凋亡細(xì)胞的生化檢測(cè)技術(shù)

1、凋亡細(xì)胞的生化檢測(cè)技術(shù)第1頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一細(xì)胞凋亡標(biāo)幟物分析技術(shù)實(shí)驗(yàn)7/28 細(xì)胞凋亡與疾病7/29 細(xì)胞計(jì)數(shù)與活性判斷7/30 凋亡細(xì)胞的生化檢測(cè)技術(shù)7/31 酵素免疫分析檢測(cè)技術(shù)8/1 流式細(xì)胞技術(shù)在凋亡細(xì)胞 分析上的應(yīng)用8:10 12:00 13:00 17:00凋亡細(xì)胞分析技術(shù)概述凋亡細(xì)胞染色與形態(tài)學(xué)觀察螢光顯微鏡在凋亡細(xì)胞分析上 的應(yīng)用 DNA片斷化檢測(cè)技術(shù)流式細(xì)胞儀上機(jī)實(shí)務(wù)第2頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一凋亡細(xì)胞的生化檢測(cè)技術(shù)授課教師：周致中(輔英生技)第3頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一細(xì)

2、胞死亡 Cell Death指細(xì)胞受到損傷且影響到細(xì)胞核時(shí)，細(xì)胞會(huì)呈現(xiàn)代謝停止、結(jié)構(gòu)破壞和功能喪失等不可逆變化的現(xiàn)象。Majno, G. and I. Joris, Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol, 1995. 146(1): p. 3-15.偶發(fā)性細(xì)胞死亡(Accidental cell death)細(xì)胞凋亡(Apoptosis)第4頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一細(xì)胞的死亡形式細(xì)胞死亡的形式簡(jiǎn)單歸納成兩種致死細(xì)胞方式：他殺(Death by murder

3、)與是自殺(Death by suicide) 。是經(jīng)由外物而造成的死亡，也就是偶發(fā)性細(xì)胞死亡(Accidental cell death)或細(xì)胞壞死(Necrosis) 。 細(xì)胞經(jīng)由自殺(Cell suicide)的手段所造成的死亡，生理性細(xì)胞死亡(Physiological cell death) 、程序性細(xì)胞死亡(Programmed cell death) 、或稱為細(xì)胞凋亡(Apoptosis)。第5頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一偶發(fā)性細(xì)胞死亡(Accidental cell death) 細(xì)胞壞死(Necrosis)缺血性細(xì)胞死亡(Ischemic cell

4、 death)是偶發(fā)性細(xì)胞死亡的代表，通常會(huì)伴隨著細(xì)胞腫脹的現(xiàn)象，Guido Majno和Isabella Joris認(rèn)為這樣的現(xiàn)象應(yīng)該被稱為腫脹性壞死(Oncosis)或凝固性壞死(Coagulation necrosis)細(xì)胞之所以會(huì)有腫脹的現(xiàn)象，是因?yàn)榧?xì)胞在缺乏ATP的幫助下，致使離子幫浦失調(diào)的緣故。腫脹性壞死和細(xì)胞凋亡是兩個(gè)相對(duì)的現(xiàn)象，因?yàn)槟[脹性壞死會(huì)有大水泡(Blebbing)與引發(fā)發(fā)炎反應(yīng)，而細(xì)胞凋亡則是水泡出芽(Budding)現(xiàn)象。第6頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一細(xì)胞壞死(necrosis) 細(xì)胞壞死(necrosis)是因病理而產(chǎn)生的被動(dòng)死亡，如物

5、理性或化學(xué)性的損害因子及缺氧與營(yíng)養(yǎng)不良等均導(dǎo)致細(xì)胞壞死。壞死細(xì)胞的膜通透性增高，致使細(xì)胞腫脹，細(xì)胞器變形或腫大，早期核無(wú)明顯形態(tài)學(xué)變化，最後細(xì)胞破裂。另外壞死的細(xì)胞裂解要釋放出內(nèi)含物，並常引起炎癥反應(yīng)；在癒合過(guò)程中常伴隨組織器官的纖維化，形成瘢痕。 第7頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一necrosis與apoptosis的圖第8頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一細(xì)胞凋亡的生化特徵第9頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一How do you assay apoptosis?activity of activated caspase

6、sproducts of caspasesCleaved nuclear DNA change in phospholipid distribution第10頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一第11頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一細(xì)胞凋亡檢測(cè)一、鏡檢凋亡小體二、培養(yǎng)細(xì)胞活性檢測(cè)三、核DNA片段檢測(cè) 1.DNA Ladder 2.Tunel 法四、細(xì)胞凋亡反應(yīng)核心因子檢測(cè)五、 Annexin V-FITC結(jié)合膜表PS實(shí)驗(yàn)六、 流式細(xì)胞術(shù)第12頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一第13頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分

7、，星期一Biochemical Phenotypic ChangesCalcium influx, pH changes (0.5 - 1 h)Energy pump shuts off (0.5 - 1 h)Mitochondria depolarization (1-3 h)Caspase-3 activation (2-3 h)第14頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一Apoptotic PhenotypesMorphological disintegrationPlasma membrane loses asymmetry (1-2 h)DNA fragmentat

8、ion (6-8 h by TUNEL, 12-24 h by Hypoploidy Analysis)Cell shrinkage (12-24 h)Chromatin condensation (18-36 h by gel analysis)Cells are phagocytosed before loss ofmembrane integrity -No inflammatoryresponse第15頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一細(xì)胞凋亡的過(guò)程大致可分為以下幾個(gè)階段： 1. 接受凋亡信號(hào)2. 凋亡調(diào)控分子間的相互作用3. 蛋白水解酶的活化（Caspase）4

9、. 進(jìn)入連續(xù)反應(yīng)過(guò)程 第16頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一第17頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一1凋亡的啟動(dòng)階段1）細(xì)胞凋亡的膜受體通路： Annexin V法粒線體膜勢(shì)能的檢測(cè)法細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)(bcl-2, bad)測(cè)定2）細(xì)胞色素C釋放和Caspases激活的生物化學(xué)途經(jīng) Caspases活性測(cè)定細(xì)胞色素C釋放第18頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一2凋亡的執(zhí)行 caspase2,3,6,7,8,9,10 活性測(cè)定PARP (Caspases受質(zhì)完整性測(cè)定)第19頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星

10、期一第20頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一凋亡蛋白酶(caspases)即半胱天門(mén)冬蛋白酶，其中Caspases8、9、10起凋亡啟動(dòng)者作用， Caspases3、6、7、9、12起凋亡效應(yīng)者作用，能分解細(xì)胞蛋白，起凋亡執(zhí)行器作用。凋亡蛋白酶原死亡信號(hào) + 受體（受體啟動(dòng)途徑）死亡信號(hào) 損傷線粒體（線粒體啟動(dòng)途徑）凋亡蛋白酶蛋白質(zhì)降解第21頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一第22頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一第23頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一第24頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分

11、，星期一Caspase family1）C端同源區(qū)存在半胱氨酸激活位點(diǎn)，此激活位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域?yàn)镼ACR/QG。2）通常以酶原的形式存在，相對(duì)分子質(zhì)量29000-49000（29-49KD），在受到激活後其內(nèi)部保守的天門(mén)冬氨酸殘基經(jīng)水解形成大（P20）小（P10）兩個(gè)次單位，並進(jìn)而形成兩兩組成的有活性的四聚體，其中，每個(gè)P20/P10異二聚體可來(lái)源於同一前體分子也可來(lái)源於兩個(gè)不同的前體分子。3）末端具有一個(gè)小的或大的原結(jié)構(gòu)域。 第25頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一Caspase activationCell death triggersOxidants, calcium B

12、ax, ceramideChannels open, outer membrane intactMatrix swelling, outer membranerupturesCytochrome cCytochrome c& other caspaseactivatorsNecrosisATP, Dy ROSInactive Apaf-1Active Apaf-1Caspase 9Caspases activatedApoptosis第26頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一使抑制凋亡因子失活，如 CAD/ICAD破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)， 如破壞Lamina將調(diào)節(jié)區(qū)與催化區(qū)分離，使蛋

13、白失活，如GelsolinCaspase 如何殺死細(xì)胞？第27頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一參與誘導(dǎo)凋亡的Caspase分成兩大類： 啟動(dòng)酶（inititaor）和效應(yīng)酶（effector）它們分別在死亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的上游和下游發(fā)揮作用。Caspase活化機(jī)制：有順序的多步水解的過(guò)程首先在caspase前體的N-端前肽和大次單位之間的特定位點(diǎn)被水解去除N-端前肽，然後再在大小次單位之間切割由大次單位和小次單位組成異源二聚體，再由兩個(gè)二聚體形成有活性的四聚體。第28頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一Caspase活化的兩種機(jī)制同源活化和異源活化發(fā)生同源

14、活化的Caspase又被稱為啟動(dòng)caspase（initiator caspase），包括caspase-8,-10,-9，誘導(dǎo)凋亡後，起始Caspase被集合到特定的起始活化復(fù)合體，形成同源二聚體，導(dǎo)致同源分子之間的酵素?cái)嗲卸陨砘罨椿罨羌?xì)胞凋亡過(guò)程中最早發(fā)生的capases水解活化事件，啟動(dòng)Caspase活化後，即開(kāi)啟細(xì)胞內(nèi)的死亡程序，通過(guò)異源活化方式水解下游Caspase將凋亡信號(hào)放大，同時(shí)將死亡信號(hào)向下傳遞。異源活化（hetero-activation）即由一種caspase活化另一種caspase是凋亡蛋白酶的酶原被活化的經(jīng)典途徑。被異源活化的Caspase又稱為執(zhí)行casp

15、ase(executioner caspase)，包括Caspase-3,-6,-7。執(zhí)行Caspase不像啟動(dòng)Caspase ，不能被募集到或結(jié)合起始活化復(fù)合體，它們必須依賴啟動(dòng)Caspase才能活化。 第29頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一Apoptosis common execution phase第30頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一Caspase-3活性的檢測(cè)Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在於胞漿中，在凋亡的早期階段，

16、它被激活，活化的Caspase-3由兩個(gè)大次單位（17KD）和兩個(gè)小次單位（12KD）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。可透過(guò)Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及分析Caspase-3受質(zhì)（ADP-核糖）聚合酶 poly（ADP-ribose）polymerase，PARP等裂解推定apoptosis。第31頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一第32頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一活性Caspase-3的western blot檢測(cè)收集細(xì)胞PBS洗滌抽提細(xì)胞裂解液蛋白定量SDS電泳PVDF膜轉(zhuǎn)移5%脫脂奶粉

17、blocking，室溫1.52h或4C過(guò)夜anti-Caspase-3 antibody 室溫反應(yīng)12h或4C過(guò)夜TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，510min/次HRP-標(biāo)記的二抗室溫反應(yīng)12h TBS-T洗3次， 510min/次ECL顯影。第33頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一2 螢光分光光度計(jì)分析原理：活化的Caspase-3能夠特異切割DEVD-X底物，水解D-X肽鍵。根據(jù)這一特點(diǎn)，設(shè)計(jì)出螢光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽Ac-DEVD-AFC。在共價(jià)偶聯(lián)時(shí)，AFC不能被激發(fā)螢光，短肽被水解後釋放出AFC，自由的AFC才能被激發(fā)發(fā)射螢光。根據(jù)釋放的A

18、FC螢光強(qiáng)度的大小，可以測(cè)定caspase-3的活性，從而反映Caspase-3被活化的程度。方法：1. 凋亡細(xì)胞以PBS洗滌。2. 加細(xì)胞裂解液溶解細(xì)胞。3. 加Ac-DEVD-AFC（caspase-3四肽螢光底物）37C反應(yīng)1h。4. 螢光分光光度計(jì)（Polarstar）分析螢光強(qiáng)度（激發(fā)光波長(zhǎng)380nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為430-460nm）。第34頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一Phosphatidylserine is on cytosolic side of membrane in normal cells, but “flips” to outer membr

19、ane in apoptosis第35頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一reorganization of actin cytoskeleton第36頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一Phagocyte recognition in the clearance of mammalian apoptotic cells- possible signals?第37頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一 PS（磷脂酰絲氨酸）在細(xì)胞外膜上的檢測(cè): PS從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)移到外側(cè)在細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)後不久發(fā)生, 可能作為免疫系統(tǒng)的識(shí)別標(biāo)誌。Anne

20、xinV，一個(gè)鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，能專一性的結(jié)合暴露在膜外側(cè)的PS，再通過(guò)簡(jiǎn)單的顯色或發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。這是一種凋亡早期的活細(xì)胞檢測(cè)（懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞都適用），可與DNA染料或別的晚期檢測(cè)方法相結(jié)合來(lái)標(biāo)記凋亡的發(fā)展階段。 第38頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法）磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位於細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面。Annexin-V是一種分子量為3536KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進(jìn)

21、行螢光素（FITC、PE）或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-V作為螢光探針，利用流式細(xì)胞儀或螢光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。第39頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一第40頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一適用對(duì)象細(xì)胞可單獨(dú)使用螢光顯微鏡觀察或配合螢光光譜儀；螢光顯像儀（immage），如使用流式細(xì)胞儀（

22、Cytoflow metry）效果更佳。 組織切片組織切片使用單獨(dú)螢光顯微鏡觀察或配合螢光顯像儀（immage）。第41頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一 Annexin V法 1 懸浮細(xì)胞的染色：將正常培養(yǎng)和誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞用PBS洗2次調(diào)製成細(xì)胞懸浮液（0.51106）；貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞染色：先用0.25%的胰酶消化， PBS洗滌、製成細(xì)胞懸浮液。2 加入100ul Binding Buffer和FITC標(biāo)記的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室溫避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反應(yīng)5min後，加入400ul Binding Buffe

23、r，用螢光顯微鏡和共聚焦激光掃瞄顯微鏡進(jìn)行觀察或立即用FACScan進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)（一般不超過(guò)1h）。3. 同時(shí)以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為陰性對(duì)照。注意事項(xiàng)： 1. 整個(gè)操作動(dòng)作要盡量輕柔，勿用力吹打細(xì)胞。2. 操作時(shí)注意避光，反應(yīng)完畢後盡快在一小時(shí)內(nèi)檢測(cè)。第42頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一Annexin V: specific apoptosis probePrinciple: based on observation that phosphatidylserine is translocated to plasma membrane

24、 during apoptosis. Annexin V preferentially binds PS As PS translocates to outerplasma membrane, timedependent increase in annexinV-FITC fluorescence Quantification of annexinV binding by flow cytometry第43頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一第44頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一AnnexinV-FITC PS檢測(cè)在細(xì)胞外膜上的PS可檢測(cè)早期的apo

25、ptosis第45頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一Annexin V Assay能夠區(qū)分死亡與凋亡細(xì)胞第46頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一Propidium iodideAnnexin V-FITCFlow cytometric analysis of cell apoptosis:PI & annexin V stainingA- controlB-spontaneous apoptosisC- actinomycin DD- calcium ionophoreQuandrants1 viable cells2 early apoptosis

26、; PSexposed, intact membrane3 late apoptosis; PS exposed,disrupted membrane4 necrosis; disrupted & membrane loss1234第47頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一第48頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一粒線體膜勢(shì)能的檢測(cè)法粒線體在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著樞紐作用，多種細(xì)胞凋亡刺激因子均可誘導(dǎo)不同的細(xì)胞發(fā)生凋亡，而粒線體跨膜電位DYmt的下降，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中最早發(fā)生的事件，它發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特徵（染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂）出現(xiàn)之前，一

27、旦粒線體DYmt崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。第49頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一凋亡誘導(dǎo)因素粒線體跨膜電位粒線體PTP開(kāi)放Cyt.C,Apaf,等釋放AIF潛在DNase活化DNase激活Caspases細(xì)胞凋亡粒線體損傷第50頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一目前證據(jù)顯示，線粒體的功能改變?cè)诩?xì)胞凋亡的發(fā)生中起重要作用 線粒體內(nèi)膜通透性 線粒體內(nèi)膜的跨膜電位m 能量合成水平線粒體功能和結(jié)構(gòu)破壞引起細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制：凋亡誘導(dǎo)因素作用於細(xì)胞後線粒體內(nèi)膜跨膜電位（m）下降，線粒體內(nèi)外膜之間的通透性轉(zhuǎn)換孔PTP開(kāi)放；使細(xì)胞凋亡啟動(dòng)因子（Cytochrome C）,凋亡蛋白酶激活因子（Apaf） 和凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）釋放 線粒體損傷第51頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一Mitochondria in Apoptosis 第52頁(yè)，共56頁(yè)，2022年，5月20日，8點(diǎn)54分，星期一Mechan