學案熒光分析法

1、學案熒光分析法熒光分析法（Fluorometry)概 述熒光定量分析方法熒光分析技術與應用基本原理小 結11.1 概述水溶性熒光黃無輻射躍遷放出熱能或動能物質基態(tài)光照射激發(fā)態(tài)光致發(fā)光發(fā)射熒光和磷光物質基態(tài)吸收特定光熒光分析法：基于對化合物的熒光測量建立起來的分析方法熒光測量包括：熒光譜線位置及熒光強度續(xù)前熒光可見紫外相同點分子光譜分子光譜不同點本質發(fā)射光譜吸收光譜靈敏度10-810-10g/ml10-510-7g/ml選擇性高一般熒光分析法與可見紫外吸收光譜比較激發(fā)光源熒光分析法紫外可見光分子熒光法（Molecular Fluorometry)X射線X射線熒光法（X-ray Fluoromet

2、ry)原子特征譜線原子熒光法（Atomic Fluorometry)熒光分析法分類：根據(jù)光源不同進行分類返回11.2 基本原理 11.2.1 分子熒光光譜的產(chǎn)生11.2.2 激發(fā)光譜與發(fā)射光譜11.2.3 分子結構與熒光的關系11.2.4 影響熒光強度的外部因素11.2.1 分子熒光光譜的產(chǎn)生一、分子能級與電子能級的多重性 單重態(tài)：singlet state 三重態(tài)：triplet state分子的能級包括：電子能級（10ev）、振動能級(0.1ev) 及轉動能級(0.001ev) 電子能級的多重性M:M=2S+1；S為總自旋量子數(shù)續(xù)前A B C單重態(tài)和三重態(tài)電子分布能 量 * * * A：基

3、態(tài)單重態(tài) B：激發(fā)單重態(tài) C：激發(fā)三重態(tài)激發(fā)三重態(tài)T激發(fā)單重態(tài)S*基態(tài)單重態(tài)S0躍遷類型的比較續(xù)前躍遷類型基態(tài)激發(fā)單重態(tài)S*基態(tài)激發(fā)三重態(tài)T*所需能量大小自旋方向不變改變躍遷幾率接近于1106（光學禁阻）二、熒光的產(chǎn)生續(xù)前處于激發(fā)態(tài)的分子返回到基態(tài)共有以下幾種途徑：輻射躍遷熒光磷光回基態(tài)途徑內(nèi)部能量轉換體系間跨越振動弛豫外部能量轉換無輻射躍遷1 2 3 6 4 51、振動弛豫（vibrational relexation）續(xù)前過程：從電子激發(fā)態(tài)的某一振動能級以非輻射躍遷的方式， 回到同一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級的過程為振動馳豫特點：發(fā)生在同一個電子能級內(nèi)不同振動能級間的躍遷；時 間約10-12

4、秒?；蚍祷?、內(nèi)部能量轉換（internal conversion)續(xù)前過程：當兩個電子的能級非?？拷?，以致其振動能級有重疊 時，電子常常由高電子能級以非輻射躍遷方式轉移至低 電子能級，這種過程稱為內(nèi)部能量轉換特點：發(fā)生在非常靠近的兩個電子能級間，他們的振動能級有 重疊；時間約10-110-13秒?；蚶m(xù)前處于激發(fā)態(tài)的電子，通過振動弛豫和內(nèi)部能量 轉換，均回到第一激發(fā)態(tài)的最低振動能級過程：振動弛豫內(nèi)部能量交換振動弛豫返回注：3、體系間跨越（intersystem crossing)續(xù)前過程：處于激發(fā)態(tài)的電子自旋方向發(fā)生改變，而使電子能級的 多重性發(fā)生變化的過程特點：激發(fā)單重態(tài)與激發(fā)三重態(tài)振動能級

5、重疊時，產(chǎn)生體系間 的跨越（S1*T1 ）。結果：這種跨越會導致熒光強度減弱，甚至熄滅。續(xù)前影響體系間跨越幾率增大的因素：含重原子的分子（如碘、溴等），體系間跨越最為常見。在溶液中存在氧分子等，這些順磁性物質也能增加體 系間跨越的發(fā)生幾率。原因：高原子序數(shù)的原子中，電子的自旋與軌道運 動之間的相互作用較大，有利于電子自旋反 轉的發(fā)生。返回4、熒光（fluorescence）續(xù)前過程：電子由單重態(tài)的第一激發(fā)態(tài)最低振動能級躍遷到基態(tài)的 任一振動能級而發(fā)射的光量子為熒光特點：發(fā)生在激發(fā)單重態(tài)最低振動能級與基態(tài)之間。時間約為 10-710-9 s。注： 發(fā)射熒光的能量比吸收的能量小 1 0 即發(fā)射波長

6、 激發(fā)波長 硫酸奎寧的激發(fā)光譜和熒光光譜激發(fā)光譜熒光光譜激發(fā)光譜熒光光譜返回5、磷光（phosporescence）續(xù)前過程：電子由三重態(tài)的第一激發(fā)態(tài)最低振動能級躍遷到基態(tài)的 任一振動能級而發(fā)射的光量子為磷光特點：發(fā)生在激發(fā)三重態(tài)最低振動能級與基態(tài)之間。分子在三 重態(tài)的最低振動能級上可以存活一段時間，發(fā)射時間約 為10-410 s。注： 發(fā)射磷光的能量比熒光的能量小 21 0 即磷光波長 熒光波長 激發(fā)波長續(xù)前熒光與磷光的比較熒 光磷 光躍遷激發(fā)單重態(tài)最低振動能級基態(tài)激發(fā)三重態(tài)最低振動能級基態(tài)光電子能量E激發(fā) E熒光E磷光波長激發(fā) 熒光 磷光發(fā)射時間10-910-7秒10-410秒返回6、外部

7、能量轉換（external conversion)續(xù)前過程：如果分子在溶液中被激發(fā)，激發(fā)分子之間、分子與溶劑 之間會發(fā)生碰撞而失去能量，這種非輻射躍遷的過程稱 為外部能量轉換特點：發(fā)生在激發(fā)態(tài)的最低振動能級和基態(tài)之間；所需時間約 為10-710-9秒。結果：導致熒光或磷光減弱，甚至熄滅或續(xù)前返回返回211.2.2 激發(fā)光譜與發(fā)射（熒光）光譜激發(fā)波長發(fā)射波長熒光物質分子的兩個特征光譜激發(fā)光譜(excitation spectrum)： F ex 熒光光譜(fluorescence spectrum)： F em（二）激發(fā)光譜與熒光光譜激發(fā)光譜：（與吸收光譜類似）表示不同激發(fā)波長的輻射引起 物質發(fā)

8、射某一波長熒光所得的光譜。 方法：固定發(fā)射光波長em，依次改變激發(fā)波長ex，測 熒光強度F，以F-ex作圖得熒光物質的激發(fā)光譜。發(fā)射光譜：（熒光光譜）固定激發(fā)光波長ex，依次改變發(fā)射 波長em，測熒光強度F，以F-em作圖得熒光光譜。激發(fā)光譜與熒光光譜上的max是定性定量的依據(jù)熒光光譜的特點（重點）（1）斯托克斯位移：熒光發(fā)射波長總是大于激發(fā)波長。 原因：無輻射躍遷能量損失，包括振動弛豫和內(nèi)部能量轉換等（2） 熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關 原因：電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量，產(chǎn) 生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能 級再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長一定的熒光(如圖)。

9、（3） 熒光發(fā)射光譜與激發(fā)光譜的 鏡像關系 通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一 樣）成鏡像對稱關系。 蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜S0S1*=4=3=2=1=0=4=3=2=1=0b4b3b2b1b0c0c1c2c3c4E4E3E2E1E4E3E2E1蒽的能級躍遷圖鏡像關系的原因基態(tài)上的各振動能級分布與第一激發(fā)態(tài)上的各振動能級分布類似返回11.2.3 分子結構與熒光的關系 1.分子產(chǎn)生熒光必須具備的條件（1）具有合適的結構：結構中有共軛 *產(chǎn)生的K帶， 能吸收紫外-可見光（2）具有一定的熒光效率（）： 熒光效率（）：熒光效率只能為01熒光效率低的物質可能有強的紫外吸收，但所吸收的能量

10、以無輻射躍遷的方式釋放，不出現(xiàn)熒光發(fā)射；2.分子結構對熒光的關系（1）躍遷類型： *是強吸收帶，電子躍遷幾率大，熒光效率高； n *是弱吸收帶，電子躍遷幾率小，產(chǎn)生的熒光極弱；（2）共軛效應： 提高 *共軛度，有利于增加熒光效率，并產(chǎn)生紅移（3）剛性共平面結構： 剛性共平面結構，電子共軛性增加，熒光強度增大。（4）取代基效應：芳環(huán)上有供電基，使熒光增強。 給電子基團引入，（-NH2，-OH，-OCH3等），增加共軛程度 吸電子基團引入，（-COOH，-NO2，-Cl 等）， 減弱共軛程度 影響不大：-SO3H，-NH3+，-R，對共軛體系作用較小返回續(xù)前苯萘蒽ex=205nmem=278nmf

11、=0.11286nm321nm0.29356nm404nm0.36聯(lián)苯f=0.2芴f=1.0返回1、溫度：低溫，f。 原因：溫度T，分子運動加快， 磁撞幾率無輻射躍遷2、溶劑： 溶劑介電常數(shù)，極性，n*,E,f， * E,f， 溶劑含重原子或溶解氧（CBr4等)，體系間跨越。 使f，甚至熄滅。 溶劑粘度 ，f，F(xiàn)11.2.4 影響熒光強度的外界因素續(xù)前3、pH影響 對酸堿化合物，溶液pH的影響較大，需要嚴格控制；4、熒光熄滅的影響熒光物質與溶劑分子或其它溶質分子相互作用引起熒光強度降低或熄滅的現(xiàn)象。引起熒光熄滅的物質為熒光熄滅劑 常見的熄滅劑有：鹵素離子、重金屬離子、氧分子以及硝基化 合物、重

12、氮化合物、羰基化合物。給電子基團續(xù)前5、散射光的干擾散射光:當一束平行光照射在液體樣品上，大部分光線透過溶液， 小部分光線由于光子和物質分子相碰撞，使光子的運動方 向發(fā)生改變而向不同角度散射，這種光稱為散射光。瑞利光:光子和物質發(fā)生彈性磁撞時，不發(fā)生能量交換，僅光子方 向改變，這種散射光稱為瑞利光。其波長與入射光相同。拉曼光:光子和物質發(fā)生非彈性磁撞，光子改變方向同時，與物質 有能量交換，散射光波長有所改變，增大或減小，這種散 射光為拉曼光。 波長增大的拉曼光對熒光測定有干擾硫酸奎寧在不同激發(fā)波長下的熒光(a)與散射光譜(b)熒光光譜散射光譜瑞利光320nm拉曼光360nm拉曼光400nm熒光

13、448nm激發(fā)320nm激發(fā)350nm瑞利光350nm返回11.3 熒光定量分析2、熒光強度與濃度關系：（稀溶液） 熒光強度F與溶液吸收光能的程度以及溶液中熒光物質的量子效率有關。 若熒光物質濃度很小，滿足Ecl0.05時，熒光強度與熒光物質濃度成正比 F = k (I0 - I)=KC1、熒光測定方向：激發(fā)光源垂直方向，避免透射光干擾。受激后，可在各個方向發(fā)射熒光，在透過光的方向不易測定F。返回11.4 熒光分析技術及應用1、熒光儀器簡介：四個部分：激發(fā)光源、樣品池、雙單色器系統(tǒng)、檢測器。（1）光電熒光計高壓汞燈透鏡樣品池第一濾光片第二濾光片光電管電表光電熒光計光路圖高壓Hg燈，產(chǎn)生線光譜將不需要的光濾去低熒光的玻璃或石英制成，四面透光。只讓熒光照射到檢測器上續(xù)前（2）熒光分光光度計氙燈樣品池檢測器熒光分光光度計光路圖固定激發(fā)波長ex ，掃描熒光光譜，找熒光光譜max 。固定熒光光譜max，掃描激發(fā)光譜，找激發(fā)光譜max 。固定激發(fā)光譜max 。掃描熒光光譜，找熒光光譜max 。續(xù)前（3）熒光光電計與熒光分光光度計的