免疫膠體金法檢測(cè)MPB64抗原在結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷中的價(jià)值

1、免疫膠體金法檢測(cè)MPB64抗原在結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷中的價(jià)值【摘要】目的通過與傳統(tǒng)的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷方法直接涂片抗酸染色、改進(jìn)羅氏培養(yǎng)、PR的比擬，評(píng)價(jià)免疫膠體金法檢測(cè)結(jié)核桿菌PB64抗原在結(jié)核病快速診斷中的應(yīng)用價(jià)值。方法搜集158例確診為結(jié)核病患者的臨床標(biāo)本，分別用直接涂片抗酸染色、改進(jìn)羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)、PR、免疫膠體金法檢測(cè)米氏7H9培養(yǎng)產(chǎn)物中的PB64抗原檢測(cè)結(jié)核分支桿菌，并對(duì)結(jié)果進(jìn)展比擬分析。結(jié)果涂片陽(yáng)性率為10.76%，改進(jìn)羅氏培養(yǎng)陽(yáng)性率為20.89%，PR檢測(cè)陽(yáng)性率為56.33%，免疫膠體金法檢測(cè)陽(yáng)性率為41.14。結(jié)論免疫膠體金法檢測(cè)米氏7H9液體培養(yǎng)產(chǎn)物中的PB64抗原可以作為一種較

2、為敏感、快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)結(jié)核分支桿菌感染的方法，有助于結(jié)核病臨床快速診斷。【關(guān)鍵詞】PB64抗原；結(jié)核?。豢焖僭\斷結(jié)核病的控制關(guān)鍵在于早發(fā)現(xiàn)和早治療，而結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢查是臨床上明確結(jié)核病診斷和化療方案的重要根據(jù)，也是考核和評(píng)價(jià)療效的可靠標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)核病確實(shí)診和治療方案很大程度上依賴于結(jié)核分支桿菌的實(shí)驗(yàn)室檢查，快速、準(zhǔn)確的結(jié)核分支桿菌的檢測(cè)對(duì)于結(jié)核病的快速診斷，乃至對(duì)結(jié)核病的防治，都有著極其重要的意義。近年來(lái)可以作為結(jié)核桿菌存在直接證據(jù)的結(jié)核特異性外分泌抗原如Ag85、ESAT6、FP10、PB64等的檢測(cè)越來(lái)越受到關(guān)注，其中PB64是較為令人注目的一種1-4。本研究搜集了158例確診為結(jié)核病的臨床標(biāo)

3、本，分別用直接涂片抗酸染色、改進(jìn)羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)、DNAPR檢測(cè)、免疫膠體金法檢測(cè)米氏7H9培養(yǎng)產(chǎn)物中的PB64抗原以下簡(jiǎn)稱PB64抗原檢測(cè)檢測(cè)結(jié)核分支桿菌，并對(duì)結(jié)果進(jìn)展比擬分析，以評(píng)價(jià)PB64抗原檢測(cè)在結(jié)核病快速診斷中的應(yīng)用價(jià)值。1資料和方法1.1對(duì)象選取2022年1月2022年12月根據(jù)?中華人民共和國(guó)傳染病防治法?規(guī)定管理的傳染病診斷標(biāo)準(zhǔn)試行中的結(jié)核病診斷標(biāo)準(zhǔn)，確診為結(jié)核病的本院及淮安市第四人民醫(yī)院住院和門診患者158例，搜集標(biāo)本158份。其中男性91例，女性67例，年齡1378歲，平均年齡32.3歲。肺結(jié)核124例，結(jié)核性胸膜炎30例，結(jié)核性關(guān)節(jié)炎3例，結(jié)核性腦膜炎1例。搜集到的標(biāo)本分別

4、為痰124份，胸腔積液30份，關(guān)節(jié)穿刺物3份，腦脊液1份。另外，于同一時(shí)期搜集50例臨床已排除結(jié)核病的呼吸道感染患者的痰液標(biāo)本50份作為對(duì)照組。1.2材料抗酸染液和改進(jìn)酸性羅氏培養(yǎng)基等材料為本院實(shí)驗(yàn)室參照全國(guó)結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程自配，7H9液體培養(yǎng)基及結(jié)核菌膠體金檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)，7H9液體培養(yǎng)基批號(hào)為071215、080524、090122，結(jié)核菌膠體金檢測(cè)試劑盒批號(hào)為070501、081104、090108。DNAPR檢測(cè)采用的設(shè)備為羅氏lightyler2.0，試劑為中山大學(xué)達(dá)安基因股份消費(fèi)的結(jié)核分支桿菌核酸擴(kuò)增PR熒光檢測(cè)試劑，批號(hào)為202205、202206、20

5、2212、202202。不能及時(shí)檢測(cè)的標(biāo)本，將留置容器嚴(yán)格密封后，置于4冰箱保存，并在其上應(yīng)注明患者姓名、編號(hào)及日期。1.3方法1.3.1標(biāo)本搜集和前處理痰標(biāo)本肺結(jié)核患者在治療前搜集痰標(biāo)本，每個(gè)病例按規(guī)定搜集痰液，痰液總量不少于20l。除局部用于直接涂片染色外，其他痰標(biāo)本作如下前處理：在容器中參加適量4%NaH，用無(wú)菌玻棒持續(xù)攪拌，痰液充分消化后，汲取0.2l消化后痰液另放用于改進(jìn)羅氏培養(yǎng)；其余的消化后痰液進(jìn)展中和處理，標(biāo)本移至50l離心管量多者分多管，3000g離心15in，傾去上清，再參加2030lpH值為6.8的PBS中和,再以3000g離心，傾倒去上清，上述中和、離心必要

6、時(shí)可重復(fù)1次或?qū)掖蜳BS中和所得沉淀物測(cè)試pH值為7.07.2后用于米氏7H9培養(yǎng)基培養(yǎng)。胸腔積液、腦脊液、關(guān)節(jié)腔積液以無(wú)菌容器搜集臨床穿刺所得的積液，除局部用于直接涂片染色檢測(cè)外，經(jīng)3000g離心15in后，傾倒去上清得到沉淀，參加2l生理鹽水混勻備用。1.3.2直接涂片抗酸染色詳細(xì)操作步驟和判讀標(biāo)準(zhǔn)均參照?全國(guó)結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程?。1.3.3改進(jìn)羅氏培養(yǎng)和米氏7H9培養(yǎng)改進(jìn)羅氏培養(yǎng)汲取0.1l標(biāo)本均勻地接種于改進(jìn)酸性羅氏培養(yǎng)基斜面，放入37孵箱中進(jìn)展培養(yǎng)，觀察并記錄斜面長(zhǎng)菌情況。米氏7H9培養(yǎng)汲取1l左右標(biāo)本接種于含有5l米氏7H9液體培養(yǎng)基的培

7、養(yǎng)管中，放入37孵箱中進(jìn)展培養(yǎng)。所有培養(yǎng)管自第2天開場(chǎng)，每天觀察1次，并取其培養(yǎng)液進(jìn)展PB64抗原檢測(cè)，陽(yáng)性者培養(yǎng)管另存?zhèn)溆茫幮哉呃^續(xù)培養(yǎng)觀察，直至第30天檢測(cè)結(jié)果仍為陰性者報(bào)告為陰性。假設(shè)培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中很快13天出現(xiàn)混濁，或有大量快速增加的沉淀物，應(yīng)考慮培養(yǎng)基污染。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.1.3.4DNAPR檢測(cè)按廠家提供的試劑和儀器操作說明書操作并報(bào)告結(jié)果。1.3.5PB64抗原檢測(cè)經(jīng)7H9液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后715天，將培養(yǎng)液混勻，汲取150l培養(yǎng)液參加PB64結(jié)核菌膠體金檢測(cè)卡的檢測(cè)孔中，15in后觀察結(jié)果。結(jié)果斷定:檢測(cè)區(qū)和控制區(qū)均出現(xiàn)紫紅色條帶為陽(yáng)性，在控制區(qū)出現(xiàn)紫紅色條帶、檢測(cè)區(qū)未

8、出現(xiàn)為陰性結(jié)果?？刂茀^(qū)未出現(xiàn)任何條帶需重新檢測(cè)。2結(jié)果2.14種檢測(cè)方法陽(yáng)性率比擬158份標(biāo)本4種方法檢測(cè)陽(yáng)性率及特異性比擬見表1。表14種方法檢測(cè)結(jié)核桿菌陽(yáng)性率比擬略2.2肺結(jié)核和各肺外結(jié)核標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果比擬見表2。表2肺結(jié)核和肺外結(jié)核標(biāo)本檢測(cè)陽(yáng)性率比擬略3例關(guān)節(jié)穿刺物標(biāo)本中，2例為改進(jìn)羅氏培養(yǎng)和PB64抗原檢測(cè)2種方法檢測(cè)同為陽(yáng)性，1例為改進(jìn)羅氏培養(yǎng)、DNAPR、PB64抗原檢測(cè)3種方法檢測(cè)同為陽(yáng)性，而僅有的1例腦脊液標(biāo)本4種方法檢測(cè)均為陽(yáng)性。2.3PB64抗原檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果報(bào)告時(shí)間見表3。表365例PB64抗原檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果報(bào)告時(shí)間略2.4痰標(biāo)本PB64抗原檢測(cè)與涂片抗酸染色和改進(jìn)羅氏培養(yǎng)陽(yáng)性

9、率的比擬見表4。其中，改進(jìn)羅氏培養(yǎng)陽(yáng)性而PB64抗原檢測(cè)為陰性的4例標(biāo)本菌株后經(jīng)對(duì)硝基苯甲酸PNB生長(zhǎng)試驗(yàn)鑒別，鑒定為非結(jié)核分支桿菌。表4124例痰標(biāo)本PB64抗原檢測(cè)與涂片抗酸染色和改進(jìn)羅氏培養(yǎng)的比擬略3討論P(yáng)B64也稱PT64蛋白是結(jié)核分支桿菌在生長(zhǎng)繁殖中分泌的分子量為24kD的一種有特殊作用的外分泌蛋白，可導(dǎo)致強(qiáng)烈的遲發(fā)型超敏反響。PB64蛋白主要存在于結(jié)核分支桿菌復(fù)合菌群，.flavesens為弱陽(yáng)性，而非結(jié)核分支桿菌極少出現(xiàn)陽(yáng)性，因此有很強(qiáng)的特異性5-6。張嶸等7曾報(bào)道用免疫色譜法抗-PB64單克隆抗體檢測(cè)和快速診斷結(jié)核分支桿菌結(jié)核菌群，能特異性地鑒別結(jié)核和非結(jié)核分支桿菌。Hille

10、ann等8用apiliaTB產(chǎn)品檢測(cè)PB64抗原，在172例結(jié)核桿菌陽(yáng)性的臨床標(biāo)本的檢測(cè)中，陽(yáng)性檢出率為92%，特異性到達(dá)100%。本實(shí)驗(yàn)中改進(jìn)羅氏培養(yǎng)陽(yáng)性而PB64抗原檢測(cè)為陰性的4例標(biāo)本菌株后經(jīng)PNB生長(zhǎng)試驗(yàn)鑒定為非結(jié)核分支桿菌，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持他們的研究結(jié)果。本次研究結(jié)果顯示，4種結(jié)核桿菌實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法中，結(jié)核桿菌DNAPR檢測(cè)最敏感、快速，但此法在陰性對(duì)照組中也有3例檢出陽(yáng)性，可能為假陽(yáng)性;但也不能排除3份標(biāo)本存在微量結(jié)核分支桿菌，由于PR檢測(cè)靈敏度很高，因此仍能被檢出的可能性。不管屬于哪種情況，其陽(yáng)性結(jié)果對(duì)臨床診斷有一定的誘導(dǎo)作用。而傳統(tǒng)的直接涂片抗酸染色鏡檢陽(yáng)性檢出率10.76%明

11、顯比其他3種方法低，改進(jìn)羅氏培養(yǎng)的檢出率20.89%雖然比涂片鏡檢有所進(jìn)步，但明顯低于PB64抗原檢測(cè)的41.14%，且耗時(shí)更長(zhǎng)。相對(duì)于涂片和改進(jìn)羅氏培養(yǎng)，PB64抗原檢測(cè)在報(bào)告時(shí)間、陽(yáng)性檢出率等方面均表達(dá)出較大的優(yōu)勢(shì)。但是從實(shí)驗(yàn)可操作性方面來(lái)講，每天都要汲取150l用于檢測(cè)很可能會(huì)影響后面的培養(yǎng)效能，增加污染時(shí)機(jī)，另外每天消耗一張檢測(cè)卡也會(huì)大大地增加本錢，不過PB64檢測(cè)陽(yáng)性的出現(xiàn)時(shí)間絕大多數(shù)集中在培養(yǎng)614天時(shí)，因此假如此法用于臨床檢測(cè)，建議可在培養(yǎng)7天開場(chǎng)作PB64抗原檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性可直接報(bào)告結(jié)核分支桿菌檢測(cè)陽(yáng)性，檢測(cè)結(jié)果為陰性者，待培養(yǎng)至第15天再作PB64抗原檢測(cè)，假如此時(shí)檢測(cè)結(jié)

12、果仍為陰性，根本上可以報(bào)告結(jié)核分支桿菌檢測(cè)陰性，臨床高度疑心結(jié)核病的標(biāo)本，可繼續(xù)培養(yǎng)至30天再作PB64抗原檢測(cè)。這樣可以進(jìn)步PB64抗原檢測(cè)的可操作性，并大大降低本錢。綜上所述，免疫膠體金法檢測(cè)米氏7H9培養(yǎng)產(chǎn)物中的PB64相對(duì)具備了快速、經(jīng)濟(jì)、操作方便、無(wú)須大型儀器投入等多種優(yōu)點(diǎn)，在基層醫(yī)院結(jié)核病診斷中有較大的應(yīng)用價(jià)值。【參考文獻(xiàn)】1NakauraR,EinkL,VelnteA,etal.DetetinfativetuberulsisbyanPB-64transderalpath:afieldstudyJ.SandJInfetDis，2001,33(6):405-407.2TasakaH,

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