蛋白質工程及應用

1、第三章 蛋白質工程及其在食品工業(yè)中應用第1頁概述 蛋白質是對生命至關主要一類生物大分子物質，各種生命功效、生命現(xiàn)象、生命活動都和蛋白質相關。在生命有機體催化、運動、結構、識別和調整等許多方面，起著關鍵作用。第2頁酶.幾乎全都是蛋白質。肌肉收縮、精子移動、細胞分裂過程中染色體移動.高等生物有序生長和分化過程?？贵w蛋白能識別和結合特異性外源物質，使人體具備抵抗各種細菌、真菌和病毒能力。由神經細胞膜蛋白組成離子通道，負責神經沖動形成和傳導。血紅蛋白含有結合和釋放氧能力，是血液中氧、二氧化碳和氫離子攜帶者。另外，人體毛發(fā)和指甲屬于角蛋白，而血栓是由血纖蛋白單體聚合而成。第3頁蛋白質生物學功效1.催化功

2、效：酶2.調整功效：激素3.結構功效：皮、毛、骨、牙、細胞骨架4.運輸功效：血紅蛋白5.免疫功效：免疫球蛋白6.運動功效：鞭毛、肌肉蛋白7.儲備功效：酪蛋白8.生物膜功效：及神經傳導等第4頁 蛋白質是生命表達者，離開了蛋白質，生命將不復存在?？墒牵矬w內存在天然蛋白質，有往往不盡人意，需要進行改造。因為蛋白質是由許多氨基酸按一定次序連接而成，每一個蛋白質有自己獨特氨基酸次序，所以改變其中關鍵氨基酸就能改變蛋白質性質。而氨基酸是由三聯(lián)體密碼決定，只要改變組成遺傳密碼一個或兩個堿基就能到達改造蛋白質目標。蛋白質工程一個主要路徑就是依據(jù)人們需要，對負責編碼某種蛋白質基因重新進行設計，使合成蛋白質變

3、得更符合人類需要。第5頁蛋白質工程就是以蛋白質結構與功效為基礎，利用基因工程伎倆，按照人類本身需要，定向地改造天然蛋白質，甚至創(chuàng)造新、自然界本不存在、含有優(yōu)良特征蛋白質分子。蛋白質工程概念1983年，美國生物學家額爾默首先提出了“蛋白質工程”概念。蛋白質工程實踐依據(jù)DNA指導合成蛋白質，所以，人們能夠依據(jù)需要對負責編碼某種蛋白質基因進行重新設計，使合成出來蛋白質結構變得符合人們要求。第6頁詳細地說，蛋白質工程就是經過對蛋白質已知結構和功效了解，借助計算機輔助設計，利用基因定點誘變等技術，特異性地對蛋白質結構基因進行改造，借以改進蛋白質物理和化學性質（熱穩(wěn)定性、酶專一性）， 或利用化學和物理伎倆

4、，對目標基因按預期設計進行修飾和改造，合成新蛋白質。并由此深入研究蛋白質結構與功效關系。蛋白質工程概念蛋白質工程蛋白質工程就是利用蛋白質結構功效和分子遺傳學知識，從改變或合成基因入手，定向地改造天然蛋白質或設計制造新蛋白質第7頁三個步驟：1、取得目標蛋白質晶體，并利用X射線技術經過晶體衍射儀搜集衍射數(shù)據(jù)，然后對晶體進行測量、分析，確定蛋白質空間結構。2、借助計算機對蛋白質進行飾變，經過建立數(shù)據(jù)庫和人工智能等路徑確定蛋白質結構和功效關系確定需要修飾位點。蛋白質工程目標和研究過程目標：依據(jù)人們需要改造天然蛋白質或設計創(chuàng)造自然界原來沒有全新蛋白質第8頁三個步驟：3、利用定點突變技術等一系列基因操作技

5、術伎倆來改變編碼蛋白質基因，從而實現(xiàn)對蛋白質改變。對已經存在蛋白質“下手”，從結構測定入手。創(chuàng)造全新蛋白質，要依據(jù)已經有蛋白質結構和功效信息資料進行分子設計-基因表示-對表示產物結構和功效進行檢測、分析。必經之路：（飾變、分析、檢測、修改）*N蛋白質工程目標和研究過程第9頁 蛋白質工程是在深入了解目標蛋白質“結構-功效 ”關系基礎上，進行嚴格分子設計，定向改造一個預期新特征蛋白質。普通兩種情況：對天然蛋白質進行改造。（已經有蛋白質）完全重建一個自然界原來沒有蛋白質。（全新）對天然蛋白質操作有：少數(shù)幾個AA殘疾進行替換（小改）分子剪裁（中改）局部重建（大改）第10頁 重建一個自然界原來沒有蛋白質

6、： 從頭設計一個全新蛋白質 當前，蛋白質工程主要進行是中改、小改。 “大改”和“從頭設計”，要求必須全方面掌握蛋白質一級結構決定高級結構規(guī)律，掌握高級結構與功效相關性。 現(xiàn)存蛋白質數(shù)據(jù)庫還滿足不了對蛋白質空間結構研究 第11頁實例1：玉米中賴氨酸含量比較低 假如對賴氨酸合成過程中兩個關鍵酶進行改造,能夠使玉米葉片和種子中游離賴氨酸分別提升5倍和2倍。 原因：賴氨酸合成過程中兩個關鍵酶天冬氨酸激酶和二氫吡啶二羧酸合成酶活性，受細胞內賴氨酸濃度影響。當賴氨酸濃度到達一定量時，就會抑制這兩種酶活性。第12頁 人類蛋白質組計劃是繼人類基因組計劃之后，生命科學乃至自然科學領域一項重大科學命題。年，國際人

7、類蛋白質組組織宣告成立。之后，該組織正式提出開啟了兩項重大國際合作行動：一項是由中國科學家牽頭執(zhí)行“人類肝臟蛋白質組計劃”；另一項是以美國科學家牽頭執(zhí)行“人類血漿蛋白質組計劃”，由此拉開了人類蛋白質組計劃帷幕。第13頁“人類肝臟蛋白質組計劃”是國際上第一個人類組織器官蛋白質組計劃，由我國賀福初院士牽頭，這是中國科學家第一次領銜重大國際科研協(xié)作計劃，總部設在北京，當前有16個國家和地域80多個試驗室報名參加。它科學目標是揭示并確認肝臟蛋白質，為重大肝病預防、診療、治療和新藥研發(fā)突破提供主要科學基礎。人類蛋白質組計劃深入研究將是對蛋白質工程有力推進和理論支持。 第14頁思索：對天然蛋白質進行改造，

8、你認為應該直接對蛋白質分子進行操作，還是經過對基因操作來實現(xiàn)？應該從對基因操作來實現(xiàn)對天然蛋白質改造，主要原因以下：（1）任何一個天然蛋白質都是由基因編碼，改造了基因即對蛋白質進行了改造，而且改造過蛋白質能夠遺傳下去。假如對蛋白質直接改造，即使改造成功，被改造過蛋白質分子還是無法遺傳。（2）對基因進行改造比對蛋白質直接改造要輕易操作，難度要小得多。 第15頁二、蛋白質工程基本原理1、蛋白質工程目標 依據(jù)人們對蛋白質功效特定需求，對蛋白質結構進行分子設計。2、天然蛋白質合成過程DNA（基因）轉錄mRNA翻譯蛋白質基因表示（轉錄和翻譯）形成氨基酸序列多肽鏈形成含有高級結構蛋白質行使生物功效第16頁

9、中心法則 （central dogma）生物遺傳信息從 DNA傳遞給mRNA過程稱為轉錄。依據(jù)mRNA鏈上遺傳信息合成蛋白質過程，被稱為翻譯和表示。1958年Crick將生物遺傳信息這種傳遞方式稱為中心法則。第17頁蛋白質翻譯轉錄逆轉錄復制復制DNARNA中心法則：遺傳信息由DNA mRNA 蛋白質流動路徑。補充和完善之處：A：RNA作為遺傳物質能自我復制，并作為mRNA指導PRO合成。 B：RNA能以逆轉錄方式將遺傳信息傳遞給DNA分子。 第18頁 復制：是親代雙鏈DNA按堿基配對標準，準確形成兩個相同核苷酸序列子代DNA分子過程。兩條DNA鏈都可作為復制模板。 轉錄：是以一條DNA鏈為模板

10、，將DNA鏈上儲存遺傳信息按堿基配對標準準確轉換成互補mRNA過程。 翻譯：是以mRNA為模板，將mRNA上遺傳信息轉換成蛋白質氨基酸序列過程。 中心法則：遺傳信息由DNA mRNA 蛋白質流動路徑。 第19頁第20頁第21頁、蛋白質工程基本路徑預期蛋白質功效設計預期蛋白質結構推測應有氨基酸序列找到相對應脫氧核苷酸序列（基因）第22頁討論：某多肽鏈一段氨基酸序列是：丙氨酸色氨酸賴氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸（1）怎樣得出決定這一段肽鏈脫氧核苷酸序列？請把對應堿基序列寫出來。首先應該依據(jù)三聯(lián)密碼子推出mRNA序列，每種氨基酸都有對應三聯(lián)密碼子，只要查一下遺傳密碼子表，就能夠將上述氨基酸序列編碼序列查出來

11、。再依據(jù)堿基互補配對規(guī)律推出脫氧核苷酸序列。不過因為上述氨基酸序列中有幾個氨基酸是由多個三聯(lián)密碼子編碼，所以其堿基排列組合起來就比較復雜，最少能夠排列出16種。第23頁密碼子：UCAUGAUUAmRNA密碼子密碼子密碼子mRNA上決定一個氨基酸三個相鄰堿基密碼子總數(shù)：43=64種(其中61種密碼子是對應氨基酸 和起始；另有3個不對應氨基酸，只對應終止)1種密碼子只對應1種氨基酸；1種氨基酸能夠對應各種密碼子。 密碼子在生物界基本是通用。這也是生物彼此間存在親緣關系證據(jù)之一 。第24頁第25頁GCU（或C或A或G）UGGAAA（或G）AUGUUU（或C） mRNA序列 脫氧核苷酸序列GCT (或

12、C或A或G) TGGAAA (或G)ATGTTT (或C)CGA (或G或T或C) ACCTTT（或C)TACAAA (或G)（2）確定目標基因堿基序列后，怎樣才能合成或改造目標基因（DNA）？確定目標基因堿基序列后，就能夠依據(jù)人類需要改造它，經過人工合成方法或從基因庫中獲取。第26頁4、蛋白質工程與基因工程關系 蛋白質工程是在基因工程基礎上，延伸出來第二代基因工程，是包含多學科綜合科技工程領域。 基因工程是經過基因操作把外源基因轉入適當生物體內，并在其中進行表示，它產品是該基因編碼天然存在蛋白質。第27頁 蛋白質工程就是依據(jù)蛋白質精細結構與功效之間關系，利用基因工程伎倆，按照人類本身需要，定

13、向地改造天然蛋白質，甚至創(chuàng)造新、自然界本不存在、含有優(yōu)良特征蛋白質分子。 蛋白質工程自誕生之日起，就與基因工程密不可分。蛋白質工程依據(jù)對分子預先設計方案，經過對天然蛋白質基因進行改造，來實現(xiàn)對它所編碼蛋白質進行改造。所以，它產品已不再是天然蛋白質，而是經過改造、含有了人類所需要優(yōu)點蛋白質。第28頁5 蛋白質工程與酶工程關系 絕大多數(shù)酶都是蛋白質，酶工程與蛋白質工程有什么區(qū)分？ 酶工程就是指將酶所含有生物催化作用，借助工程學伎倆，應用于生產、生活、醫(yī)療診療和環(huán)境保護等方面一門科學技術。概括地說，酶工程是由酶制劑生產和應用兩方面組成。酶工程應用主要集中于食品工業(yè)、輕工業(yè)以及醫(yī)藥工業(yè)中。 第29頁

14、通常所說酶工程是用工程菌生產酶制劑，而沒有經過由酶功效來設計酶分子結構，然后由酶分子結構來確定對應基因堿基序列等步驟。所以，酶工程重點在于對已存酶合理充分利用，而蛋白質工程重點則在于對已存在蛋白質分子改造。當然，伴隨蛋白質工程發(fā)展，其結果也會應用到酶工程中，使酶工程成為蛋白質工程一部分。 第30頁 蛋白質分子生物功效，與蛋白質分子結構密不可分。決定蛋白質這種特殊生物功效關鍵原因是它分子構象 。蛋白質結構 第31頁基本組成單位-氨基酸第32頁組成生物體蛋白質20種氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸丙氨酸精氨酸天冬酰氨天冬氨酸半胱氨酸谷氨酰胺谷氨酸甘氨酸組氨酸異亮氨酸亮氨酸賴氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸脯氨酸

15、絲氨酸蘇氨酸色氨酸酪氨酸纈氨酸第33頁組成生物體蛋白質20種氨基酸氨基酸英文氨基酸英文賴組脯蘇絲色天冬精LysHisProThrSerTryAspArg LysineHistidineProlineThreonineSerine TryptophanAspartic acid Arginine谷纈半胱丙亮酪甲硫(蛋)Glu Val CysAla LeuTyrMetGlutamic acidValineCysteineAlanineLeucineTyrosineMethionine甘苯丙GlyPheGlycinePhenylalanine谷酰天冬酰異亮Gln AsnIle GlutamineAs

16、paragineIsoleucine第34頁 肽（肽鍵與肽) 肽鍵就是由氨基酸-羧基與相鄰氨基酸-氨基脫水縮合而形成化學鍵第35頁肽（肽鍵與肽)肽:氨基酸經過肽鍵連結起來化合物二肽:兩個氨基酸形成肽三肽:三個氨基酸形成肽多肽:許多氨基酸形成肽蛋白質:大多為100個以上氨基酸組成多肽第36頁氨基酸殘基:多肽鏈中不完全氨基酸。氨基酸因為形成肽鍵而失去了一分子水，所以表現(xiàn)出其分子不完整。氨基末端：多肽鏈中含有自由-氨基一端。簡稱N-端羧基末端：多肽鏈中含有自由-羧基一端。 簡稱C-端第37頁第38頁蛋白質一級結構 蛋白質一級結構是指氨基酸按一定次序經過肽鍵相連而成多肽鏈，也是蛋白質最基本結構。每一個

17、蛋白質分子都有自己特有氨基酸組成和排列次序即一級結構，由這種氨基酸排列次序決定它特定空間結構，也就是蛋白質一級結構決定了蛋白質二級、三級等高級結構。第39頁蛋白質分子一級結構牛胰島素一級結構第40頁（1）氫鍵：氫原子與負電性強原子（如氧、氮等）間形成。對蛋白質分子三維構象維護很主要。（2）靜電引力：正負帶電基團之間吸引力。對蛋白質分子三維構象穩(wěn)定貢獻不是很大，也稱為離子鍵或鹽鍵（3）范德華力：原子團相互靠近時誘導所致。它改變多樣，對維持蛋白質活性中心構象影響很大維持蛋白質空間結構化學鍵第41頁（4）疏水相互作用：是非極性基團為了避開水相而群集在一起作用力。疏水作用是維持蛋白質高級結構主要原因（

18、5）二硫鍵：作用很強，對穩(wěn)定蛋白質構象起主要作用氫鍵、離子鍵、疏水作用和范德華力等次級鍵是非共價鍵肽鍵、二硫鍵、酯鍵等被稱之為共價鍵第42頁蛋白質二級結構 二級結構是指多肽鏈借助于氫鍵沿一維方向排列成含有周期性結構構象，是多肽鏈局部空間結構（構象）主要形式：-螺旋、-折疊、 -轉角、無規(guī)卷曲等第43頁第44頁-轉角第45頁蛋白質分子二級結構 螺旋折疊片轉角自由回轉第46頁第47頁三級結構三級結構是指整條多肽鏈在二級結構基礎上深入盤曲而成特定格式三級結構。四級結構很多蛋白質分子是由兩個或兩個以上獨立、含有三級結構多肽鏈組成。這些多肽鏈之間只是經過疏水作用等次級鍵結合成為有序排列特定空間結構，形成

19、了四級結構。在四級結構蛋白質分子中，每個含有三級結構多肽鏈單位稱為亞基，亞基多無生物學活性，含有完整四級結構蛋白質分子才有生物活性。第48頁血紅蛋白中四亞基兩兩相同，分別稱為1 、2、1、2第49頁第50頁第51頁 蛋白質結構和功效關系 1、蛋白質一級結構與功效關系（1）相同結構含有相同功效。 一級結構相同多肽或蛋白質，其空間結構及功效也相同。 催產素、抗利尿激素都是由下丘腦神經細胞合成九肽類激素,前者含有催產及使乳腺(Phe作用.如圖為催產素結構簡式,若將異亮氨酸(He)和亮氨酸(Leu)分別替換為苯丙氨酸和精氨酸則為抗利尿劑。催產素兼有抗利尿劑激素作用，抗利尿劑激素也兼有催產素作用。第52

20、頁 蛋白質結構和功效關系 1、蛋白質一級結構與功效關系（2）不一樣結構含有不一樣功效 盡管催產素、抗利尿激素有相同功效，但它們結構并不完全相同，所以生物學活性也有很大差異 催產素催產功效強于抗利尿劑激素。 抗利尿劑激素利尿作用遠強于催產素。 所以，一級結構發(fā)生改變，其功效必定改變。第53頁 蛋白質結構和功效關系 2、蛋白質空間結構與功效關系 蛋白質空間結構是其生物活性基礎，空間結構發(fā)生改變，其功效也必定隨之改變。 核糖核酸酶，不破壞它一級結構，只是破壞其氫鍵，二硫鍵還原為巰基，該酶也會失去活性。 原因：二級、三級結構發(fā)生改變 恢復結構，酶活性也可得到恢復。第54頁 食品蛋白改性 人類迫切需求具

21、有功能特征和營養(yǎng)特征蛋白質 一方面，開發(fā)蛋白質資源（優(yōu)質蛋白）。 其次，對現(xiàn)有蛋白質進行改造-改性蛋白質。 蛋白質改性是指經過物理、化學和生物 (酶)方法改變蛋白質結構，從而改善它們功能特征，使之達到食品所需要品質特征，以擴大蛋白質在不一樣類型食品體系中應用范圍。 實質：利用生化因素或物理因素切斷蛋白質分子中主鏈或是對蛋白質分子側鏈基團進行修飾，從 而引發(fā)蛋白質空間結構和理化性質改變，獲得具有功能特征和營養(yǎng)特征較好蛋白質。第55頁蛋白質改造方法 在基因水平上對蛋白質進行改造，按改造規(guī)模和程度能夠分為：小改：個別氨基酸改變和一整段氨基酸序列刪除、置換或插入中改：蛋白質分子剪裁，如結構域拼接大改：

22、局部重建從頭設計合成新型蛋白質 第56頁一、小改造經過基因突變方法，以到達改變氨基酸進而改造蛋白質目標。當前，主要采取基因突變方法：基因定點突變盒式替換技術第57頁基因定點突變依據(jù)三聯(lián)體密碼，編碼DNA（目標基因）確實定位點，改變其組成核苷酸次序或種類，使基因發(fā)生定向變異，使其控制合成氨基酸種類、次序發(fā)生改變，合成出含有預期氨基酸序列修飾蛋白質。這種經過造成一個或幾個堿基定點突變，以到達修飾蛋白質分子結構目標技術，稱為基因定點突變技術。第58頁1985年Wells提出一個基因修飾技術，可經過一次修飾，在一個位點上產生20種不一樣氨基酸突變體，從而能夠對蛋白質分子中一些氨基酸進行“飽和性”分析。

23、利用定位突變在擬改造氨基酸密碼兩側造成兩個原載體和基因上沒有內切酶切點，用該內切酶消化基因，再用合成發(fā)生不一樣改變雙鏈DNA片段替換被消化部分。這么一次處理就能夠得到各種突變型基因。 盒式突變技術 第59頁二、蛋白質分子高級改造（結構域拼接） 研究證實，在二級結構和三級結構之間還有一個結構層次，即結構域結構域由螺旋、折疊等二級結構單位按一定拓撲學規(guī)則組成三維結構實體。結構域是蛋白質分子中一個基本結構單位，結構域拼接是經過基因操作把位于兩種不一樣蛋白質上幾個結構域連接在一起，形成融合蛋白，它兼有原來兩種蛋白性質。 第60頁三、全新蛋白質設計與構建 上述兩種蛋白質改造方法，通常是從一個已知次序、結

24、構和功效蛋白質出發(fā)，依據(jù)一定目標和設計方案，使用多肽合成或者基因工程方法，改變它結構，以期到達改變其性質目標。假如要從頭設計和構建一個自然界不存在蛋白質，則需要借助多功效模板和蛋白質二級結構元件組裝成某種含有特定功效人工蛋白質分子。 第61頁蛋白質工程在食品工業(yè)中應用 蛋白質工程自問世以來，短短十幾年時間，已取得了引人矚目標進展，在醫(yī)學和工業(yè)用酶方面也取得了良好應用前景。 提升蛋白質穩(wěn)定性包含以下幾個方面：延長酶半衰期；提升酶熱穩(wěn)定性；延長藥用蛋白保留期；抵抗因為主要氨基酸氧化引發(fā)活性喪失。 第62頁一、消除酶被抑制特征 1985年，美國埃斯特爾借助寡核苷酸介導定位突變技術，用19種其它氨基酸

25、分別替換枯草芽孢桿菌蛋白酶分子第222位殘基上易氧化甲硫氨酸，取得了一系列活性差異很大突變酶。發(fā)覺除了用半胱氨酸代替甲硫氨酸突變體以外，其它突變體酶活性都降低了。 第63頁二、引入二硫鍵，改進蛋白質熱穩(wěn)定性 溶菌酶分子：由一條肽鏈組成，并在空間上折疊形成二個相對獨立結構域，酶活性中心位于二個結構域之間。該酶分子在第97位和54位殘基上是兩個未形成二硫鍵半胱氨酸因為二硫鍵是一個穩(wěn)定蛋白質分子空間結構主要共價化學鍵，有如建筑所用鋼筋一樣，因而能將分子中不一樣部位牢靠地聯(lián)結在一起。所以，提升酶熱穩(wěn)定性最慣用方法是在分子中增加一對或數(shù)對二硫鍵。 第64頁在高溫下天冬酰胺和谷氨酰胺輕易脫氨形整天冬氨酸和谷氨酸，而造成蛋白質分子構象改變，使蛋白質失去活性。對釀酒酵母磷酸丙糖異構酶進行誘變改造。這種酶有兩個相同亞基，每個亞基含有2個天冬酰胺，因為它們都位于亞基之間界面上，可能對酶熱穩(wěn)定性起決定性作用。經過寡核苷酸介導定向誘變技術，將第14位和第78位上2個天冬酰胺分別轉變成Thr(蘇氨酸)和Ile(異亮氨酸)殘基，大幅度提升突變酶熱穩(wěn)定性。 三、轉化氨基酸殘基，改進蛋白質熱穩(wěn)定性 第65頁四、改變酶最適pH值