外源性DNA殘留量檢測

1、外源性殘留量檢測目的描述外源性殘余量檢定（地高辛法）的操作過程和注意事項。目材料及設(shè)備2目試1劑試液無水乙醇。飽和酚。三氯甲烷。異戊醇。吐溫。十二烷基硫酸鈉（）溶液，用鹽酸調(diào)至目。2乙二胺四乙酸二鈉溶液（）。醋酸鈉溶液。0溶液：檸檬酸鈉調(diào)至目,用固體調(diào)目III,L緩沖液（：量取溶液（）溶液/）加滅菌水至。內(nèi)切酶（寶生物工程（大連）有限公司）內(nèi)切酶（寶生物工程（大連）有限公司）目材2料和用具細菌基因組提取試劑盒（天根生物）批號瓊脂糖凝膠回收試劑盒（天根生物）批號外源殘留量檢測試劑盒（）貨號：458和32119尼龍膜（微米）點樣器（）、移液器、頭、恒溫水浴鍋、超凈工作臺、冰盒、離心機、三維旋混儀、

2、電磁爐操作原理用隨機啟動法，將地高辛貳元標記的脫氧尿苷三磷酸摻入未標記，通過一個手臂將與載體半抗原地高辛貳元連接起來（）。與目的雜交后，雜交分子用酶聯(lián)免疫法檢測；應用抗體酶聯(lián)接物（抗地高辛甙元堿性磷酸酶復合物）和隨后用酶促顏色反應使一溴一一氯一一吲哚磷酸（I和氮藍四唑（）顯色。流程圖基因組探針標記純化探針_k探針效率確定預雜交一雜交過夜.操作過程探1針制備提.取1后的基因組用等體積的飽和酚溶液（飽和酚：三氯甲烷：異戊醇）混合均勻，離心（C）分鐘。輕輕吸取上層液體到另管，在上清液中加入1/1體0積乙酸鈉，稍微震蕩或輕彈混勻，然后加入倍體積（加入乙酸鈉后的體積）冰無水乙醇，混勻后置于C小時或C小時

3、。離心（C）分鐘，棄液體，加入冰乙醇離心（C）分鐘，棄去液體，室溫晾干。加入適量無菌水或緩沖液，C保存。純化后的基因組進行酶切后，進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收小片段。取M回收用滅菌雙蒸水加至微升，然后放入沸水浴中將變性，水浴分鐘后，立即放入冰水浴中，冰浴分鐘。冰浴后加入試劑盒中的試劑微升，輕輕搖晃混勻，C培養(yǎng)過夜。次日，將探針取出，向其管內(nèi)添加乙二胺四乙酸二鈉溶液（）微升，醋酸鈉溶液微升，無水乙醇微升。將管放于C環(huán)境中小時以上。取出探針，離心（C）分鐘，傾倒上清，用微升滅菌雙蒸水溶解探針，放于C環(huán)境中備用（不宜超過一周）。.供2試品，陽性，陰性及對照處理用純化后的基因組，稀釋梯度為/J、|J1

4、|J1M、J的陽性對照。陰性對照為稀釋液。將供試品、陽性對照、陰性對照置C水浴加熱分鐘，迅速冰浴冷卻分鐘,以轉(zhuǎn)分離心秒甩水。.點3膜及雜交用抽濾加樣器將M樣品全部點樣于的雜交膜上。取下雜交膜，點樣面向上，置紫外燈下照射分鐘。取無菌培平皿，加已預熱（C）雜交液，并將雜交膜全部浸泡于其中，置水浴孵育分鐘進行預雜交。預雜交完畢后，倒掉預雜交液加入新鮮預雜交液（C）及全部探針（探針置C水浴加熱分鐘，冰浴分鐘），然后置C水浴孵育過夜。4.洗4脫及顯色低嚴謹性洗脫：取無菌培養(yǎng)平皿，加（含）將雜交膜全部浸泡其中，室溫下置水平脫色搖床，洗2次，每次分鐘。高嚴謹性洗脫：取無菌培養(yǎng)平皿，加C預熱將雜交液全部浸泡其

5、中，置8搖動，洗2次，每次分鐘。平衡：取無菌平皿，加（含吐溫0將雜交膜全部浸泡其中，室溫下置水平脫色搖床震蕩。封閉：取一次性無菌培養(yǎng)平皿，加稀釋過的封閉液，將雜交膜全部浸泡其中，室溫下置水平脫色搖床震蕩分鐘?？贵w孵育：取一次性無菌培養(yǎng)平皿，加稀釋過的封閉液，同時加入試劑盒中的4#試劑2微升，將雜交膜全部浸泡其中，室溫下置水平脫色搖床，30分鐘。洗脫：取一次性無菌培養(yǎng)平皿，加（吐溫0將雜交膜全部浸泡其中，室溫下置水平脫色搖床，分鐘，2次。平衡：取一次性無菌培養(yǎng)平皿，加，將雜交膜全部浸泡其中，室溫下置水平脫色搖床，5分鐘。顯色：取一次性無菌培養(yǎng)平皿，加（含|J#，將雜交膜全部浸泡其中，室溫下避光靜置小時以上至顯色完畢。終止反應：將雜交膜置無菌水中5分鐘。濕膜掃描、風干并封膜。結(jié)果判定陽性對照應顯色，其顏色深