分子細(xì)胞遺傳學(xué)一課件

1、分子細(xì)胞遺傳學(xué)一分子細(xì)胞遺傳學(xué)一分子細(xì)胞遺傳學(xué)一原位雜交(In situ hybridization)1）同位素原位雜交(Isotopic in situ hybridization) 70年代 2）非同位素原位雜交(Non-isotopic in situ hybridization) 80年代中后期 （1）免疫酶聯(lián) （2）熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization, FISH)*同位素原位雜交的不足之處：1）不穩(wěn)定；2）低特異性；3）高背景；4）暴光時(shí)間長(zhǎng)；5）結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)處理繁瑣。Lichter P. Cremer T. Ward D.C.原位雜交(

2、In situ hybridization)1FISH: (Fluorescent In Situ Hybridization).FISH is the detection of highly specific DNA probes which have been hybridized to either interphase or metaphase chromosomes using fluorescence microscopy. DNA for probe use is labeled with fluorescent (direct method) or non fluorescen

3、t molecules which are then detected by fluorescent antibodies (indirect method). The probes bind to a specific region or regions on the target chromosome. The chromosomes are then stained using a contrasting color, and the cells are viewed using a fluorescence microscope.FISH: (Fluorescent In Situ H

4、yb分子細(xì)胞遺傳學(xué)一分子細(xì)胞遺傳學(xué)一*熒光原位雜交的特點(diǎn)：1）快速；2）信號(hào)強(qiáng)；3）特異性高；4）多色。*FISH有上述優(yōu)點(diǎn)的原因：1）使用了熒光標(biāo)記與檢測(cè)系統(tǒng)取代放射性標(biāo)記與檢測(cè)系統(tǒng)標(biāo)記探針的物質(zhì)：（1）生物素(biotin)/地高辛(digoxigenin) 半抗原報(bào)告分子（間接標(biāo)記） （2）熒光物質(zhì)（直接標(biāo)記） Cy2或FluorX(綠色) / Cy3(橙色) / Cy3.5(猩紅色) / Cy5(紅色) / Aqua(蘭色) 間接標(biāo)記的信號(hào)檢測(cè)（抗biotin或digoxigenin抗體上連接熒光物質(zhì)）物質(zhì)： conjugated to avidin or antibody of di

5、goxigenin (1)Fluorescein isothiocyanate(FITC)或Bidopy綠色 (2)Texas Red, Rhodamine, 紅色 (3)AMCA蘭色染色體復(fù)染的物質(zhì): Propidium Iodide (PI)（紅色），DAPI（蘭色），quinacrine（綠色），chromomycine A3（綠色）*熒光原位雜交的特點(diǎn)：1）快速；2）信號(hào)強(qiáng)；3）特異性 2）染色體“原位抑制”雜交（chromosome in situ suppression, CISS)克服散在的重復(fù)序列造成的雜交背景，提高信號(hào)的特異性，在探針中加入過(guò)量的未標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)性DNA(comp

6、etitor DNA)，如human Cot-1 DNA，進(jìn)行雜交前的預(yù)復(fù)性。探針中的重復(fù)序列與加入的競(jìng)爭(zhēng)物中的大量重復(fù)序列優(yōu)先復(fù)性，而特異性的單拷貝序列因競(jìng)爭(zhēng)物中同源序列拷貝數(shù)少，絕大部分仍保持單鏈狀態(tài)。*FISH技術(shù)的應(yīng)用1）基因（或DNA片段）的染色體定位；2）染色體數(shù)目與結(jié)構(gòu)異常的檢測(cè)；3）間期細(xì)胞遺傳學(xué)（絨毛/羊水/精子/卵裂球/其它間期細(xì)胞研究與診斷）；4）腫瘤遺傳學(xué)研究2）染色體“原位抑制”雜交（chromosome in si*用于FISH的探針1）單拷貝探針： （1）種類(lèi)：YAC， BAC， Cosmid，Plasmid， cDNA片段 （2）應(yīng)用 （a）定位DNA片段及嵌合

7、體克隆驗(yàn)證； （b）確定染色體微小缺失與重復(fù)； （c）染色體斷裂點(diǎn)分析。 （d）間期細(xì)胞染色體數(shù)目異常診斷。*用于FISH的探針1）單拷貝探針： （1左：DNA片段的染色體定位 右：嵌合體檢出左：DNA片段的染色體定位 右：嵌合體檢出FISH檢測(cè)微小缺失FISH檢測(cè)微小缺失染色體片段重復(fù) Dup 19(p13.2-13.1ABABDirect DupNormalNormal染色體片段重復(fù) Dup 19(p13.2-13.1ABABD左圖：染色體斷裂點(diǎn)分析 21號(hào)染色體長(zhǎng)臂斷裂點(diǎn)精確定位右圖：21q22.2 BAC克隆在Down綜合征間期細(xì)胞中的雜交信號(hào)左圖：染色體斷裂點(diǎn)分析 21號(hào)BAC 1D

8、9 on 2p21 Detected Amplifications on Thyroid Tumor Cell Line WROBAC 1D9 on 2p21 Detected Ampli2）簡(jiǎn)單重復(fù)序列探針(simple repetitive probes)異染色質(zhì)著絲粒探針(heterochromatic centromer probes)其靶序列為衛(wèi)星DNA或衛(wèi)星III DNA(alpha satellite/satellite III DNA)多位于染色體的著絲粒和異染色質(zhì)區(qū)域，重復(fù)數(shù)百次至數(shù)千次。特點(diǎn)：信號(hào)強(qiáng)應(yīng)用：(a)標(biāo)記染色體識(shí)別 (b)染色體數(shù)目異常檢測(cè) (c)間期細(xì)胞遺傳學(xué)研

9、究和臨床診斷 2）簡(jiǎn)單重復(fù)序列探針(simple repetitive p分子細(xì)胞遺傳學(xué)一*間期細(xì)胞遺傳學(xué)的意義：細(xì)胞分裂期僅占整個(gè)細(xì)胞周期的幾分之一至幾十分之一，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)和相應(yīng)處理才能獲得染色體。人體的大部分細(xì)胞并不進(jìn)行分裂，很難通過(guò)培養(yǎng)獲得中期染色體分裂相，間期FISH為這一時(shí)期遺傳物質(zhì)的研究提供了可能，而且快速。*間期細(xì)胞遺傳學(xué)的意義：細(xì)胞分裂期僅占整個(gè)細(xì)胞周期的幾3）染色體涂染探針(chromosome painting probes)整條染色體探針或染色體區(qū)帶特異性探針探針來(lái)源：（1）含有人單條染色體的人-嚙齒類(lèi)(human-rodent)體細(xì)胞雜種組織融合的產(chǎn)物；（2）熒光激活的

10、流式細(xì)胞儀(fluorescence-activated cell sorter,FACS)分離整條染色體DNA，并以載體克隆/PCR擴(kuò)增；（3）顯微切割得到染色體或染色體片段，PCR擴(kuò)增；染色體涂染方法：（1）正向(forward)：正常probe雜交到待檢測(cè)的異常標(biāo)本上；（2）逆向(reverse)：分離異常染色體制備探針，雜交到正常標(biāo)本上。應(yīng)用（1）染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常分析； （2）不同物種間的同源性比較； （3）白血病及其它腫瘤的染色體診斷和研究。*不能用于間期FISH3）染色體涂染探針(chromosome painting 分子細(xì)胞遺傳學(xué)一FISH檢測(cè)（chromosome pai

11、nting)染色體易位FISH檢測(cè)（chromosome painting)染色體分子細(xì)胞遺傳學(xué)一4）多色FISH（muti-color FISH) 多色復(fù)合染色體FISH探針(multiplex FISH, M-FISH probes)#兩種以上不同的非同位素標(biāo)記，不同的熒光檢測(cè)系統(tǒng)，通過(guò)不同的濾光片組合或極少數(shù)幾種非同位素標(biāo)記探針后，按照不同的比例混合，可以顯示多種顏色。 #采取結(jié)合或比率標(biāo)記的方法進(jìn)行標(biāo)記探針。在一套特殊的濾光片和計(jì)算機(jī)軟件系統(tǒng)輔助下，可制作24條染色體的彩色核型。應(yīng)用：(a)染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常及斷裂點(diǎn)分析多色FISH或M-FISH (b)標(biāo)記染色體識(shí)別多色FISH或M

12、-FISH (c)不同種屬間基因組同源性比較多色FISH (d)多個(gè)DNA片段同時(shí)定位多色FISH*M-FISH不能檢測(cè)染色體內(nèi)的倒位、小片段缺失與重復(fù)。4）多色FISH（muti-color FISH) 多色FISHM-FISH技術(shù)多色FISH5）彩色顯帶FISH（Rx-FISH）探針根據(jù)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物與人類(lèi)基因組的同源性制作探針，使人類(lèi)的24條染色體顯示出彩色帶型。5）彩色顯帶FISH（Rx-FISH）探針根據(jù)靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物與*比較基因組雜交(comparative in situ hybridization)探針位整個(gè)基因組DNA，而不是一個(gè)點(diǎn)或一個(gè)區(qū)域，主要用于確定未知區(qū)域的DNA擴(kuò)增或缺失。

13、特別是回避了實(shí)體腫瘤染色體制備的難題，是其它FISH方法難以替代的。但操作難度較大。應(yīng)用：(a)腫瘤遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)新的癌基因和抑癌基因； (b)相關(guān)種屬間和同一種屬內(nèi)不同個(gè)體之間基因組差異； (c)染色體不平衡片段識(shí)別和染色體重排研究。*比較基因組雜交(comparative in situ 比較基因組雜交(comparative genomic hybridization，CGH)比較基因組雜交(comparative genomic h*染色質(zhì) fiber FISH染色質(zhì)從細(xì)胞中釋放出來(lái)后，做FISH。信號(hào)由中期或間期的點(diǎn)狀，形成線(xiàn)狀排列。可提高定位的分辨率。應(yīng)用：(a)估計(jì)cosmid和YAC或BAC克隆重疊群的重疊程度，以及 gap的有無(wú)和大?。?(b)確定DNA微小缺失與重復(fù)； (c)染色質(zhì)