細菌芽孢染色及酵母菌的觀察-山東大學(xué)

1、 山東大學(xué)實驗報告 2011年 11 月 2 日姓名 * 班級 * 學(xué)號 * 同組者：*科目 微生物學(xué)實驗 題目 細菌芽孢染色及酵母菌的觀察 組別 * 第 PAGE 9 頁 共 NUMPAGES 9 頁 微生物實驗報告*細菌芽孢染色及酵母菌的觀察【實驗?zāi)康摹繉W(xué)習(xí)芽孢染色法，了解芽孢的形態(tài)特征；觀察酵母形態(tài)及出芽方式，區(qū)分酵母菌的死活細胞；學(xué)習(xí)酵母子囊孢子的觀察方法?！緦嶒炘怼緼、細菌芽孢染色的基本原理芽孢是芽孢桿菌屬和梭菌屬細菌生長到一定階段形成的一種抗逆性很強的休眠體結(jié)構(gòu)，也被稱為內(nèi)生孢子，通常呈圓形或橢圓形。細菌能否形成芽孢及芽孢的形狀，著生位置、芽孢囊是否膨大等特征都是鑒定細菌的重要指

2、標(biāo)。與正常細胞或菌體相比，芽孢壁厚、透性低而不易著色，但是芽孢一旦著色就很難被脫色。利用這一特點，首先用著色能力較強的染料，如孔雀綠，在加熱條件下進行染色時，此染料不僅可以進入菌體，而且也可以進入芽孢，進入菌體的染料可經(jīng)水洗脫色，而進入芽孢的染料則難以透出。再用對比度大的復(fù)染劑（如番紅液）染色后，菌體染上復(fù)染劑顏色，而芽孢仍為原來的顏色，這樣就可以將兩者區(qū)別開來。在不同 HYPERLINK /view/19168.htm t _blank 細菌中，芽孢所處的位置不同，有的在中部，有的在偏端，有的在頂端。芽孢一般呈圓形、橢圓形、圓柱形。常見的細菌芽孢形態(tài)和著生位置如下圖所示：B、酵母菌形態(tài)及出芽

3、方式觀察的基本原理酵母菌是一群單細胞的真核微生物。這個詞語也是無分類學(xué)意義的普通名稱，通常用于以裂殖或芽殖來進行無性繁殖的各種單細胞真菌。由于不同的酵母菌在進化和分類地位上的異源性，因此很難對酵母菌下一個確切的定義，通常認為，酵母菌具有以下5個特點：個體一般以單細胞狀態(tài)存在；多數(shù)營出芽繁殖；能發(fā)酵糖類產(chǎn)能；細胞壁常含甘露聚糖；常生活在含糖類較高、酸度較大的水生環(huán)境中。單細胞的酵母菌個體是常見細菌的幾倍甚至幾十倍，可在40倍顯微鏡下經(jīng)過簡單染色直接觀察。酵母菌大多數(shù)采取出芽方式進行無性繁殖，也可以通過結(jié)合產(chǎn)生子囊孢子，進行有性繁殖。由于細胞個體大，采取涂片的方法制片有可能損傷細胞，一般通過美藍染

4、液水浸片法來觀察酵母菌活體形態(tài)及出芽生殖方式。出芽繁殖是酵母菌進行無性繁殖的主要方式。成熟的酵母菌細胞，先長出一個小芽，芽細胞長到一定程度，脫離母細胞繼續(xù)生長，爾后形成新個體。有多邊出芽、兩端出芽、和三邊出芽。酵母菌不同類型出芽方式同時，采用美藍染液水浸片法還可以對酵母菌的死、活細胞進行鑒別。美藍對細胞無毒，其氧化型呈藍色，還原型無色。由于新陳代謝，活細胞胞內(nèi)有較強還原能力，使美藍由藍色氧化型變成無色的還原型，染色后活細胞呈無色。死細胞或代謝能力微弱的衰老細胞還原能力弱，染色后細胞呈藍色或淡藍色。C、酵母菌子囊孢子觀察的基本原理子囊類酵母菌是以接合產(chǎn)生形成子囊和子囊孢子的方式進行有性繁殖的。它

5、們一般通過鄰近的兩個形態(tài)相同而性別不同的細胞各自伸出一根管狀的原生質(zhì)突起相互接觸、局部融合并形成一條通道，再通過質(zhì)、核配和減數(shù)分裂形成4或8個子核，然后它們各自與周圍的原生質(zhì)結(jié)合在一起，再在其表面形成一層孢子壁，這些一個個子囊孢子就成熟了，而原有的營養(yǎng)細胞則成了子囊。能否形成子囊孢子及其形態(tài)是酵母菌分類鑒定的重要依據(jù)之一。酵母菌形成子囊孢子需一定條件，其中麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基有利于釀酒酵母子囊孢子的形成。孢子壁厚不易著色，但是一旦著色就很難被脫色。因此先用強染色劑（孔雀綠）下染色，使染料進入菌體和孢子，水洗時菌體中染色被洗脫而孢子中染料保留。在用對比度大的復(fù)染色劑染色后，菌體染上復(fù)染色劑的顏色而孢子保留

6、原來顏色，這樣可將兩者區(qū)別開來?！緦嶒炂鞑摹烤N：枯草芽孢桿菌，梭狀芽孢桿菌, 釀酒酵母7d麥?zhǔn)希óa(chǎn)孢培養(yǎng)基）液體培養(yǎng)物，釀酒酵母斜面培養(yǎng)物。溶液和試劑：0.01%美藍水溶液，5%孔雀綠水溶液，0.5%番紅水溶液，95%乙醇，蒸餾水等。香柏油、二甲苯儀器及其它用品：普通光學(xué)顯微鏡、擦鏡紙、綢布、酒精燈、載玻片、接種針、培養(yǎng)皿等【操作步驟】細菌芽孢染色的基本原理實驗流程圖：詳細步驟：涂片，加熱干燥及固定在潔凈蓋玻片接近中部兩處分別滴一滴無菌水，分別接種枯草芽孢桿菌及梭狀芽孢桿菌。然后按照常規(guī)方法加熱干燥及固定；孔雀綠加熱染色用木夾夾住載玻片，向載玻片上滴加5%孔雀綠水溶液使之完全覆蓋涂菌部位，然

7、后在酒精燈上微微加熱（孔雀綠著色能力強，加熱可使較難染色的芽孢染成綠色，且再難洗脫）至染液冒蒸汽開始計時并維持5min，注意加熱時應(yīng)以有蒸汽微微冒出為宜，過熱或加熱不足均會影響觀察效果，且加熱時在載玻片上隨時補加染液，切勿讓涂片干涸；水洗水洗一定要等載玻片冷卻后進行，否則可能導(dǎo)致載玻片的破裂。具體水洗按常規(guī)方法進行；復(fù)染用0.5%番紅水溶液復(fù)染2min；水洗并干燥按常規(guī)方法水洗后自然干燥；鏡檢先在低倍鏡下尋找視野范圍，然后換用高倍鏡調(diào)焦，最后加香柏油在油鏡下仔細尋找兩種細菌以及其周圍或內(nèi)部染成綠色的芽孢。酵母菌形態(tài)及出芽方式觀察的基本原理實驗流程圖：詳細步驟：涂片在潔凈蓋玻片中部滴一滴0.01

8、%美藍水溶液，按常規(guī)方法接種酵母加蓋玻片加蓋玻片時首先使蓋玻片的一端接觸載玻片上的液滴的一端，然后再將另一端緩緩放下，目的是防止氣泡的產(chǎn)生，以免影響觀察；放置及鏡檢從接種開始計時，放置3min，然后在高倍鏡（40）下觀察酵母菌的形態(tài)，根據(jù)染色狀態(tài)判斷酵母菌的死活（由于新陳代謝，活細胞胞內(nèi)有較強還原能力，使美藍由藍色氧化型變成無色的還原型，染色后活細胞呈無色。死細胞或代謝能力微弱的衰老細胞還原能力弱，染色后細胞呈藍色或淡藍色），尋找并觀察酵母菌不同類型的出芽方式（一端出芽或兩端出芽）。將酵母菌美蘭浸片放置30min，再用高倍鏡（40）觀察，根據(jù)染色狀態(tài)判斷酵母菌的死活，并與3min時的情況做一對

9、比說明。酵母菌子囊孢子的觀察實驗流程圖：詳細步驟：涂片，加熱干燥及固定在潔凈蓋玻片中央滴一滴無菌水，接種液體培養(yǎng)物（產(chǎn)孢培養(yǎng)基）中的釀酒酵母，然后按照常規(guī)方法加熱干燥及固定；孔雀綠熱染，水洗按照上面芽孢染色法中孔雀綠熱染的操作將涂菌部位用孔雀綠熱染2.5min，然后水洗；乙醇脫色，水洗用95%乙醇對涂菌部位覆蓋脫色30s，然后水洗；番紅復(fù)染，水洗及干燥用0.5%番紅水溶液對涂菌部位復(fù)染30s1min，然后水洗，自然干燥；鏡檢將裝片置于顯微鏡下，先用低倍鏡尋找到觀察部位，再用油鏡觀察。（可在酵母菌細胞旁觀察到14個同時存在的子囊孢子）【實驗結(jié)果及分析】繪圖繪圖說明枯草芽孢桿菌和梭狀芽孢桿菌的形態(tài)

10、特征（包括芽孢形狀、著生位置及芽孢囊形狀等）。繪圖說明染色330min的釀酒酵母形態(tài)特征及出芽生殖情況。實驗結(jié)果記錄芽孢染色結(jié)果記錄表： 項目菌種 芽孢形狀芽孢著生位置芽孢囊形狀枯草芽孢桿菌橢圓形位于菌體中央或稍偏圓形不膨大梭狀芽孢桿菌圓形或卵圓形位于菌體中央，極端或次極端膨大呂氏堿性美蘭染液作用時間與釀酒酵母死、活細胞數(shù)量變化記錄表：作用時間3min30min每視野活細胞數(shù)/個20170每視野死細胞數(shù)/個13154活細胞比率93.9%31.2%結(jié)論：由統(tǒng)計結(jié)果可明顯得到美藍雖為溫和染色劑，但長時間后菌體依然會被染色劑破壞或缺水導(dǎo)致大量死亡。酵母菌出芽狀況的說明由下圖（見實驗圖示）可清晰的看到

11、酵母菌不同類型的出芽生殖方式，包括一端出芽，兩端出芽多邊出芽等，觀察效果較為理想。子囊孢子染色由于染色操作以及菌體的原因，未能看到大量四個聚集在一起的孢子，僅能觀察到一些單個孢子或兩個聚合在一起的孢子以及少數(shù)三個聚合在一起的孢子，通過觀察可明顯得到菌體和孢子囊呈紅色，孢子呈綠色，由紅色孢子囊包裹?？傊湍妇幽益咦拥挠^察不是很理想。芽孢(綠)菌體(紅)實驗圖示圖1梭狀芽孢桿菌芽孢圖示(10100)圖2枯草芽孢桿菌芽孢圖示(10100)活細胞死細胞圖3酵母菌美蘭浸片法圖示（3min 1040)圖4酵母菌美蘭浸片法圖示（30min 1040)一端出芽多邊出芽兩端出芽圖5酵母菌出芽生殖圖示（1040

12、）菌體（紅）子囊孢子（單生）子囊孢子（兩個聚生）子囊孢子（三個聚生，綠）圖7酵母菌子囊孢子（三個）圖示（10100）圖6酵母菌子囊孢子（單個及兩個）圖示（10100）【思考題】根據(jù)你的觀察結(jié)果，美藍染液濃度及作用時間與酵母菌死、活細胞比例變化是否有關(guān)系？試分析原因。答：有關(guān)系，美藍濃度越大，作用時間越長則視野中死菌比例越大。原因：一是雖然美藍對細胞無毒，但濃度大時細胞外滲透壓增大導(dǎo)致細胞失水，二者細胞還原能力有限，濃度高或時間較長都會對細胞結(jié)構(gòu)構(gòu)成破壞。你在實驗中是否觀察到釀酒酵母的子囊孢子？若未觀察到，試分析原因（子囊孢子的形成與培養(yǎng)條件的關(guān)系）。答：酵母菌有無性生殖（出芽）和有性生殖（產(chǎn)生子囊孢子）兩種繁殖方式，不同的培養(yǎng)基會導(dǎo)致繁殖方式不同，在麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基中營養(yǎng)比較缺乏而易產(chǎn)孢子，而酵母合成培養(yǎng)基中營養(yǎng)豐富，利于菌體以出芽方式繁殖。觀察效果差可能是酵母菌由于本身生長條件而產(chǎn)生的孢子較少，也可能是在染色的過程中染色不到位或脫色時間過長所致。為什么芽孢染色法需要進行加熱？能否用簡單染色法觀察到細菌芽孢？答:因為與正常細胞或菌體相比，芽孢壁厚，通透性低而不易著色，而加熱時芽孢的通透性高，此時染液可以進入從而使芽孢著色，而簡單染色法不能使芽孢