一雜交洗脫預(yù)雜交：將雜交膜放人預(yù)雜交液（水、5 HSB、Denhardt）中， 封好后置65溫箱中振蕩56

6、小時(shí)。雜交：預(yù)雜交液中加入標(biāo)記好的marker和探針，放入雜交膜浸勻。封好雜交盒后，置65溫箱中振蕩過(guò)夜。洗脫：將膜轉(zhuǎn)入洗脫盒，加入洗脫液65 振蕩洗脫兩次（15min/次），吸干包好。第11頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一放射自顯影將洗脫好的雜交膜置于增感屏上, 于暗室中將 X-光片放于雜交膜上， 再放上另一張?jiān)龈衅粒b人暗袋，并用夾板夾好。置-70超低溫冰箱中曝光10天左右。使用磷屏儀，操作更方便。第12頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一RFLP探針來(lái)源：cDNA探針與基因組DNA（gDNA）探針cDNA探針:保守性較強(qiáng)，探針檢測(cè)的多態(tài)性頻

7、率較低。gDNA探針:檢測(cè)的多態(tài)性頻率較高，但不同種屬特異性較強(qiáng)。玉米R(shí)FLP探針：第13頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一探針標(biāo)記隨機(jī)引物法25 ng變性DNA 5ul 寡聚核苷酸2ul BSA3ul -32PdCTP 2ul Klenow酶加水至50ul，37溫箱中標(biāo)記2小時(shí)第14頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一RFLP標(biāo)記特點(diǎn)共顯性，可以區(qū)別純合和雜合基因型穩(wěn)定、重復(fù)性強(qiáng)某些植物中開發(fā)探針已遍及整個(gè)基因組缺點(diǎn)：DNA需要量較大，技術(shù)復(fù)雜； 用于做圖較費(fèi)時(shí)，難以分析大量樣品； 在基因組較大、嚴(yán)格自花授粉作物上多態(tài)性很低，使遺傳圖飽和度低。第

8、15頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一RAPD原理：用一個(gè)隨機(jī)引物（8-10bp）、堿基隨機(jī)排列的寡核苷酸序列，非定點(diǎn)地?cái)U(kuò)增基因組DNA，然后電泳分開擴(kuò)增片段。第16頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一Polymerase Chain Reaction-PCR3553Target DNA sequenceGCTCGCAGTACTTCATGACGAGCGdenature 95 C5335GCTCGCAGTACTTCATGACGAGCGTCATGAGCTCGCanneal primers 60 CTaq polymerase binds 3 and e

9、xtendsGCTCGC5335AGTACTTCATGACGAGCGTCATGAGCTCGCDNA is doubled with each cycleRepeat 25-40 times第17頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一RAPD的操作PCR反應(yīng)： DNA（20ng/l）1l Primer15ng 10Buffer2.0l Mg2+（25mM）1.2l Taq酶（5U/l）0.15l dNTP（25mM）0.2l加水至20l，再加入石臘油，進(jìn)行PCR擴(kuò)增第18頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一Step1 95 2分鐘Step2 95 15秒

10、Step3 36 30秒Step4 72 45秒Step5 GOTO Step2 46循環(huán)Step6 72 5分鐘 PCR擴(kuò)增：第19頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一主要特點(diǎn)無(wú)需雜交，設(shè)計(jì)引物也無(wú)須知道序列信息；DNA需要量少，引物便宜，成本較低；技術(shù)簡(jiǎn)便，操作方便、快速，不涉及分子雜交和放射性自顯影等技術(shù)。不同物種間引物通用； 缺點(diǎn)：大多顯性遺傳，不能鑒別雜合和純合子；實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較差，結(jié)果可靠性較低。第20頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一DAF(DNA amplification fingerprinting)：與RAPD不同的是:引物濃度

11、更高，引物長(zhǎng)度更短（一般58個(gè)堿基），且往往用聚丙烯酰胺凝膠電泳，通常會(huì)產(chǎn)生非常復(fù)雜的帶型，譜帶信息比RAPDs大得多。 （Caetano-Anolles等，1990）第21頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一AP-PCR(arbitrarily primed polymerase chain reaction)引物較長(zhǎng)（1050bp）；引物濃度較高；引物長(zhǎng)度不定，并且常常來(lái)自為其它目的而設(shè)計(jì)的引物（如M13通用測(cè)序引物）。第22頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一ISSR第23頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一共同優(yōu)點(diǎn)： 在

12、不需要知道所擴(kuò)增DNA序列情況下，產(chǎn)生DNA片段的指紋； 需DNA量少，產(chǎn)生多態(tài)性豐富。缺點(diǎn)： 對(duì)反應(yīng)條件非常敏感，重復(fù)性差。第24頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一SCARs（Sequenced Characterized Amplified Regions）為提高RAPD標(biāo)記穩(wěn)定性，把目標(biāo)RAPD片段克隆測(cè)序，根據(jù)片段兩末端的序列設(shè)計(jì)特定引物（通常24個(gè)堿基），再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可把相應(yīng)的單一位點(diǎn)鑒定出來(lái)。具有更高的可重復(fù)性共顯性第25頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一微衛(wèi)星標(biāo)記(SSR)真核生物基因組普遍存在，呈隨機(jī)分布,大約每隔10-50

13、kb就存在一個(gè)SSR.哺乳動(dòng)物中約為植物的5-6倍;植物中平均23.3kb有一個(gè)SSR;雙子葉植物SSR數(shù)量大于單子葉植物,核DNA SSR數(shù)量多于細(xì)胞質(zhì)DNA;根據(jù)核心序列堿基數(shù)的不同,可分為單堿基、2堿基、3堿基、4堿基等多種重復(fù)型。第26頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一不同物種其重復(fù)序列及重復(fù)單位頻率不同。通過(guò)對(duì)54個(gè)植物種核DNA和28個(gè)植物種細(xì)胞器DNA SSR(1-4bp)的搜索,發(fā)現(xiàn)：(AT)最豐富,然后依次是: (A)n、(T)n、(AG)n、(CT)n、(AAT)n、(ATT)n、(AAC)n、(GTT)n、(AGC)n、(GCT)n、(AAG)n、

14、(CTT) n、(AATT)n、(TTAA)n、(AAAT)n、(ATTT)n及(AC)n、(GT)n。同一類內(nèi)堿基種類不同的SSR,豐度差別很大。SSR的分布特點(diǎn)第27頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一SSR的功能長(zhǎng)期以來(lái)一直認(rèn)為SSR是轉(zhuǎn)錄啞區(qū)，沒(méi)有明確的生理功能。但隨著研究深入，證明并非如此。SSR的主要功能:編碼氨基酸；染色體末端的SSR，有保護(hù)DNA完整性、避免降解、融合及丟失的功能；提高或降低臨近基因轉(zhuǎn)錄速率；基因重組的熱點(diǎn)，是基因變異的來(lái)源；部分SSR可產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)復(fù)合物或活化染色體第28頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一兩端序列多

15、是保守的單拷貝序列，可以根據(jù)兩端序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，通過(guò)PCR將其間微衛(wèi)星序列擴(kuò)增出來(lái)，利用電泳技術(shù)獲得長(zhǎng)度多態(tài)性。不同材料重復(fù)次數(shù)的不同，導(dǎo)致了SSR長(zhǎng)度的高度變異性。SSR分析第29頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一SSR分子標(biāo)記的創(chuàng)制基因組文庫(kù)的構(gòu)建探針制備-預(yù)雜交-帶有SSR克隆的選擇測(cè)序引物設(shè)計(jì)檢測(cè)其它方法: EST-SSR、相關(guān)種間SSR. .第30頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一Cross-species SSRTaxonomic TransferabilityPolymorphism Divergence % (N) % (N

16、)Same subgenus 89.8 (521)78.3 (299)Same genus 76.4 (1800) 86.0 (773)Same alliance 45.4 (403)50.4 (141)Same family 35.2 (1683) 58.4 (363)第31頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一SSR的操作PCR反應(yīng)：DNA（20ng/l）4lPrimer（1mM）0.25l10Buffer2.0lMg2+（25mM）1.2lTaq酶（5U/l）0.1ldNTP（25mM）0.2l加水至20l第32頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期

17、一混合后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增：Step1 95 2分鐘Step2 95 30秒Step3 56 30秒Step4 72 60秒Step5 GOTO Step2 31循環(huán)注：SSR引物退火溫度在52-65 不等。第33頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一SSR的特點(diǎn)：兩側(cè)順序保守，在同種間多相同；數(shù)量豐富，在整個(gè)基因組均勻隨機(jī)分布；實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，結(jié)果可靠；多數(shù)SSR增減重復(fù)序列頻率高，在品種間具廣泛位點(diǎn)變異；共顯性標(biāo)記，可鑒別雜合子和純合子；僅需微量組織，適合PCR分析半自動(dòng)化第34頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一相對(duì)的物種專一性；由于開發(fā)時(shí)需針對(duì)每個(gè)

18、座位的微衛(wèi)星序列，發(fā)現(xiàn)其兩端的單拷貝序列設(shè)計(jì)引物，需建立基因文庫(kù)、克隆識(shí)別與篩選、測(cè)序等過(guò)程，開發(fā)困難，費(fèi)用較高，耗時(shí)長(zhǎng)；實(shí)際分析時(shí)一般每次只分析單個(gè)位點(diǎn)；不同引物退火溫度不同，需要探索。不足：第35頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一SSR的檢測(cè)瓊脂糖凝膠檢測(cè)（同前）聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)一般采用銀染、熒光檢測(cè)。第36頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一銀染檢測(cè)程序脫色：加1升10%HAC液，脫色20分鐘沖洗：用重蒸水沖洗膠板2次，每次5分鐘染色：加染色液(1%AgNO3，0.075%甲醛)30分鐘沖洗：用重蒸水沖洗膠板不超過(guò)5秒鐘；顯影：預(yù)冷顯影液（

19、30g/LNaCO3，0.075%甲醛，0.4mg/mlNa2SO3），輕搖到帶紋出現(xiàn)；定影：在固定/停止液并輕搖3-5分鐘；沖洗：用重蒸水沖洗2次，每次2分鐘；干膠：室溫下自然干燥過(guò)夜。第37頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism)原理：基于RFLP技術(shù)和PCR技術(shù)的結(jié)合 第38頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一DNAMseI -MseI MseI -EcoRI EcoRI -EcoRIMseI -MseI片段環(huán)化，不利小片段擴(kuò)增；EcoRI -EcoRI 引物的

20、退火溫度高；MseI -EcoRI 片段優(yōu)先擴(kuò)增酶切連接第39頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一接頭序列Mse 接頭、Pst 分別為：Mse： 5-GACGATGAGTCCTGAG-3 3-TACTCAGGACTCAT-5Pst： 5-CTCGTAGACTGCGTACC-3 3-CTGACGCATGGTTAA-5EcoR： 5-CTCGTAGACTGCGTACC-3 3-CTGACGCATGGTTAA-5 第40頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一M00:5-GATGAGTCCTGAGTAA-3；P00:5- GACTGCGTACCAATTC-3;

21、E00:5-GACTGCGTACCAATTC-3;MseI-primers +3: 5-GATGAGTCCTGAGTAANNN-3EcoRI-primers +3: 5-GACTGCGTACCAATTCNNN-3PstI-primers +3: 5-GACTGCGTACATCGAGNNN-3第41頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一 AFLP技術(shù)的特點(diǎn)（1）由于內(nèi)切酶及選擇性堿基組合數(shù)和種類很多，產(chǎn)生標(biāo)記數(shù)無(wú)限，可覆蓋整個(gè)基因組。（2）多態(tài)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其它分子標(biāo)記，一般可檢測(cè)到50-100個(gè)AFLP擴(kuò)增產(chǎn)物，能夠在遺傳關(guān)系十分相近的材料產(chǎn)生多態(tài)性，被認(rèn)為是指紋圖譜技術(shù)中多態(tài)

22、性最豐富的一項(xiàng)技術(shù)。（3）AFLP分析由于擴(kuò)增片段較短（30-700bp)，分辨率高。第42頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一（4）AFLP分析用樣量少（0.05-0.5 g DNA），而且對(duì)模板濃度的變化不敏感。（5）由于特定引物擴(kuò)增，退火溫度高，因而假陽(yáng)性低，可靠性高。（6）引物在不同物種間是通用的，可用于沒(méi)有任何分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)的物種。（7）銀染技術(shù)具有快速、方便的特點(diǎn)，在1-2天內(nèi)可以得到指紋。第43頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一AFLP操作具體包括三個(gè)步驟：1. 酶切-連接；2. PCR擴(kuò)增，使目的序列擴(kuò)增到0.51g；3. 電泳

23、分離（利用聚丙烯酰胺凝膠）。對(duì)于基因組較大的物種，需要進(jìn)行兩步擴(kuò)增預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增。AFLP操作步驟：第44頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一模板DNA的酶切與連接DNA（200ng/l）2.5lMse3單位 Pst 3單位Mse 接頭（50 pmol/l） 1.0lPst 接頭（5 pmol/l） 1.0l10NEB Buffer 2.5l100BSA 0.25lATP（10mM） 2.0lT4-連接酶（3U/l） 0.4l加水至25l，37酶切-連接4-6小時(shí)，或過(guò)夜。 AFLP實(shí)驗(yàn)程序第45頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一DNA片段的預(yù)

24、擴(kuò)增取2.0l完成的樣品，加入18l如下混合液： Mse 引物（M00，50ng/l）0.6l Pst 引物（P00，50ng/l） 0.6l 10PCR Buffer 2.0l Mg2+（25mM） 1.2l Taq酶（5U/l） 0.1l dNTP（25mM） 0.16l加ddH2O至20l第46頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一混合后，在如下PCR條件下擴(kuò)增： Step195 2分鐘 Step295 30秒 Step356 30秒 Step472 60秒 Step5GOTO Step2 31 cycles Step6 72 5分鐘第47頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，

25、5月20日，9點(diǎn)56分，星期一AFLP的選擇性擴(kuò)增取4l稀釋預(yù)擴(kuò)增液，加入16l如下反應(yīng)液：Pst引物（50ng/l） 0.8lMse引物（50ng/l） 0.8l10PCR Buffer 2.0lMg2+（30mM） 1.1ldNTP（25mM） 0.18lTaq酶（5U/l） 0.12lddH2O 11.0l第48頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一混合后按如下PCR程序擴(kuò)增： Step195 2分鐘 Step295 30秒 Step365 30秒（-0.7/cycle） Step472 60秒 Step5GOTO Step2 12循環(huán) Step695 30秒 Ste

26、p756 30秒 Step872 60秒 Step9GOTO Step6 30 cycles Step10 72 5分鐘第49頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一AFLP的檢測(cè)銀染熒光同位素檢測(cè)第50頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一注意事項(xiàng)：1AFLP酶切反應(yīng)對(duì)模板DNA質(zhì)量要求較高，要求260/280 在1.8左右，且不能有降解。2AFLP反應(yīng)對(duì)模板DNA濃度不是很敏感，在50pg-50ng時(shí)，均可以觀察到多態(tài)性帶，但為了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，DNA濃度不能太低。3酶切-連接反應(yīng)可以分開作，也可以合在一起作，但合在一起更方便些。第51頁(yè)，共114頁(yè)，2

27、022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一4AFLP反應(yīng)對(duì)PCR要求較高，要首先摸索優(yōu)化Mg2+、dNTP條件，達(dá)到最佳擴(kuò)增。5EcoR受甲基化胞嘧啶的影響較小，而Pst對(duì)富含的甲基化胞嘧啶十分敏感，因而Pst-Mse檢測(cè)的多為表達(dá)區(qū)域，而EcoR-Mse檢測(cè)位點(diǎn)聚集在甲基化較高的重復(fù)序列區(qū)域。第52頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一6引物中用作選擇性核苷酸的和含量對(duì)擴(kuò)增出的產(chǎn)物數(shù)目有影響。一般而言，和含量越高，擴(kuò)增出的產(chǎn)物數(shù)目越少。7 同位素、熒光標(biāo)記分辨率較高，但價(jià)格昂貴，操作不方便；銀染方法方便快捷，掌握好各個(gè)環(huán)節(jié)，同樣可以達(dá)到很好的效果。第53頁(yè)，共114頁(yè)，20

28、22年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一為什么用雙酶解?適合PCR擴(kuò)增效率與變性膠的分辨率減少PCR擴(kuò)增的片段,從而減少使用選擇性堿基的數(shù)目使標(biāo)記單鏈成為可能增加PCR擴(kuò)增的靈活性增加使用引物的靈活性第54頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一為什么要預(yù)擴(kuò)增?減少選擇性堿基的錯(cuò)配減輕背景提供足量模板DNA降低模板濃度的影響第55頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一目的：分子標(biāo)記輔助選擇 (MAS)篩選BAC文庫(kù)，進(jìn)行圖位克隆（map-based gene cloning）AFLP SCAR第56頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一P

29、IC/Simpson遺傳多樣性系數(shù) = 1 - Pi 2等位基因數(shù)目 A A = 4PIC = 1 SUM (0.47)2 + (0.30)2 + (0.17)2 + (0.04)2 = 0.64SSR資料：第57頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一遺傳相似系數(shù) Gower (1985): a + da + b + c + d簡(jiǎn)單匹配系數(shù)（SM）(Simple matching coefficient) a a + b + cJaccard 相似系數(shù)(Jaccard 1908). 2a2a + b + cDice (1945)相似系數(shù)，即 Nei & Li (1979)相

30、似系數(shù).第58頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一其中 :abcd+ -+-kj第59頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一遺傳距離的計(jì)算：Rogers（1972）Rogers-W（Rogers distance as modified by Wright （1978）第60頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一兩個(gè) 隨機(jī)群體 j 、k間的遺傳距離（Nei 1972）: Xij 為X群體第i個(gè)位點(diǎn)第j個(gè)等位基因頻率 Yij為Y群體第i個(gè)位點(diǎn)第j個(gè)位點(diǎn)基因頻率 第61頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一在種質(zhì)資源

31、研究中，大多數(shù)采用羅杰斯距離（RD）和改良的羅杰斯距離（MRD）（Rogers，1972；Goodman & Stuber，1983）。根據(jù)遺傳特性確定的羅杰斯距離在相關(guān)種質(zhì)的親緣關(guān)系分析中非常有用；而改良的羅杰斯距離還適用于雜種優(yōu)勢(shì)研究。 第62頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一聚類分析聚類指標(biāo)： 遺傳相似系數(shù) 遺傳距離聚類方法：SAHN （Sequential Agglomerative Hierarchical and Nested）clustering 常用UPGMA分析軟件：NTSYS-pc2.02（Rholf，1998）第63頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月

32、20日，9點(diǎn)56分，星期一QTL分析單標(biāo)記作圖法；區(qū)間作圖法； Mapmaker/QTL 復(fù)合區(qū)間作圖法；Cartographer、QTLmapper第64頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一A Homozygote for the allele from A parentB Homozygote for the allele from B parentH Heterozygote carrying both alelles A and BC Either BB or AB genotypeD Either AA or AB genotype- Missing data

33、for the individual at this locus第65頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一data type F2 intercross20 5 1*locus1 BBBHH-AAABBBHHH-AABA*locus2 AB-ABHABHAB-AB-ABHAH*locus3 ABBAHHHBHABHABHBBHH-#Locus3 may be mis-scored in individual 12!*locus4 ABHHABAAAHAB-ABHABHH*locus5 ABHABHAA-ABHABHAHHHB*trait1 6.3 7.7 8.0 6.2

34、4.1 8.8 6.5 5.4 7.3 8.7 9.0 - 6.8 7.2 7.1 7.6 8.3 8.1 7.5 6.8第66頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一EST (Expressed Sequence Tags)SNP（single nucleotide polymophism）cSSR、cSNPDNA微陣列（Microarray）蛋白質(zhì)組學(xué)新型分子標(biāo)記第67頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一EST 是長(zhǎng)約150-400bp的基因表達(dá)序列片段，攜帶著完整基因的某些片段。 mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，克隆到質(zhì)粒或噬菌體載體，構(gòu)建cDNA文庫(kù)，

35、而后大規(guī)模隨機(jī)挑選克隆，對(duì)5或3端進(jìn)行一步法測(cè)序，獲得對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育、遺傳變異、衰老死亡等過(guò)程認(rèn)識(shí)的技術(shù)。EST (Expressed Sequence Tags)第68頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一DNA DatabankscDNA resourcesGenbank (NCBI), Nucleotide Sequence Database (EMBL), DDBJ , MGC,Genomic DNA resourcesHTG, dbGSS, GOLD, ERGO,EST resourcesdbEST, UniGene, GIs, STACKS, DOTS,Others

36、dbSTS, UniSTS, dbSNP, TransFac, ISIS, Repbase, . .第69頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一常用基因組網(wǎng)址：擬南芥: The Arabidopsis Information Resource (TAIR) 水稻：RiceGene h大豆：SoyBase 玉米：MaizeDB, MaizeGDB小麥：GrainGene 棉花: CottonDB 苜菽：Alfagenes /大麥：BarleyDB - /barley.html油菜：BrassicaDB Http:/brassica.html高梁：第70頁(yè)，共114頁(yè)，2022

37、年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一單核苷酸多態(tài)（SNP -single nucleotide polymophism）SNP是由于單個(gè)核苷酸改變而導(dǎo)致的核酸序列多態(tài)，即基因中的點(diǎn)突變。特點(diǎn)：雙等位基因在基因組中的發(fā)生頻率比較高有些SNP位點(diǎn)還影響基因的功能SNPs可大大豐富既有的連鎖圖成熟自動(dòng)化技術(shù)，有望分析成千上萬(wàn)的SNPs第71頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一cSSR、cSNP從EST中開發(fā)SSR、SNP目前某些植物全序列的測(cè)定及EST數(shù)據(jù)庫(kù)的開發(fā)，為SSR、SNP的開發(fā)開辟了新的途徑。優(yōu)點(diǎn)：表達(dá)序列，與特定功能有聯(lián)系多態(tài)性豐富，可大大豐富標(biāo)記數(shù)目開發(fā)簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)第

38、72頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一 利用DNA芯片技術(shù)，將大量探針固定于玻/硅片上，然后用熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行大量分子雜交，以比較不同組織或器官的基因表達(dá)水平，篩選突變基因，分析基因表達(dá)模式。 優(yōu)點(diǎn)：密度高、制作方便，解決了傳統(tǒng)核酸雜交技術(shù)復(fù)雜、自動(dòng)化程度低、檢測(cè)目的分子數(shù)量少、低通量等不足DNA微陣列（Microarray）第73頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一微型化高通量提高信息量平行化提高信息的可比性微量化降低待檢樣品用量自動(dòng)化提高工作效率低成本可迅速普及推廣生物芯片的特征與優(yōu)點(diǎn)第74頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星

39、期一蛋白質(zhì)組學(xué)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的產(chǎn)物,是基因功能的執(zhí)行體，決定了生物的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖等各種性狀。蛋白質(zhì)組研究-了解生物體蛋白質(zhì)表達(dá)的時(shí)空分布規(guī)律, 不同個(gè)體/組織間的表達(dá)差異蛋白質(zhì)分子標(biāo)記-定位生物的表性變異(如抗病、抗逆等性狀)和相關(guān)基因第75頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一The key technique involves in proteomics1.Mass spectrometry 2.Two-dimensional gel electrophoresis3.Yeast two-hybrid system第76頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，

40、5月20日，9點(diǎn)56分，星期一分子標(biāo)記技術(shù)在植物遺傳研究中的應(yīng)用第77頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一利用遺傳圖和遺傳標(biāo)記可用來(lái)加速植物育種進(jìn)程。經(jīng)典遺傳圖譜：形態(tài)、生理和生化標(biāo)記，數(shù)量極為有限，圖譜分辨率大都很低，表現(xiàn)標(biāo)記少，圖距大，飽和度低。分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，使圖譜上標(biāo)記的密度越來(lái)越高。植物基因組遺傳作圖第78頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一構(gòu)建遺傳圖譜 （molecular marker linkage map）以具有遺傳多型性的分子標(biāo)記為“路標(biāo)”Polymorphic molecular marker as “route sign”

41、以減數(shù)分裂中發(fā)生的遺傳重組交換值為圖距Recombination frequency (%) in meiosis as “map distance (cM)”繪制高密度的分子標(biāo)記連鎖圖Genetic linkage map with high density第79頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一QTL作圖所需的數(shù)據(jù)遺傳標(biāo)記數(shù)據(jù)數(shù)量性狀數(shù)據(jù)第80頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一分子標(biāo)記連鎖圖譜的構(gòu)建 定位群體親本間多態(tài)性分子標(biāo)記的篩選 定位群體的組建 定位群體分子標(biāo)記分析 分子標(biāo)記連鎖圖譜的繪制第81頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9

42、點(diǎn)56分，星期一利用3個(gè)分離群體，一個(gè)人，三個(gè)月時(shí)間，能完成包括1032個(gè)AFLP標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜（ Faye等1995） 。AFLP不僅能縮小抗病基因與連鎖標(biāo)記之間的距離，而且在RFLP遺傳圖上，可增加染色體末端標(biāo)記和填充RFLP空隙，不干擾RFLP標(biāo)記簇，從而大大增加了遺傳圖的飽和度。第82頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一在植物遺傳多樣性研究上的應(yīng)用對(duì)植物種質(zhì)資源遺傳多樣性的全面了解，對(duì)于拓寬遺傳基礎(chǔ)的育種策略十分重要。eg.賈繼增等（1997）利用21條染色體上473個(gè)RFLP探針對(duì)小麥遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，小麥不同位點(diǎn)、不同染色體上的遺傳多樣性各不相同，普通小

43、麥B基因組遺傳多樣性較高，其中尤以2B、6B、7B更高，而D組的遺傳多樣性最差。對(duì)在小麥育種中引進(jìn)新的遺傳變異具有一定的意義。第83頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一 eg. 通過(guò)288個(gè)位點(diǎn)上對(duì)338個(gè)一粒小麥系群AFLP指紋分析，結(jié)合種系分析，發(fā)現(xiàn)來(lái)源于土耳其東南部Karacadag山脈的一個(gè)野生一粒小麥（T. boeoticum）群體與栽培一粒小麥（T. monococcum ）遺傳上最為相近，從而推斷該地區(qū)為現(xiàn)代栽培一粒小麥的發(fā)源地（ Heun等1998） 。植物起源、分類和進(jìn)化研究第84頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一品種的DNA指紋

44、圖譜 定義：能夠鑒定作物品種之間差異的電泳圖譜。特點(diǎn)：高度的個(gè)體特異性、環(huán)境的穩(wěn)定性及豐富的多態(tài)性。用途：鑒定品種真實(shí)性和純度，用于新品種登記和品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)等。其中AFLP被推薦為指紋圖譜繪制的最佳方法之一。eg. Law等（1998）利用6個(gè)AFLP引物組合產(chǎn)生90多條多態(tài)性條帶，建立了英國(guó)1934-1994廣泛種植的55份小麥的指紋圖譜。 第85頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一基因定位質(zhì)量性狀的基因定位 近等基因系（Near Isogenic Lines, NILs）NILs幾乎僅在目標(biāo)性狀上存有差異，一般凡是能在近等基因系間揭示多態(tài)性的分子標(biāo)記，就極可能位于

45、目標(biāo)基因的兩翼附近。利用NILs方法已定位了許多質(zhì)量性狀基因，eg.番茄抗病毒基因Tm-2a，番茄抗細(xì)菌病毒基因及水稻半矮桿基因Sdy等。第86頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一原理：將分離群體(F2、BC、DH）中的個(gè)體依據(jù)目標(biāo)性狀(如抗病、感病)分成兩組，在每一組中將若干個(gè)體DNA等量混合，形成兩個(gè)DNA混合池(如抗病池和感病池)。由于分組時(shí)僅對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行選擇，因此兩個(gè)池之間理論上就應(yīng)主要在目標(biāo)基因區(qū)段存有差異，也稱近等基因池法。優(yōu)點(diǎn)：克服了許多作物沒(méi)有或難以創(chuàng)造相應(yīng)NILs的限制(Michelmore等1991)。定位基因：萵苣抗霜霉病基因、水稻抗癭蠓基因水稻抗

46、稻瘟病基因、水稻耐黃叢卷葉病毒病基因等分離群體分組分析法(Bulked Segregation Analysis)第87頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一產(chǎn)量、品質(zhì)、熟期等大多數(shù)重要農(nóng)藝性狀，均表現(xiàn)數(shù)量性狀的遺傳特點(diǎn)，受許多數(shù)量基因座位（Quantitative Trait Loci, QTLs）和環(huán)境因子的共同作用。數(shù)量遺傳學(xué)無(wú)法確定控制數(shù)量性狀的QTLs數(shù)目，也無(wú)法確定單個(gè)QTL的遺傳效應(yīng)及染色體位置。分子連鎖圖譜的發(fā)展，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)QTL遺傳效應(yīng)的追蹤，從而應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇。目前已發(fā)展了QTLs定位的多種方法。數(shù)量性狀基因的定位第88頁(yè)，共114頁(yè)，202

47、2年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一基于圖譜的基因克隆 誰(shuí)最先了解基因的功能，誰(shuí)就擁有了該基因的知識(shí)產(chǎn)權(quán)，也就獲得了更多的利潤(rùn)?？寺』蛲緩秸蜻z傳學(xué)和反向遺傳學(xué)。前者以欲克隆基因的功能為基礎(chǔ)，通過(guò)鑒定其產(chǎn)物或某種表型的突變進(jìn)行；后者則著眼于基因本身，通過(guò)其特定的序列或其在基因組中的特定位置進(jìn)行。第89頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一圖位克隆條件：(1)目標(biāo)基因附近緊密連鎖的DNA標(biāo)記；(2)知道這些標(biāo)記與目的基因的位置一旦建立與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記圖，就可以找到染色體步行的起始點(diǎn)，從而進(jìn)行定位克隆。第90頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期

48、一比較基因組研究 利用相同的DNA分子標(biāo)記（主要是cDNA標(biāo)記和基因克?。┰谙嚓P(guān)物種之間進(jìn)行遺傳或物理作圖，比較這些標(biāo)記在不同物種基因組中的分布特點(diǎn)，揭示染色體或染色體片段上的基因及其排列順序的相同或相似性，并由此對(duì)相關(guān)物種的基因組結(jié)構(gòu)和起源進(jìn)化進(jìn)行分析。第91頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一新發(fā)現(xiàn)：不同物種之間在標(biāo)記探針的同源性、拷貝數(shù)及連鎖順序上都具有很大程度的保守性。eg 番茄、馬鈴薯和辣椒（Tanksley等1988；1992）；水稻、小麥和玉米（Ahn等，1993；1994）；小麥、大麥和黑麥（Devos等，1993）；高粱和玉米（Pereira等，1994

49、）；以及大麥和水稻（Maroof等，1996）第92頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一第93頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一比較基因組學(xué)研究表明，不同物種之間在標(biāo)記探針的同源性，拷貝數(shù)及連鎖順序上都具有很大程度的保守性。啟示：模式植物上遺傳作圖成果可推而廣之?？山柚容^基因組共享分子標(biāo)記，使建立高密度遺傳連鎖圖可資利用的標(biāo)記顯著增加，從而大大提高了獲取離目標(biāo)基因很近分子標(biāo)記的的可能性。第94頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一應(yīng)用比較基因組學(xué)進(jìn)行基因的克隆綠色革命Rht1、Rht2基因的克隆擬南芥GAI 水稻EST 篩選小

50、麥BAC文庫(kù) Rht1、Rht2Blast探針標(biāo)記第95頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一深遠(yuǎn)意義比較基因組研究已使得傳統(tǒng)的植物遺傳學(xué)突破了物種的框架限定，發(fā)展成了新的系統(tǒng)遺傳學(xué)。隨著最近一些生物的基因組全序列的獲得，比較基因組研究也隨之步入了一個(gè)新的時(shí)代。第96頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一研究基因表達(dá)與調(diào)控傳統(tǒng)方法是利用cDNA文庫(kù)篩選和Northern雜交。AFLP研究基因表達(dá)是非常有效的方法，可同時(shí)比較植物發(fā)育的不同時(shí)期以及分離某些重要基因（cDNA-AFLP）。第97頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一利用cD

51、NA-AFLP的方法，闡明了馬鈴薯塊莖在不同發(fā)育階段基因表達(dá)的情況，并克隆了2個(gè)與塊莖脂肪氧合酶高度同源的cDNA片段（Bachem等1996） 。第98頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一在植物育種上的應(yīng)用在雜交育種中，單單根據(jù)育種材料的表型特點(diǎn)選配親本，往往會(huì)受到環(huán)境條件的干擾。輔之以DNA分子標(biāo)記的差異性分析，將使得親本選配更為快速、準(zhǔn)確，從而提高育種效率。揭示育種材料之間的親緣關(guān)系第99頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一雜種優(yōu)勢(shì)利用正成為許多作物提高產(chǎn)量和改善品質(zhì)的重要途徑。對(duì)遺傳差異與雜種優(yōu)勢(shì)關(guān)系的評(píng)價(jià)方法經(jīng)歷了從形態(tài)性狀遺傳距離，到生化

52、標(biāo)記遺傳差異，親緣系數(shù)，以及分子標(biāo)記遺傳差異等各種嘗試。雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)及機(jī)理研究第100頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一 DNA分子標(biāo)記的應(yīng)用，使得能夠在整個(gè)基因組范圍內(nèi)對(duì)大量親本材料間的遺傳距離進(jìn)行估測(cè)，并在此基礎(chǔ)上有效地預(yù)測(cè)具有強(qiáng)優(yōu)勢(shì)的組合（Smith等，1992；Bernardo，1994）。結(jié)果：既有相關(guān)性很高的報(bào)道，又有完全相反的結(jié)果。第101頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一張啟發(fā)認(rèn)為：分子標(biāo)記雜合度與雜種優(yōu)勢(shì)的相關(guān)性因遺傳材料而異，在經(jīng)過(guò)改良的優(yōu)良種質(zhì)中，兩者之間高度相關(guān)，而在一些未經(jīng)改良的優(yōu)良種質(zhì)中，相關(guān)程度很低。提出了“上位性是雜種優(yōu)勢(shì)的主要遺傳基礎(chǔ)”的重要觀點(diǎn)。第102頁(yè)，共114頁(yè)，2022年，5月20日，9點(diǎn)56分，星期一應(yīng)用cDNAAFLP技術(shù)進(jìn)行雜種優(yōu)勢(shì)機(jī)理的研究表明，強(qiáng)優(yōu)勢(shì)與弱優(yōu)勢(shì)組合間基因表達(dá)