動物細胞培養(yǎng)的準備

1、動物細胞培養(yǎng)的準備第1頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二 玻璃器皿 金屬器械 橡膠 塑料制品 第2頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二玻璃器皿的清洗 浸泡（自來水） 刷洗（洗衣粉） 酸泡（24小時） 自來水沖洗蒸溜水浸泡和沖洗 50烘干 橡膠、塑料制品的清洗 清水清洗浸于自來水過夜用紗布或棉簽和50稀洗液刷洗流水沖洗（1520遍） 晾干浸于清潔液15分鐘流水沖洗（1520遍） 蒸餾水浸洗三次，三蒸水泡24小時晾干或50烘干備用。第3頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二金屬器械的清洗 放到含洗滌劑的水中反復(fù)刷洗后自來水反復(fù)沖洗干

2、凈晾干用75酒精擦拭自來水反復(fù)沖洗干凈最后三蒸水浸洗3次，晾干或50烘干備用。 正壓除菌濾器的清洗 含稀洗滌劑的水中，反復(fù)刷洗后流水沖洗15min 漓水蒸餾水浸泡24h 三蒸水浸泡24h 晾干或50烘干備用。第4頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二塑料器材常用的塑料器材有多孔培養(yǎng)板（4孔、6孔、12孔、24孔、96孔）、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶及吸頭。重復(fù)使用的處理步驟： 自來水刷洗 3HCl或2NaOH溶液浸泡過夜 自來水充分沖洗 雙蒸水沖洗3次 紫外線直接照射或輻照滅菌第5頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二清洗時應(yīng)注意： 浸泡、煮沸、酸泡的器皿內(nèi)要充滿液

3、體，不得有氣泡。 沖洗時要流水振蕩沖洗，方法是：每瓶灌2/3容積的自來水，振蕩后倒掉，重復(fù)15-20次。 煮沸前水面要高于器材5厘米，水沸后投入洗滌劑第6頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二配制時先在容器中加入蒸餾水，加熱溶解重鉻酸鉀， 再將容器置流動自來水中，待重鉻酸鉀液冷卻后， 緩慢加入濃硫酸，邊加邊攪拌。重鉻酸鉀（克）濃硫酸（毫升）蒸餾水（毫升）弱液1001001000次強液1202001000強液631000200組成強度第7頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二包裝材料：牛皮紙 硫酸紙 鋁箔 紗布 金屬消毒桶 鋁質(zhì)飯盒方式：全包裝 局部包裝第

4、8頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二包裝時應(yīng)注意：手指與器材接觸面積要小，手指不能觸及器材的使用端；封閉器材使用端，標記器材手持端；小包裝；玻璃管道口（尖吸管、移液管手持端等）加棉花。第9頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二消毒滅菌方法清除或殺滅物品 上的一切微生物, 以殺滅芽孢為準第10頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二物理法1：紫外線消毒紫外線直接照射消毒是各實驗室常用的方法；主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒。紫外線消毒時產(chǎn)生臭氧，對身體有害，故紫外線消毒停止后30分鐘才可入室工作。目前有的實驗室

5、采用電子滅菌燈代替紫外燈進行空氣消毒。第11頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二紫外線消毒法是利用紫外線照射，使菌體蛋白發(fā)生光解、變性，菌體內(nèi)的核酸、酶遭到破壞而死亡的一種消毒方法。紫外線的殺菌力與其波長密切相關(guān)，最佳殺菌波長為250-270nm. 第12頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二光照消毒法主要利用紫外線照射，使菌體蛋白發(fā)生光解變性而導(dǎo)致細菌死亡，常用方法有： 日光曝曬消毒法 日光曝曬法用于枕頭、床褥、床墊、棉絮等的消毒，一般曝曬6 h可達到消毒，曝曬時2 h翻面一次 紫外線消毒法 紫外線消毒法用于空氣消毒與物品表面的消毒 第13頁，共90

6、頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二物理法2：干熱消毒干熱是指相對濕度在20%以下的高熱，由空氣導(dǎo)熱，傳熱 較慢，干熱消毒滅菌常用的方法;1.焚燒滅菌法;2.燃燒滅菌法;3.干烤消毒滅菌法:用于高溫下不變質(zhì)、不損壞、不蒸發(fā)的物品，如油劑、粉劑、玻璃器具、金屬制品等; 玻璃器皿，160oC 90-240mins4.微波消毒滅菌法:用于食品及餐具的消毒 醫(yī)療藥品及耐熱非金屬材料物品的消毒滅菌第14頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二物理法3：濾過消毒目前細胞培養(yǎng)工作中采用的培養(yǎng)用液，包括人工合成培養(yǎng)液、血清、消化用胰酶等常含有維生素、蛋白、多肽、生長因子等物質(zhì)，這

7、些物質(zhì)在高溫或射線照射下易發(fā)生變性或失去功能，因而上述液體多采用濾過消毒以除去細菌 。第15頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二濾膜使用時應(yīng)注意：濾膜薄且光滑，容易移動，安裝時膜位置一定要放正。過分干燥的濾膜很脆，在高壓或高溫干燥時易破裂，因此安裝前可先用三蒸水潤濕濾膜。為保證過濾效果，在使用時，每次墊兩張濾膜，上面一張孔徑為045微米，下面一張孔徑為022微米，或兩張均為022微米。使用無齒玻片鑷子夾取濾膜，以防止鑷齒弄破濾膜。加大壓力時用力應(yīng)均勻，用后打開濾器對光檢查濾膜是否移動和有無破裂。第16頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二用于濾過除菌的

8、各式濾器濾過除菌法：培養(yǎng)基、血清、消化酶、抗生素等。第17頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二物理法4： 濕熱滅菌濕熱由空氣和水蒸氣導(dǎo)熱，傳熱快，穿透力強，濕熱消毒滅菌常用的方法： 煮沸消毒法 高壓蒸汽滅菌法，一般高壓蒸汽滅菌的壓力為102. 97-137.30 kPa，溫度為1211260C經(jīng)15-30 min可達到滅菌目的最常用、最有效的方法；布、金屬、橡膠、玻璃、某些培養(yǎng)液培養(yǎng)液，橡膠：10磅（115oC）20mins； 玻璃、金屬： 12磅（121oC）30mins；第18頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二高壓蒸汽滅菌器第19頁，共90頁，

9、2022年，5月20日，16點12分，星期二化學(xué)消毒滅菌法化學(xué)消毒滅菌法是利用化學(xué)藥物滲透細菌體內(nèi)，使菌體蛋白凝固變性，干擾細菌酶的活性，抑制細菌代謝和生長或損害細菌膜的結(jié)構(gòu)，改變其滲透性，破壞其生理機能等，從而達到消毒滅菌目的第20頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二化學(xué)消毒劑的使用原則(1)根據(jù)物品的性能及微生物的特性，選擇合適的消毒劑。 (2)嚴格掌握消毒劑的有效濃度、消毒時間及使用方法。 (3)消毒劑應(yīng)定期更換，易揮發(fā)的消毒劑要加蓋，并定期檢測，調(diào)整其濃度。(4)浸泡前將物品洗凈擦干，浸沒在消毒液內(nèi)的物品應(yīng)注意打開軸節(jié)或套蓋，管腔內(nèi)應(yīng)注滿消毒液。 (5)在使用前用

10、無菌生理鹽水沖凈消毒后的物品，避免消毒劑刺激人體組織 第21頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二化學(xué)消毒劑的分類l、高效消毒劑 高效消毒劑可殺滅一切微生物，包括芽孢 (碘酊、福爾馬林等) 2、中效消毒劑 中效消毒劑可殺滅細菌繁殖體，不能殺滅芽孢(乙醇、碘伏等) 3、低效消毒劑 低效消毒劑可殺滅細菌繁殖體，不能殺滅結(jié)核桿菌、親水性病毒或芽孢(苯扎溴銨、氯己定等) 第22頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二化學(xué)消毒劑的使用方法浸泡法 侵泡法是將物品洗凈、擦干后，浸沒在消毒液中進行消毒滅菌的方法。 擦拭法 擦拭法是用消毒劑直接擦拭人體或物品表面，如皮膚、桌

11、椅等，達到消毒滅菌的方法。 噴霧法 噴霧法是利用噴霧器將消毒劑變成微粒氣霧彌散在空氣中對空氣和物品表面進行消毒滅菌的方法。 熏蒸法 熏蒸法是將消毒劑加熱或加人氧化劑，使其產(chǎn)生氣體來進行消毒滅菌的方法。第23頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二常用消毒劑過氧乙酸 peracetic acid 福爾馬林formalin （37 -40%的甲醛溶液) 戊二醛glutaraldehyde 環(huán)氧乙烷ethylene oxide 含氯消毒劑 乙醇alcohol 苯扎漠銨(新潔爾滅) 第24頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二過氧乙酸消毒效力：高效 0.2用于手消

12、毒，浸泡1- 2min 0.5用于用具消毒，浸泡30 - 60 min 0.2 -0.5用于物體表面消毒，或浸泡10 min 1 -2用于空氣消毒，8 mL/m3，加熱熏蒸，密閉門窗30-120 min 第25頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二注意事項： 對金屬有腐蝕性，不可用于金屬器械的消毒； 易氧化分解而降低殺菌力，需現(xiàn)配現(xiàn)用； 濃溶液有腐蝕性，配制時要戴口罩和橡膠手套；存放于陰涼避光處，防高溫引起爆炸； 第26頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二福爾馬林(37 -40%的甲醛溶液)消毒效力：高效 40甲醛210 mLm3加水420 mL加熱，

13、作室內(nèi)物品及空氣消毒； 40甲醛4060 mLm3加高錳酸鉀2040 g，柜內(nèi)熏蒸，密閉612 h； 10甲醛可作浸泡器械消毒第27頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二注意事項： 蒸汽穿透力弱，因此衣服應(yīng)掛起消毒； 消毒效果易受溫度、濕度影響，要求室溫在18以上，相對濕度在70以上； 對人體有一定毒性和刺激性，使用時注意防護；第28頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二戊二醛消毒效力：高效 濃度和用法：2戊二醛溶液加入0.3碳酸氫鈉，成為2堿性戊二醛，用于浸泡不耐高溫的金屬器械、醫(yī)學(xué)儀器、內(nèi)鏡等，消毒需10-30 min，滅菌需7-10 h.第29頁，

14、共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二注意事項： 每周過濾1次，每2周應(yīng)更換消毒液1次； 浸泡金屬類物品時，加入0.5亞硝酸鈉作為防銹劑 ；消毒滅菌后的物品，使用前用無菌蒸餾水沖凈第30頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二含氯消毒劑含氯消毒劑：常用的有漂白粉消毒效力：中、高效 濃度和用法： 0.5漂白粉溶液、0.51氯胺溶液用于浸泡餐具、便器等，浸泡30 min ；13漂白粉溶液、0.53氯胺溶液噴灑或擦拭地面、墻壁及物品表面； 排泄物消毒：干糞5份加漂白粉1份攪拌，放置2 h，尿液100 mL加漂白粉1 g，放置1 h第31頁，共90頁，2022年，5月

15、20日，16點12分，星期二注意事項： 消毒劑保存在密閉容器內(nèi)， 置于陰涼、干燥、通風(fēng)處，減少有效氯的喪失； 配制的溶液性質(zhì)不穩(wěn)定，應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用； 有腐蝕及漂白作用，不宜用于金屬制品、有色衣服及油漆家具的消毒； 3 d更換一次消毒液第32頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二乙醇消毒效力：中效 濃度和用法：70-75用于皮膚消毒 95用于燃燒滅菌 注意事項： 易揮發(fā)，需加蓋保存，定期測定，保持有效濃度 有刺激性，不宜用于黏膜及創(chuàng)面消毒 易燃，故應(yīng)置于避火處第33頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二苯扎漠銨(新潔爾滅)消毒效力：低效0.1-0.2用于皮膚消

16、毒 0.1%-0.2用于金屬器械消毒，浸泡15-30 min (加入0.5亞硝酸鈉以防銹)第34頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二注意事項： 對肥皂、碘、高錳酸鉀等陰離子表面活性劑有拮抗作用 有吸附作用，會降低藥效，所以溶液內(nèi)不可投人紗布、棉花等 對鋁制品有破壞作用，故不可用鋁制品盛裝第35頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二 75酒精、新潔爾滅、過氧乙酸、乳酸和洗必泰等都是常用的有效消毒劑。 0.5的過氧乙酸在10分鐘內(nèi)可將芽孢菌和各種病毒殺死； 乳酸蒸汽常用做無菌室內(nèi)或周圍環(huán)境的定期消毒； 75酒精常用于超凈臺的臺面、器械、實驗操作者的皮膚等的

17、消毒; 0.1新潔爾滅用于對桌、椅、地面、皮膚、操作臺面進行擦拭或浸泡消毒； 0.1洗必泰水溶液用于皮膚浸泡消毒。第36頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二總結(jié)：物理消毒（1）射線消毒：60Co、X射線，用于血清和塑料制品滅菌。（2）紫外線：器皿需結(jié)合75酒精浸泡，照射30min。（3）干熱滅菌：160C，90120 min。主要用于玻璃、金屬器皿。（4）濕熱滅菌：121C，30 min；適用布、橡膠、某些塑料、金屬、玻璃等。（5）過濾除菌：用孔徑小于0.22m的濾膜過濾，適用于培養(yǎng)用液和其他不能高壓滅菌的溶液。第37頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星

18、期二總結(jié)：化學(xué)消毒（1）70（75）酒精：用于手、器械、工作臺面。（2）0.1新潔爾滅：主要用于手的清洗和工作臺面的清洗。（3）來蘇水：主要用于桌椅、墻壁、地面的消毒，也可用于空氣消毒。（4）0.5%過氧乙酸：10min可將芽孢菌殺死，用于表面消毒。 （5）其他：乳酸、甲醛、高錳酸鉀、氯等。第38頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二無菌室的滅菌： 1.定期打掃無菌室：每周打掃一次，先用自來水拖地、擦桌子、超凈工作臺等，然后用3來蘇爾或者新潔爾 滅或者0.5過氧乙酸擦拭。 2.CO2孵箱（培養(yǎng)箱）滅菌：先用3新潔爾滅擦拭，然后用75酒精擦拭或者0.5過氧乙酸，再用紫外燈照射

19、3.實驗前滅菌：打開紫外燈、三氧殺菌機、空氣凈化器系統(tǒng)各20-30分鐘4.實驗后滅菌：用75酒精（3新潔爾滅）擦拭超凈臺、邊臺、倒置顯微鏡的載物臺。第39頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二實驗人員的無菌準備：1.肥皂洗手。2.穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩、放好拖鞋3.用75酒精棉球擦凈雙手。第40頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二無菌操作的注意事項：1.凡是帶入超凈工作臺內(nèi)的酒精、PBS、培養(yǎng)基、胰蛋白酶的瓶子均要用75酒精擦拭瓶子的外表面2.靠近酒精燈火焰操作。3.器皿使用前必須過火滅菌4.繼續(xù)使用的器皿（如瓶蓋、滴管）要放在高處，使用時仍要過

20、火。5.各種操作要靠近酒精燈，動作要輕、準確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸。6.吸取兩種以上的使用液時要注意更換吸管，防止交叉污染。第41頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二培養(yǎng)前準備器材物品放到操作場所（培養(yǎng)室、超凈臺）內(nèi)消毒。 第42頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二操作間消毒每天0.2% 新潔爾滅拖地；每天紫外線照射分鐘超凈臺在每次試驗前用酒精擦拭，然后紫外線消毒分鐘第43頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二洗手和著裝火焰消毒操作：動作準確敏捷避免手碰到器皿布局合理瓶口順風(fēng)不同移液管取液不能講話、咳嗽第44頁，共90頁

21、，2022年，5月20日，16點12分，星期二專門人配液，滅菌，標簽一切用品固定存放；“避免污染”第45頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二第二節(jié)、細胞培養(yǎng)用液第46頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二水：平衡鹽溶液（BBS） ：消化液：培養(yǎng)基抗生素液：染色液：第47頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二（一）水第48頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二（二）平衡鹽溶液維持滲透壓、調(diào)節(jié)PH值細胞生存能量、無機離子第49頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二成分：無機鹽葡萄糖用途：洗滌配制其

22、他溶液的基礎(chǔ)溶液可加指示劑BBS 作用：提供細胞生長的基本元素；維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)酸堿度；第50頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液 PBS： NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20g 加水至1000 ml第51頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二（三）消化液作用：貼附型細胞原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)過程中細胞和組織的分散；胰蛋白酶液：使細胞間蛋白質(zhì)水解， 細胞分散EDTA（二乙烯四乙酸二鈉）： 吸取Ca2，Mg2，使細胞分離膠原酶 原代培養(yǎng)分散組織細

23、胞聯(lián)用第52頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二胰蛋白酶消化液來源：豬或者牛的胰臟，白色粉末作用：水解細胞之間的蛋白質(zhì)濃度：0.25% 0.125%特點：不同細胞的要求不同終止：血清可以中止胰蛋白酶的繼續(xù)作用第53頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二EDTANa又稱Versen溶液化學(xué)鰲合劑對細胞具有一定的解離作用毒性小，價格低0.02%第54頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二膠原酶溶液來源：細菌作用：對膠原組織和細胞間質(zhì)有較強的消化作用。第55頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二細胞培養(yǎng)用容器及培養(yǎng)基C

24、ulture vessels and mediumfor animal cell culture二、培養(yǎng)基（液）第56頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二培養(yǎng)基（液）是維持體外細胞生存和生長的溶液天然培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基：氨基酸、維生素、糖類 無機離子、其它成分 完全培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基+血清無血清培養(yǎng)基： 第57頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二（一）天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基有生物性液體（血清）， 組織浸液（胚胎浸液），凝固劑（血漿）優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點： 來源受限。 成分復(fù)雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取 和實驗結(jié)果的分析。 易發(fā)生支原體污染

25、第58頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二 血清(serum)： 一般常用為小牛血清(包括胎牛血清)，人血清和其它動物血清。滅活：56度，30min消除補體活性。 球蛋白不高于2g/100ml外觀：透明淡黃色，無溶血，無沉淀。1、血清第59頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二第60頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二常用血清有胎牛血潔,新生牛血清,小牛血清,兔血清,馬血清等,其中以胎牛血清質(zhì)量最好.優(yōu)質(zhì)血清的標準:透明,淡黃色,無沉淀物,無細菌,支原體,病毒污染. 第61頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二

26、多種PR（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）多種金屬離子激素；促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。各種生長因子轉(zhuǎn)移蛋白不明成分第62頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二血清的使用與儲存 使用前的處理 56滅活30min 去除補體成分 儲存條件 滅活后分裝成小包裝（10mL、20mL、50mL），20 儲存；使用前4 融化，可用1個月。 使用濃度 一般為520，最常用的是10。第63頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二影響血清的各種因素 年齡：較老動物的血清對細胞生長有抑制作用 血型：AB型血清比A型和O型血清對細胞生長有利 血色素 膽紅質(zhì) 脂肪酸 血

27、清在培養(yǎng)液中的濃度并非越高越好第64頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二細胞培養(yǎng)中使用血清的缺點 使用血清有可能改變某種細胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)。 如：血清可以促進成纖維細胞的生長，同時會抑制表皮角質(zhì)細胞的生長。 血清中含有一些物質(zhì)對細胞會產(chǎn)生毒性作用。 如：多胺氧化酶每批血清之間都有差別，其成分不能保持一致。取材過程中有可能帶入支原體、病毒，對培養(yǎng)細胞產(chǎn)生影響。第65頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二關(guān)于血清的幾個問題 血清必須貯存于20 -70，若存放于4，請勿超過一個月。如果一次無法用完一瓶，可將4045 ml分裝于無菌50ml 離心管中，由于血

28、清結(jié)凍時體積會增加約10 %， 必須預(yù)留此膨脹體積之空間，否則易發(fā)生污染或容器凍裂之情形。 一般廠商提供之血清為無菌，不需再無菌過濾。若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物，則可將血清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾，勿直接過濾血清。第66頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二 瓶裝(500ml) 血清解凍步驟(逐步解凍法): -20或70至4冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝，一般以50 ml 無菌離心管可分裝4045 ml。在溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。勿直接由20直接至37解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀。第67頁，共90頁，2

29、022年，5月20日，16點12分，星期二血漿：1907年Harrison首次使用優(yōu)點：支持培養(yǎng)組織塊，供給細胞生長物質(zhì)。 缺點：易于液化。2、血漿第68頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二閱讀：P484、水解乳蛋白5、膠原回答：膠原在細胞培養(yǎng)中的用途？ 膠原的制備方法？ 膠原的使用方法？第69頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二（二）合成培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基：根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。 主要成分：氨基酸、維生素、碳水化合物、無 機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。 優(yōu)點： 標準化生產(chǎn)，組分和含量相對固定。 成本低 缺點： 缺少某些成

30、分，不能完全滿足體外細 胞生長需要。 第70頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二常用合成培養(yǎng)基MEM: 12種氨基酸 +谷氨酰胺 + 8種維生素廣泛適用已建成細胞系的培養(yǎng)minimum essential medium第71頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二DMEM: MEM改良 成份加倍葡萄糖(高糖1000mg/L或者低糖400mg/L) 低糖: 生長速度快,附著性稍差的腫瘤細胞 ; 高糖: 附著性差的細胞第72頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二RPMI-1640: 成份簡單, 正常細胞和腫瘤細胞,廣泛適用第73頁，共90

31、頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二干粉培養(yǎng)基商品培養(yǎng)液第74頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二完全培養(yǎng)基也叫血清培養(yǎng)基;分成細胞生長和細胞維持培養(yǎng)基細胞生長培養(yǎng)基: 血清含量高, 10-20%維持培養(yǎng)基:血清含量低, 2-5%第75頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二完全培養(yǎng)基配制舉例:基礎(chǔ)培養(yǎng)基 80一95血清 5一20碳酸氫鈉 2.0 g/L青霉素 50100IU/ml培養(yǎng)液鏈霉素 50100ug/ml培養(yǎng)液第76頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二配制:RPMI-1640培養(yǎng)粉 1袋碳酸氫鈉 2.0 g青、

32、鏈霉素 各100IU/ml 加三蒸水至1000ml, 過濾除菌,調(diào)節(jié)pH值至7.2 ,加血清（終濃度10）.第77頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二（三）無血清培養(yǎng)基第78頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二 血清中不僅存在促細胞生長因子，同對也存在細胞生長抑制因子或毒性因子，故在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞所反映的生物學(xué)特性是細胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。 在生長因子、蛋白質(zhì)工程、基因表達調(diào)控等研究領(lǐng)域，迫切需要用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞 第79頁，共90頁，2022年，5月20日，16點12分，星期二 1975年，Sato首次成功地用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)了垂體細胞株，近20多年來已報道了幾十種細胞系在無血清培養(yǎng)基中