時間分辨熒光免疫技術(shù)

1、時間分辨熒光免疫技術(shù)時間分辨熒光免疫技術(shù)第1頁問 題什么是時間分辨熒光免疫分析（TrFIA ）？ TrFIA標識物及特點。 為何叫“時間分辨”?TrFIA檢測原理各種免疫方法學(xué)比較 TrFIA 臨床應(yīng)用時間分辨熒光免疫技術(shù)第2頁時間分辨熒光免疫 （TrFIA）（Time-Resoled Fluoroimmunoassay）時間分辨熒光免疫技術(shù)第3頁定 義TrFIA分析法是用三價稀土離子及其螯合劑作為示蹤物，代替熒光物質(zhì)、同位素或酶，標識蛋白質(zhì)、多胎、激素、抗體、核酸探針或生物活性細胞，當反應(yīng)體系發(fā)生后，用TRF儀器測定最終產(chǎn)物中熒光強度。依據(jù)熒光強度或相對熒光強度比值，來判斷反應(yīng)體系被分析物濃

2、度，到達定量分析之目標。 時間分辨熒光免疫技術(shù)第4頁發(fā)展歷程1979年，芬蘭SOINI和HEMMIA 提出“時間分辨熒光免疫分析”理論1983年SOINI和KOJOLA 提出以鑭系元素標識為示蹤螯合物和時間分辨熒光測量相結(jié)合，建立一個新非放射性微量分析技術(shù) 現(xiàn)已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)研究和臨床超微量生化檢驗中一項最有發(fā)展前景分析伎倆。 時間分辨熒光免疫技術(shù)第5頁廠 家芬蘭WALLAC和加拿大一家企業(yè)，但加拿大使用激光，主要在科研WALLAC和新波企業(yè)使用疝燈，主要用于臨床 時間分辨熒光免疫技術(shù)第6頁標識物為含有獨特?zé)晒馓卣飨⊥两饘?鑭系元素鑭系元素共有15種，屬三價元素，應(yīng)用在時間分辨熒光免疫技術(shù)中有

3、四種：銪(Eu)、釤Sm)、鏑(Dy)、鋱(Te) Eu3 +應(yīng)用最為廣泛， Sm3+ 可作為第二種選擇以進行雙標識或多標識技術(shù) 不一樣三價稀土離子含有不一樣發(fā)射光譜和各自不一樣熒光壽命等特點，這么就適合進行雙標識和多標識，從而實現(xiàn)可同時檢測一個樣品中，兩種或兩種以上抗原或抗體，即一個試劑盒相當與兩個試劑盒或多個試劑盒，這就是咱們所說多標識技術(shù)。 時間分辨熒光免疫技術(shù)第7頁鑭系元素?zé)晒馓攸c：熒光壽命極長鑭系元素螯合物（60900 us) 普通熒光免疫中熒光團：1100ns樣本中蛋白質(zhì)熒光：110ns，易猝滅。Stokes位移大銪：發(fā)射光613nm、激發(fā)光340nm，熒光素Stokes位移近28

4、0nm熒光特異性強。（發(fā)射光譜帶很窄：615 5nm） 解離-增強技術(shù)可使其熒光性提升100萬倍時間分辨熒光免疫技術(shù)第8頁時間分辨生物制品（如蛋白質(zhì)）本身產(chǎn)生熒光波長位于400-600nm，所以用普通熒光素來檢測生物樣品時，自然本底熒光干擾太大。樣品中蛋白質(zhì)類本底熒光衰變時間約為1-10nsTrFIA技術(shù)中，因為鑭系稀土離子螯合物所產(chǎn)生熒光不但強度高，而且半壽期也長，介于10-1000us之間，比普通熒光標識物高5-6個數(shù)量級（1000ns=1us)。含有銪或釤螯合物熒光衰變時間分別為730000ns和50000 ns。所以利用延緩測量時間，待測樣品中短壽命自然熒光完全衰變后，再檢測稀土離子螯

5、合物熒光信號（見圖1）。消除了來自樣品、試劑及其它非特異熒光，從而到達降低自然本底熒光和消除樣品熒光干擾，大大提升了檢測靈敏讀。這既是咱們長提到時間分辨。 時間分辨熒光免疫技術(shù)第9頁經(jīng)過時間延遲，將特異性熒光與非特異性熒光分辨開來，使本底到達0利用鑭系元素?zé)晒馕锢硖卣?，熒光激發(fā)后在固定時間段檢測特異性熒光。而在此時間之前，非特異性熒光已完全衰減為0圖1時間分辨熒光免疫技術(shù)第10頁Stokes位移Stokes位移：是指激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間光譜波峰波長差。 比如TRF中銪激發(fā)光波長340nm,發(fā)射光波長613nm，二者之間波長差即Stokes位移為273nm（見圖2），所以激發(fā)光和發(fā)射光很輕易用

6、干涉濾光片分開。而普通熒光物質(zhì)激發(fā)光與發(fā)射光之間波長差即Stokes位移為28nm，那就極難排除激發(fā)光對發(fā)射光干擾，影響檢測結(jié)果。 時間分辨熒光免疫技術(shù)第11頁利用鑭系元素光譜特點，將發(fā)射熒光與激發(fā)熒光分辨開來，零本底又一保障發(fā)射光譜與激發(fā)光譜間存在巨大Stokes位移。能夠經(jīng)過干涉濾光片將發(fā)射光譜與激發(fā)光譜完全分離。圖2時間分辨熒光免疫技術(shù)第12頁稀土離子激發(fā)光、發(fā)射光和Stokes位移 稀土離子螯合物 激發(fā)光波長（nm） 發(fā)射光波長（nm） Stokes位移（nm） Eu-螯合物 340 613 273 Sm-螯合物 340 600 260 Tb-螯合物 295 490/543 195/2

7、48 Dy-螯合物 295 573 278 時間分辨熒光免疫技術(shù)第13頁解離增強技術(shù)解離增強技術(shù)是TRF技術(shù)中所特有指當免疫反應(yīng)完成后個別標識物結(jié)合到固相載體上，未結(jié)合標識物被洗掉。再加入低PH值（PH23）增強液，把Eu或Sm從免疫復(fù)合物中解離下來，與增強液中螯合物質(zhì)（-二酮體）結(jié)合形成新螯合物，使標識物產(chǎn)生熒光強度增強近百萬倍 時間分辨熒光免疫技術(shù)第14頁時間分辨熒光免疫原理用三價稀土離子及其螯合物作為示蹤物，代替熒光物質(zhì)、同位素、酶和化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，標識抗原、抗體、核酸探針等物質(zhì)；當免疫過程結(jié)束后，依據(jù)稀土離子螯合物熒光光譜物理特點 （特異性強、 Stokes位移大、 壽命長），并采取解離

8、-增強技術(shù)（ DELFIA）放大有效熒光；最終用時間分辨熒光分析儀，測定免疫反應(yīng)最終產(chǎn)物熒光強度。依據(jù)已知濃度所確定標準曲線，來判斷未知樣品濃度值，以到達定量分析目標。時間分辨熒光免疫技術(shù)第15頁時間分辨熒光免疫原理圖（Time-resolved Fluorescence Immunoassay）時間分辨熒光免疫技術(shù)第16頁乙肝“兩對半” TRFIA定量檢測原理示意圖時間分辨熒光免疫技術(shù)第17頁乙肝表面抗原免疫反應(yīng)圖 （時間分辨熒光法）時間分辨熒光免疫技術(shù)第18頁乙肝表面抗體免疫反應(yīng)圖 （時間分辨熒光法）時間分辨熒光免疫技術(shù)第19頁乙肝抗原免疫反應(yīng)圖 （時間分辨熒光法）時間分辨熒光免疫技術(shù)第2

9、0頁乙肝抗體免疫反應(yīng)圖（時間分辨熒光法）時間分辨熒光免疫技術(shù)第21頁乙肝關(guān)鍵抗體免疫反應(yīng)圖 （時間分辨熒光法）時間分辨熒光免疫技術(shù)第22頁時間分辨熒光免疫試劑種類甲狀腺功效檢測TSH，Ultra TSH，T3，T4，F(xiàn)T3，F(xiàn)T4，TBG，TG性激素類檢測FSH，LH，HCG，ProlactinE2，E3，Testo，Prog，SHBG腫瘤標識檢測AFP，CEA，PSA，hTG，-2 Micro，NSE，PAP，PSA（Free/Total），PSA EQM，CA-50，CA-125，CA-199遺傳科檢驗產(chǎn)前篩查： hAFP/ HCG ，PAPPA新生兒篩查：Neo-TSH，Neo-T4，N

10、eo-IRT，Neo-17a-OH Prog，PKU傳染病檢測HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb血液科檢測貧血檢驗：Ferritin，Vit B12，F(xiàn)olic acid科研工具單標識檢測，雙標識檢測，三標識檢測，四標識檢測時間分辨熒光免疫技術(shù)第23頁時間分辨熒光免疫分析與其它免疫學(xué)方法比較時間分辨熒光免疫技術(shù)第24頁標識免疫學(xué)發(fā)展歷程酶聯(lián)免疫（精度：10-9 mol/L ）放射免疫（精度：10-12mol/L ）化學(xué)發(fā)光 （精度：10-15mol/L ）電化學(xué)發(fā)光（精度：10-17mol/L ）時間分辨熒光（精度：10-18mol/L ）生物芯片 （未知） 酶免疫技術(shù)

11、 熒光抗體技術(shù) 三大標識技術(shù) 放射免疫分析時間分辨熒光免疫技術(shù)第25頁 待測物質(zhì)濃度與檢測伎倆 臨床化學(xué)分析pg/mLng/mLmg/mLmg/mLg/L免疫分析Therapeutic Drugs (藥品濃度)Thyroid Hormone (甲狀腺激素)Fertility Hormone (孕激素)Cancer Markers (腫瘤標識物)Infectious Disease (傳染病)Vitamins (維生素)Serum Proteins (血清蛋白)10-1210-910-610-310-0時間分辨熒光免疫技術(shù)第26頁各種免疫方法學(xué)比較時間分辨熒光免疫技術(shù)第27頁放射性免疫分析法（R

12、IA）-標識物： 125I應(yīng)用放免自60年代問世以來對臨床診療起了革命性貢獻，是一項較為成熟診療技術(shù)。夾心法、競爭法標識原理為以后檢測技術(shù)發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。缺點放射性（125I），對環(huán)境污染及對身體危害，已經(jīng)為重視環(huán)境保護國家逐步取消。（如整個歐洲僅尚存幾個放免試驗室）125I半衰期短而造成其試劑使用期短。標識物125I穩(wěn)定性差，造成試劑盒批間、批內(nèi)變異較大；標準曲線使用期短，必須每次定標，造成浪費。操作繁瑣，出匯報時間長。無法保留備用。時間分辨熒光免疫技術(shù)第28頁酶免疫分析法（ELISA ） -標識物：HRP(辣根過氧化物酶）應(yīng)用酶免最大優(yōu)勢在于防止了對環(huán)境和人體危害。試劑使用期較長。衍生技術(shù)

13、：熒光酶免疫分析增強化學(xué)發(fā)光酶免疫技術(shù)磁酶免分析曾經(jīng)一度被認為是取代放免檢測伎倆。缺點靈敏度、重復(fù)性不及放免，易造成漏檢和假陽性。因酶純度和反應(yīng)過程輕易受環(huán)境原因影響，造成穩(wěn)定性不好。時間分辨熒光免疫技術(shù)第29頁化學(xué)發(fā)光免疫分析法（CLIA） -標識物： 化學(xué)發(fā)光物質(zhì)（魯米諾）應(yīng) 用單個樣本檢測速度快，適合做急診。靈敏度較高。自動化程度高。儀器種類：拜耳 ACS180 系列雅培 AXSYM貝克曼 ACCESS德普 IMMULITE缺 點樣品不能重復(fù)檢測；出現(xiàn)故障則整批試劑及血樣報廢。本底較高，易受環(huán)境物質(zhì)干擾。儀器故障率較高。標準曲線穩(wěn)定性較差，需屢次定標。檢測精度不高，在超微量分析及早期診療

14、方面能力不足。非開放性試劑；試劑價格高。時間分辨熒光免疫技術(shù)第30頁電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECL） -標識物：三聯(lián)吡啶釕應(yīng)用80年代末期問世新型化學(xué)發(fā)光免疫分析方法?；A(chǔ)原理：依據(jù)三聯(lián)吡啶釕Ru(bpy)3和三丙胺在電場觸發(fā)下產(chǎn)生發(fā)光化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。本底較小、靈敏度較高、線性范圍較寬。缺點儀器檢測速度慢 （羅氏企業(yè)）ECL1010 60 測試/小時ECL 90 測試/小時非開放性試劑系統(tǒng)、不能做科研。試劑價格過高。時間分辨熒光免疫技術(shù)第31頁TRFIA在乙肝“兩對半”定量檢測應(yīng)用時間分辨熒光免疫技術(shù)第32頁一、提升了檢測靈敏度 時間分辨熒光法（TRFIA）檢測HBsAg靈敏度可到達0.2ng/ml

15、，而酶免法（ELISA）檢測HBsAg靈敏度是2ng/ml。 縮短了急性乙肝檢測“窗口期”二、動態(tài)觀察療效和病情檢測 疾病發(fā)生、發(fā)展、療效、預(yù)后是個動態(tài)改變過程，TRFIA定量檢測乙肝“兩對半”各項標志物濃度改變可對乙肝病程、治療、預(yù)后起到動態(tài)檢測作用，指導(dǎo)醫(yī)生治療。時間分辨熒光免疫技術(shù)第33頁（1）定量分析HBsAg和HBsAb濃度改變，能夠預(yù)見急性乙肝是否處于恢復(fù)期 如HBsAg濃度降低，HBsAb逐步升高，說明病情正向恢復(fù)期發(fā)展反之。反之，HBsAg濃度處于高水平或上升，而HBsAb處于低水平，則輕易發(fā)展為慢性乙肝或攜帶者。（2）定量分析HBeAg和HBeAb濃度改變，能夠反應(yīng)病情改變和

16、治療效果。 1、HBeAg向HBeAb轉(zhuǎn)換時期，即表現(xiàn)為HBeAg濃度下降和HBeAb濃度升高。 2、高濃度HBeAg提醒病毒處于高復(fù)制狀態(tài)，有較強傳染性。 3、高濃度HBeAb首先提醒病情好轉(zhuǎn)，但在有些時候（如肝功效指標很差）可能與肝壞死、肝硬化、肝癌相關(guān)。時間分辨熒光免疫技術(shù)第34頁（3）HBcAb濃度高低能夠反應(yīng)病毒感染狀態(tài) 1、乙肝急性感染常為高滴度HBcAb，恢復(fù)期濃度下降，慢性乙肝HBcAb呈連續(xù)高濃度。 2、低濃度HBcAb普通為恢復(fù)期或既往感染。（4）有利于對慢性肝炎活動性和非活動性判斷 非活動性慢性乙肝各項指標相對穩(wěn)定 活動性慢性乙肝往往呈進行性改變時間分辨熒光免疫技術(shù)第35

17、頁三、乙肝疫苗接種 HBsAb是一個真正意義保護性抗體，其定量檢測能夠?qū)ζ浜忻庖吡ψ龀稣_評價，對乙肝預(yù)防起到監(jiān)督作用。定 量 ELISA（定性）意 義010mIU/ml陰性（-）機體對乙肝病毒無免疫力，易感染乙肝病毒10100mIU/ml陽性（+）機體對乙肝病毒免疫力很弱，甚至不能預(yù)防HBV感染，仍有感染HBV危險100mIU/ml陽性（+）機體對乙肝病毒有較強免疫力，使機體有抵抗HBV入侵作用，較大程度上降低感染HBV風(fēng)險時間分辨熒光免疫技術(shù)第36頁 由此可見定量測定對乙肝疫苗免疫力評定和高危人群預(yù)防免疫含有主要意義，尤其是在少年兒童預(yù)防乙肝方面時間分辨熒光免疫技術(shù)第37頁四、HBV血清學(xué)標志物與HBV-DNA關(guān)系血清學(xué)標志物 反應(yīng)機體對病毒免疫狀態(tài)，病程，判斷病情， 不能完全反應(yīng)病毒在體內(nèi)復(fù)制情況HBV-DNA 1、真實反應(yīng)病毒在體內(nèi)復(fù)制水平，觀察藥品療效 2、個別“小三陽”及低水平病毒復(fù)制時出現(xiàn)陰性 3、不能反應(yīng)機體免疫狀態(tài)和病情時間分辨熒光免疫技術(shù)第38頁血清HBV-DNA熒光定量PCR測定能夠直接反應(yīng)病毒數(shù)量，病毒復(fù)制情況，含有很多臨床應(yīng)用價值，但不能完全反應(yīng)病毒復(fù)制靜息期肝細胞內(nèi)HBV病毒狀態(tài)HBV-DNA陰性并不完全代表體內(nèi)HBV已被去除，結(jié)合“兩對半”各項指標更能客觀反應(yīng)體內(nèi)HBV病毒狀態(tài)