蛋白定量與純度分析

1、生物大分子活性物質(zhì)定量與純度分析 1 蛋白質(zhì)定量測定 2粘多糖定量 3核酸含量測定 比色法測定 菲林試劑法 孚爾根染色法 紫外法測定 蒽酮法 定磷法 氮元素法測定 旋光法 二苯胺法 重量法測定 地衣酚法 紫外吸收第1頁 2 蛋白質(zhì)純度分析 光譜法分析 層析法分析 電泳法分析 N末端法分析 生物活性法分析.第2頁第一節(jié) 蛋白質(zhì)定量分析1概況1.1蛋白含量 蛋白質(zhì)定量分析通常是指測定蛋白質(zhì)溶液中蛋白質(zhì)量或蛋白質(zhì)粉劑中蛋白質(zhì)量。在進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測定時(shí)，首先依據(jù)蛋白質(zhì)物理化學(xué)性質(zhì)特征和試驗(yàn)室現(xiàn)有條件來確定測定方法。蛋白質(zhì)含量測定方法有很多，大致能夠分為四類， 重量法 定氮法 比色法 氨基酸推算法等第3

2、頁 采取測定方法不一樣得到測定結(jié)果有差異。每-種方法有它獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，不過也有它不足。 在上述幾個(gè)測定方法中測定數(shù)據(jù)最準(zhǔn)確，最可靠屬于定氮法和氨基酸推算法。這兩種測定方法都是經(jīng)過測定分子中氮元素或分子結(jié)構(gòu)來確定蛋白質(zhì)含量。所以，測得數(shù)據(jù)相對比較準(zhǔn)確，不過它試驗(yàn)步驟比較多，操作比較繁瑣。其它測定方法相對簡單一些，是試驗(yàn)室慣用技術(shù)，靈敏度相對低一些。 測定蛋白質(zhì)含量通常要采取兩種以上方法，要依據(jù)蛋白質(zhì)一些特征選擇不一樣方法進(jìn)行測定。將各種方法測得結(jié)果綜合考慮。第4頁1.2 蛋白質(zhì)濃度測定 蛋白質(zhì)定量分析方法很多，采取定量分析方法不一樣其測定基本原理也同；得到結(jié)果有一定差異。每一個(gè)測定方法有它優(yōu)點(diǎn)，也有

3、它不足之處。在實(shí)際工作中要依據(jù)蛋白質(zhì)特征采取對應(yīng)方法。在很多分析方法中使用最多是比色法。下面分別簡單介紹各種定量分析基本原理和方法。第5頁1.3測定基本條件 待測溶液在一定波長照射下會產(chǎn)生光吸收，在一定濃度范圍內(nèi)光吸收值大小與溶液濃度成正比。所以只要測出待測溶液光吸收值和基準(zhǔn)溶液光吸收值。便可知道待測溶液濃度，推算出蛋白質(zhì)含量。比色分析要考慮以下幾個(gè)條件：(1)溶液 在蛋白質(zhì)定量分析中，大部分都足采取比色法，而比色法溶液可分兩大類，即一類是有色溶液，另一類是無色溶液。第6頁1. a.有色溶液 這是依據(jù)蛋白質(zhì)與一些化中試劑反應(yīng)生成一類有色溶液，該溶液能與單色光含有互補(bǔ)作用，生成互補(bǔ)色。利用光互補(bǔ)

4、原理進(jìn)行比色測定。有色溶液包含以下二種 本色溶液：蛋白質(zhì)分子中含有變色基團(tuán)或顯色基團(tuán)，在溶液中會產(chǎn)生顏色，如血紅蛋白，血藍(lán)蛋白，鐵蛋白，細(xì)胞色素C等。 顯色溶液：蛋白質(zhì)與一些化學(xué)試劑反應(yīng)產(chǎn)生顏色，如雙縮脲，福林酚，茚三酮等試劑。 染色溶液：蛋白質(zhì)與一些燃料結(jié)合，被染上顏色，如考馬斯亮藍(lán)，氨基黑等染料。第7頁b.無色溶液 依據(jù)蛋白質(zhì)分子中含有芳香族氨基酸，在280nm處有最大吸收峰，肽鍵在215nm處有最大吸收峰，利用最大吸收峰特征進(jìn)行比色測定。 第8頁(2)單色光單色光互補(bǔ)性：有色溶液與對應(yīng)單色光生成新互補(bǔ)色第9頁(4)朗伯-比耳定律(Lambert-Beer) 朗伯-比耳定律(Lambert

5、-Beer)，也稱之為光吸收定律。比色測定要完全遵照朗伯-比耳定律。是指在一定濃度范圍，溶液濃度與光吸收值成正比。用公式表示為： 光吸收值(A) =lg(1/T)= KCL T為透射比，K為常數(shù)，C為溶液濃度，L為光程（吸收層厚度） 朗伯-比耳定律同時(shí)反應(yīng)了溶液厚度L和濃度C對光吸收關(guān)系，測定光吸收值隨光波長、溶液濃度和溶液性質(zhì)不一樣而改變。第10頁2測定方法：2.1比色測定2.1.1雙縮脲法：(1)原理 蛋白質(zhì)分子中含有肽鍵(CO-NH-)，所以，含有雙縮脲反應(yīng)特征。在堿性溶液中蛋白質(zhì)與Cu2+形成紫紅色絡(luò)合物，絡(luò)合物顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正。所以它是蛋白質(zhì)和肽類物質(zhì)特異性測定方法。但此法測

6、定靈敏度不高，普通測試濃度在1-10mg之間，尤其適合于肽類物質(zhì)測定。第11頁(2)方法： 將蛋白溶液和雙縮脲試劑顯色反應(yīng)，然后在540nm處比色測定，以牛血清清蛋白或者以被測蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(3)影響原因： 干擾雙縮脲測定原因包含：在性質(zhì)上類似于氨基酸化合物，如有機(jī)胺類肽緩沖劑，如Tris緩沖劑，可使Cu2+還原，出現(xiàn)紅色沉淀物，干擾測定。第12頁2.1.2福林-酚(Lowry)法：(1)原理： 福林-酚法測定蛋白質(zhì)是在雙縮脲法基礎(chǔ)上發(fā)展起來。是在堿性溶液中蛋白質(zhì)與Cu2+形成紫紅色絡(luò)合物，然后該絡(luò)合物再與還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑反應(yīng)產(chǎn)生深藍(lán)色溶液。此法適合于蛋白類定量分析，靈

7、敏度較高，測試范圍在25-250g之間，但專一性不強(qiáng)。(2)方法： 將蛋白溶液利福林-酚試劑生成顏色反應(yīng)，然后在640nm處比色測定，以牛血清清蛋白或者以被測蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(3)影響原因： 干擾此測定原因包含：在性質(zhì)上類似于氨基酸或肽緩沖劑。如呈色反應(yīng)，Cu2+輕易被還原，出現(xiàn)紅色沉淀物，干擾測定。 第13頁 2.1.3考馬斯亮藍(lán)法：(1)原理： 考馬斯亮藍(lán)G250是一個(gè)甲基取代二苯基甲烷，分子中含有多個(gè)磺酸基染料，在465nm處有最大光吸收值?？捡R斯亮藍(lán)G250磺酸基能與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物，引發(fā)該染料最大光吸收值位置發(fā)生位移，移至595nm處出現(xiàn)最大光吸收值。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)-

8、染料復(fù)合物含有很強(qiáng)光吸收，可大大提升測定蛋白質(zhì)靈敏度，對蛋白類定量分析，最低測試量在1g以上。第14頁(2)方法： 將蛋白溶液和考馬斯亮藍(lán)G-250試劑反應(yīng)生成深藍(lán)色，然后在595nm處比色測定。以牛血清清蛋白或者以被測蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(3)影響原因： 一些去污劑如Triton-100，SDS等對測定都有一定干擾。 第15頁2.2紫外光吸收法：2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線法(1)原理： 蛋白質(zhì)分子中含有芳香族氨基酸(苯丙氨酸，酪氨酸，組氨酸等)，在280nm處有最大吸收峰。蛋白質(zhì)在最大吸收峰max波優(yōu)點(diǎn)吸光值強(qiáng)弱與蛋白濃度成正比。這種方法適合于蛋白質(zhì)分子中含有較多芳香族氨基酸蛋白質(zhì)進(jìn)行定

9、量分析，對一些含芳香族氨基酸較少蛋白質(zhì)，測定靈敏度較低，如膠原蛋白。第16頁(2)方法： 在實(shí)際工作中紫外光吸收法最慣用一個(gè)蛋白質(zhì)方法，它是以配制一系列不一樣濃度蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液以不含被測蛋白溶液為參比溶液，在一樣條件下測定標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度，將測得數(shù)據(jù)繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后在一樣條件下測定未知樣品吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得未知樣品濃度。此法測量比較準(zhǔn)確，但使用標(biāo)準(zhǔn)曲線隔一段時(shí)間進(jìn)行校正。第17頁2.2.2消光系數(shù)法：(1)原理： 蛋白質(zhì)分子中含有芳香族氨基酸，在280nm處特定吸光值。蛋白質(zhì)分子中所含氨基酸數(shù)量不一樣，它們在280nm處吸光值強(qiáng)弱就有差異。所以，每一個(gè)純單一蛋白質(zhì)在280nm處有一個(gè)特

10、定消光系數(shù)。假如已知某個(gè)蛋白質(zhì)消光系數(shù)，只要在280nm處測定出該蛋白吸光值就能夠計(jì)算出其對應(yīng)含量。計(jì)算公式以下：第18頁 測得吸光值 N 1000 測得吸光值 N 10蛋白質(zhì)濃度(mg/m1) = = 消光系數(shù) 100 消光系數(shù) 式中N為稀釋倍數(shù)，10是常數(shù)，是指在標(biāo)定消光系數(shù)時(shí)，蛋白溶液濃度為100ml溶液中含有1000mg蛋白質(zhì)，在計(jì)算公式中約分得到常數(shù)10。 第19頁比如：胰蛋白酶消光系數(shù)是13.5。將胰蛋白酶溶液稀釋100倍，測得光吸收值是0.27，經(jīng)過上述公式計(jì)算其濃度。 0.2710010 蛋白質(zhì)濃度(mg/m1) = = 20 13.5第20頁(2)方法： 將待測蛋白稀釋成一定

11、濃度在280nm處測定吸光值(測得吸光值處落在0.1-1.0范圍內(nèi))。(3)影響原因： 在蛋白質(zhì)混合溶液中或在280nm有干擾物質(zhì)存在時(shí)，對該溶液測定都有較大影響。不含有普遍性。測試靈敏度所不一樣。 第21頁2.2.3 F因子測定法(1)原理： 因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基苯環(huán)含有共軛雙鍵，所以，蛋白質(zhì)含有吸收紫外光性質(zhì)。最大吸收峰波長在280nm處。而在波長 260nm處光吸收較弱。這兩種波長吸光值強(qiáng)弱與濃度成正比。經(jīng)過測定蛋白質(zhì)溶液在280nm和260nm處光吸收值，求出A280/A260比值，從表中查出F因子，經(jīng)過計(jì)算公式能夠計(jì)算出待測蛋白質(zhì)含量。第22頁 蛋白質(zhì)濃度(mg/m1)

12、 = F(l/d) A280 N F：F因子 d：比色杯厚度 N：稀釋倍數(shù)(2)方法 取一定濃度蛋白溶液，分別測定280nm和260nm處光吸收值。求出A280/A260比值，從F因子表中查出F因子。紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量A280A260比值與F因子關(guān)系見表1第23頁 表1紫外吸收法測定蛋白質(zhì)含量F因子表1A280/A269F因子A280/A269F因子1.751.1160.8460.6561.631.0810.8220.6321.521.0540.8040.6071.401.0230.7840.5851.360.9940.7670.5651.300.9700.7520.5451.250.9

13、440.7300.5081.160.8990.7050.4781.090.8520.6710.4221.030.8140.6440.3770.9790.7760.6150.3220.9390.7430.5950.2780.8740.682第24頁2.3定氮法4.3.1凱氏定氮法：(1)原理： 因?yàn)槊恳粋€(gè)蛋白質(zhì)都有其恒定含氮量(約為14-16)，只要測出其氮元素含量就能夠推算出其蛋白質(zhì)量。所以，能夠經(jīng)過測定有機(jī)化合物或蛋白質(zhì)分子中氮元素含量來推算蛋白質(zhì)含量。計(jì)算公式以下： 蛋白質(zhì)(mg/ml) = 測得含氮量 14 6.25 凱氏定氮法是將含氮有機(jī)化合物或蛋白質(zhì)與濃硫酸共熱硝化，有機(jī)氮轉(zhuǎn)變成氨，

14、氨又與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，硫酸銨在堿性條件下被分解，放出氨氣，用水蒸汽蒸餾將氨氣蒸出，硼酸吸收，然后用標(biāo)準(zhǔn)堿溶液進(jìn)行滴定。第25頁 (2)試驗(yàn)方法： 蛋白質(zhì)消化氨硫酸銨氨硼酸銨滴定含氮量 蛋白質(zhì)含量。 凱氏定氮法是一個(gè)經(jīng)典方法，靈敏度高，使用儀器比較簡單，但操作比較繁瑣，影響原因較多，日前使用不多。(3) 影響原因: 空氣中氨氣, 標(biāo)準(zhǔn)堿濃度第26頁凱氏定氮裝置1.安全管 2.導(dǎo)管 3.汽水分離管 4.樣品入口 5.塞子6.冷凝管7.吸收瓶8.隔熱液套9.反應(yīng)管10.蒸汽發(fā)生瓶第27頁2.3.2原子吸收光譜法(1)原理： 基本理是經(jīng)過原子燈發(fā)出被測元素特征譜線在經(jīng)過原子化器時(shí)，被待測元素基態(tài)原

15、子所吸收，使原子燈發(fā)出被測元素特征譜線強(qiáng)弱發(fā)生改變，經(jīng)過檢測特征譜線改變來測定原子吸收光譜，利用這些光信號改變強(qiáng)弱測定化合物中各種元素含量。利用這一性質(zhì)，經(jīng)過原子吸收光譜儀測定蛋白質(zhì)中氮元素便可計(jì)算出蛋白質(zhì)量。(2)方法： 經(jīng)過原子吸收光譜儀直接測定蛋白質(zhì)氮元素，或者通消化后測定消化液中氮元素。這種經(jīng)典方法測試靈敏度高，操作比較簡單，但需要大型原子光譜儀，普通試驗(yàn)室不具備。第28頁2.4重量法：(1)原理： 在溶液中同時(shí)存在揮發(fā)性溶劑和非揮發(fā)溶質(zhì)，結(jié)冰溶劑在高真空度條件下直接升華，溶質(zhì)被干燥，取得蛋白質(zhì)干粉，然后進(jìn)行重量分析。(2)方法： 準(zhǔn)確吸收一定蛋白質(zhì)溶液凍干，恒重后，稱重，即得蛋白質(zhì)重

16、量。這種方法適合用于比較寶貴樣品，重量法要求天平精度比較高。 第29頁3定量分析應(yīng)注意問題 要使分析方法有較高靈敏度和準(zhǔn)確性，選擇最正確測定條件：是十分主要。它包含儀器測量，試樣反應(yīng)和參比溶液等條件。2.1光學(xué)儀器最小測量誤差： 任何分光光度計(jì)都有一定測量誤差，這是因?yàn)楣鈱W(xué)系統(tǒng)穩(wěn)定性差異所造成，試驗(yàn)條件瞬間改變，造成讀數(shù)波動，對測定結(jié)果準(zhǔn)確性有一定影響，尤其是試樣濃度過高或過低均會引發(fā)誤差。所以，測定時(shí)適當(dāng)吸光度測量范圍是很主要。依據(jù)Lamber-Beer定律，能夠推出測定結(jié)果相對誤差。第30頁 若要使測定結(jié)果相對誤差最小，經(jīng)過Lamber-Beer定律方程解，從理論上得出相對誤差最小值是：

17、吸光度(A) = 0.434 透光率(T) = 36.8。 也就是說吸光度讀數(shù)應(yīng)控制在光譜儀上最靈敏范圍內(nèi)， (A) = 0.434、(T) = 36.8。是儀器誤差最小。第31頁 濃度測量相對誤差與溶液透射率(T)關(guān)系如圖所表示：圖1 第32頁3.2比色測定呈色反應(yīng) 在定量分析中，有許多物質(zhì)測定是經(jīng)過化學(xué)反應(yīng)生成顏色后再進(jìn)行比色測定，普通要注意以下問題(1)顏色反應(yīng)后生成物必須在選定測定波長有較大光吸收(2)顏色反應(yīng)后生成物理化性質(zhì)必須穩(wěn)定，顯色條件輕易控制，重復(fù)性好(3)對照性好，反應(yīng)物和生成物之間最大吸收波長之差，差值普通要在60nm以上。第33頁 3.3參比溶液選擇 依據(jù)樣液性質(zhì)不一樣

18、，可選擇不一樣參比溶液。(1) 溶劑參比：當(dāng)樣液組分比較簡單，與其它組分共存對所測定波長無任何吸收劑為參比。(2) 溶液參比：參加反應(yīng)試劑在所測定波長部分干擾，可按照顯色反應(yīng)條件，選取不加被測試樣品溶液為參比。(3)純水參比：試樣與共存組分在測定波長都有較大吸收，可選取水為空白，先測出試樣和對照光吸收值，然后用試樣吸收值減去對照光吸收值即可。第34頁. 4定量分析小結(jié) 方法機(jī)理關(guān)鍵技術(shù)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)比色法光互補(bǔ)色呈色反應(yīng)應(yīng)用廣泛影響原因多紫外法最大吸收峰蛋白質(zhì)純度操作簡單基準(zhǔn)物有局限定氮法轉(zhuǎn)化氮元素蛋白質(zhì)消化結(jié)果準(zhǔn)確步驟繁瑣重量法冰點(diǎn)升華樣品恒重結(jié)果準(zhǔn)確專一性差第35頁第二節(jié) 蛋白質(zhì)純度1概念1.1

19、蛋白質(zhì)純度 蛋白質(zhì)純度分析，是從蛋白質(zhì)樣品中確定目標(biāo)蛋白和雜質(zhì)分析方法，也是蛋白質(zhì)分析中一類主要方法。任何一個(gè)蛋白質(zhì)制品從理論上說都含有二類組分，即蛋白質(zhì)和雜質(zhì)。 蛋白質(zhì)：是樣品中主要成份，是分析目標(biāo)蛋白 雜質(zhì)：是殘留非目標(biāo)蛋白和殘留小分子，無機(jī)鹽等 所以，蛋白質(zhì)純度分析方法大致分為兩類。第36頁(1)目標(biāo)蛋白與雜蛋白分析(2)目標(biāo)蛋白與非蛋白分析 從廣義上說蛋白質(zhì)純度普通是指樣品中是否含有雜蛋白，不包含無機(jī)鹽和有機(jī)小分子分析判定。因?yàn)橛行┑鞍踪|(zhì)要在一定無機(jī)鹽和有機(jī)小分子保護(hù)下才比較穩(wěn)定。所以，一些產(chǎn)品中要添加一些小分子化合物。不過假如要進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測定，則要包含雜蛋白，無機(jī)鹽和有機(jī)小分子測

20、定。第37頁1.2蛋白質(zhì)純度表示方法 一個(gè)天然蛋白或一個(gè)重組蛋白質(zhì)，產(chǎn)品純度是一個(gè)主要指標(biāo)。純度表示方法主要依據(jù)實(shí)際用途區(qū)分。如化學(xué)試劑純度一樣，主要有化學(xué)純，分析純，優(yōu)級純等。蛋白質(zhì)純度通常有兩種方式表示。(1)工業(yè)用用百分含量表示：如：95、99、99.9(2)試驗(yàn)室用以用途表示： 有試驗(yàn)室級純(1ab) 電泳純(electrophoresis) 色譜純(choromatography)。第38頁2分析方法：2.1光譜法：2.1.1光譜掃描法： 一個(gè)純度蛋白質(zhì)溶液在一定波長范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描就會得到一個(gè)特征吸收光譜，能夠依據(jù)掃描光譜吸收曲線形狀，吸收峰位置，數(shù)量和大小判斷該蛋白純度。 用紫

21、外吸收光譜測定樣品純度，既方便又靈敏，測得結(jié)果可靠，是慣用純度分析方法。 光譜分析特點(diǎn)：主要是判別目標(biāo)蛋白質(zhì)和非蛋白類雜質(zhì)。第39頁 2.1.2光吸收比值法： 一個(gè)純物質(zhì)在紫外光區(qū)有其最大光吸收峰，如核酸最大吸收峰在260nm，蛋白質(zhì)最大吸收峰在280nm。同一溶液在這兩種波場下測得光吸收值是不一樣。利用在280nm和260nm處測得光吸收值之比，即可得到蛋白質(zhì)純度。如純核酸標(biāo)準(zhǔn)光吸收比為A280/A260 = 0.5、純蛋白標(biāo)準(zhǔn)光吸收比為A280/A260 = 1.8。 特點(diǎn)：僅限于蛋白質(zhì)溶液中含有核酸或核酸溶液中含有蛋白質(zhì)純度測定。 含有核酸蛋白質(zhì)溶液，可分別測定其A280和A260，由此

22、吸收差值，用下面經(jīng)驗(yàn)公式，即可算出蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)濃度=1.45A2800.74A260 (mg/ml)此經(jīng)驗(yàn)公式是經(jīng)過一系列已知不一樣濃度百分比蛋白質(zhì)（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）混合液所測定數(shù)據(jù)來建立第40頁 2.2層析法：2.2.1原理：一個(gè)純蛋白質(zhì)在穩(wěn)定層析條件下，得到保留值只有一個(gè)，假如得到層析峰多于一個(gè)就能夠視為不純。所以依據(jù)層析峰數(shù)量判斷物質(zhì)純度。層析法判定蛋白質(zhì)純度方法有：(1)保留值法 在一定層析條件下各種蛋白質(zhì)組分在層析柱內(nèi)保留值是一定，經(jīng)過測定蛋白質(zhì)層析保留值(保留時(shí)間，保留體積)就能確定蛋白質(zhì)組分，從而能夠判斷蛋白質(zhì)純度。如：排阻層析依據(jù)蛋白質(zhì)不一樣分子量可得到不

23、一樣保留體積，若流速恒定條件下，其保留時(shí)間也是一定。圖2 第41頁第42頁 (2)基準(zhǔn)物標(biāo)定法： 已知物內(nèi)標(biāo)法，在被判定物樣品中加入己知基準(zhǔn)物，稱內(nèi)標(biāo)物。經(jīng)過層析分離，從得到層析峰增高或峰位置來判斷。圖3第43頁 第44頁 2.2.2層析模式 層析分析判定法方法很多，但依據(jù)層析分離機(jī)理利方法來分類，大致可分為以下幾類。依據(jù)蛋白質(zhì)質(zhì)量和分子形狀層析分離模式依據(jù)蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)多少和分子極性差異層析分離模式依據(jù)蛋白質(zhì)帶電荷多少和分子吸附基團(tuán)差異層析分離模式。慣用分離模式有： 排阻層析 疏水層析 吸附層析 高效液相第45頁(4)幾個(gè)色譜方法比較方 法機(jī) 理關(guān)鍵技術(shù)優(yōu) 點(diǎn)缺 點(diǎn)排阻層析分子量分離層析介質(zhì)

24、應(yīng)用廣泛分析時(shí)間長疏水層析極性分離緩沖溶液分離度好鹽濃度較高吸附層析電荷分離介質(zhì)性質(zhì)通用性好條件難控制高效液相極性分離溶劑系統(tǒng)靈敏度高高純有機(jī)溶劑第46頁2.3電泳法：2.3.1原理： 一個(gè)純蛋白質(zhì)在一定電泳條件下得到電泳圖譜只有一個(gè)條帶，如聚丙烯酰胺電泳(PAGE)。所以依據(jù)蛋白質(zhì)電泳條帶數(shù)量判斷蛋白質(zhì)純度。2.3.2方法： 電泳判定蛋白質(zhì)純度方法有: 凈電荷電泳(PAGE) SDS-電泳(SDS) 等電聚焦電泳(IEF) 雙向電泳(2D) 毛細(xì)管電泳(CE)第47頁 2.3.3幾個(gè)電泳方法比較方 法機(jī) 理關(guān)鍵技術(shù)優(yōu) 點(diǎn)缺 點(diǎn)PAGE電荷分離蛋白帶電性整分子分離不知分子量SDS質(zhì)量分離蛋白質(zhì)解聚單鏈分子分離不是整分子IEF等電點(diǎn)分離兩性電解質(zhì)等電點(diǎn)不知分子量2D電荷+質(zhì)量第一向分離等電點(diǎn)+分子量操作