西南林大生物化學儀器分析技術課件-06電泳技術

1、第四章 電 泳 技 術各種生物大分子在一定pH條件下，可以解離成帶電荷的顆粒，這種帶電顆粒在電場的作用下向相反電極移動的現(xiàn)象稱為電泳(electrophoresis)。電泳作為一項生物化學研究的方法是在1937年Tiselius等人改進了電泳儀使之具有高度準確性以后，電泳技術才得到了較大的發(fā)展。20世紀50年代，許多科學家著手改進電泳儀，尋找合適的電泳支持介質(zhì)，并先后找到濾紙，醋酸纖維薄膜，淀粉及瓊脂作為支持物。 60年代，Davis等科學家利用聚丙烯酰胺凝膠作為電泳支持物，在此基礎上發(fā)展了SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳、雙向電泳和印跡轉(zhuǎn)移電泳等技術。這些技術的應用越來越廣泛，從分離

2、小分子，如氨基酸、肽、激素、核苷酸到復雜的生物大分子，如蛋白質(zhì)、核酸甚至病毒顆粒的分離鑒定。已成為生化分析分離不可缺少的一門重要技術。電泳基本原理任何帶電物質(zhì)由于其本身的解離作用或表面上吸附其他帶電質(zhì)點，在電場中便會向一定的電極移動。例如，蛋白質(zhì)分子是由氨基酸組成的，而氨基酸帶有可解離的氨基(一NH3)和羧基(一COO)，是典型的兩性電解質(zhì)，在一定的pH條件下，就會解離而帶電。帶電的性質(zhì)和多少取決于蛋白質(zhì)分子的性質(zhì)和溶液的pH以及離子強度。 在某一pH條件下蛋白質(zhì)分子所帶的正電荷數(shù)恰好等于負電荷數(shù)，即凈電荷等于零，此時蛋白質(zhì)質(zhì)點在電場中不移動，溶液的這一pH，稱為該蛋白質(zhì)的等電點(pI)。如果

3、溶液的pH大于pI，則蛋白質(zhì)分子會解離出H而帶負電，此時蛋白質(zhì)分子在電場中向正極移動。如果溶液的pH值小于pI，則蛋白質(zhì)分子結(jié)合一部分H而帶正電，此時蛋白質(zhì)分子在電場中向負極移動。由于帶電顆粒的泳動速度受電場強度影響，使得同一帶電顆粒在不同電場中泳動速度是不同的，其泳動情況用遷移率來表示。遷移率是指帶電顆粒在單位電場強度下的泳動速度，可用以下公式表示： m=v/E=Q/6rm：遷移率（cm2/Vs）；v：顆粒泳動速度（cm/s）；E：電場強度（V/cm）；Q：被分離物所帶凈電荷；：介質(zhì)粘度；r：顆粒半徑。由上式可見遷移率與球形顆粒半徑、介質(zhì)粘度、顆粒所帶凈電荷有關。帶電顆粒在電場申的泳動速度與

4、本身所帶凈電荷的數(shù)量，顆粒的大小和形狀有關。一般說，所帶的電荷數(shù)量越多，顆粒越小越接近球形，則在電場中泳動速度越快，反之，則越慢。42 影響遷移率的主要因素遷移率是膠體顆粒的物理常數(shù)，可用來鑒定蛋白質(zhì)以及研究它們的某些物化性質(zhì)，被分離物質(zhì)遷移率除受其本身性質(zhì)影響外，還與其他外界因素有關。影響顆粒遷移率的外界因素討論如下。421 電場強度也稱電位梯度或電勢梯度。所謂電場強度是指每厘米支持物的電位差，在一定大小的電場中，帶電顆粒的泳動受所用電壓的控制，電壓越高，帶電顆粒泳動越快，同一種帶電粒子在不同電場里泳動速度不同。在電泳中，帶電顆粒的遷移率與電流成正比，與電阻成反比。根據(jù)電場強度的大小，可以將

5、電泳分為常壓電泳和高壓電泳，前者電場強度為210V/cm，后者為70200V/cm，常壓電泳時間長，需數(shù)小時到數(shù)十小時，高壓電泳時間短，有時僅需幾分鐘。 溶液pH由于蛋白質(zhì)、氨基酸等的電離度a隨溶液pH變化而不同，所以實際上常使用有效遷移率(U)，即: U=ma 因此，在電泳時選用一定pH的緩沖液非常重要。pH決定帶電顆粒的解離程度，在距樣品等電點pI越遠的pH溶液中，樣品所帶的電荷量越多。為使電泳時的pH恒定，必須選用適當?shù)木彌_液作為電極緩沖液，顆粒所帶凈電荷越多，泳動速度也越快;反之，則越慢。因此，分離某種蛋白質(zhì)混合物時，應選擇一個合適的pH，才能使被分離的各種蛋白質(zhì)所帶的電荷數(shù)量有較大的

6、差異，更有利于彼此的分開。423 溶液的離子強度（ionic strenght)離子強度影響顆粒的電動電勢，緩沖液離子強度過大，溶液中的離子會分擔大部分電流，而使被分離的粒子遷移速度變慢。一般最適的離子強度在0.020.2mol/L之間。一個單單價(如NaCl、KCl)電解質(zhì)的離子強度就等于其濃度；一個單雙價或雙單價(如Na2SO4、CaCl2)電解質(zhì)的離子強度，等于其濃度的三倍。而ZnSO4、CuSO4等雙雙價電解質(zhì)的離子強度，就等于其濃度的四倍。因此只要知道溶液的濃度，即可計算出溶液的離子強度。4.2.5 溫度的影響電泳過程中由于通電引起溫度升高，致使介質(zhì)粘度下降，顆粒運動加劇引起自由擴散

7、變快，遷移率增加。為防止溫度的升高，避免熱效應對電泳的影響，可控制電壓或電流，也可將電泳槽置冰箱里進行電泳或在電泳系統(tǒng)中安裝冷卻散熱裝置。43 凝 膠 電 泳431聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱PAGE)是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持物的一種電泳方法。它是在淀粉凝膠電泳的基礎上發(fā)展起來的。此法在分子生物學、生物化學以及臨床等方面具有廣泛的應用。431l PAGE的優(yōu)點(1)聚丙烯酰胺凝膠是人工合成的多聚體。調(diào)節(jié)單體濃度或單體和交聯(lián)劑的比例，就能得到孔徑不同、范圍廣泛的凝膠物質(zhì)，而且重復性好。(2)化學性能穩(wěn)定，與被分

8、離物不起化學反應，對溫度和pH變化不敏感。(3)聚丙烯胺酰凝膠是CCCCC連接的多聚體，側(cè)鏈除帶有不活潑的胺?；?，不帶有任何其他離子基團，故無電滲作用。(4)聚丙烯酰胺凝膠機械強度好，彈性大，無色透明，有利于電泳后進行各種處理。(5)設備簡單，所需樣品量少(1100g)，分辨率較高。用此方法進行超微量分析時，可檢出含量在109mol/L左右的樣品。PAGE應用范圍廣，可用于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物分子的分離、定性、定量分析及少量的制備，還可測定相對分子質(zhì)量、等電點等。4312聚丙烯酚胺凝膠的聚合聚丙烯酰胺凝膠是由單體(monomer)丙烯酰胺(acrylamide，簡稱Acr)和交聯(lián)劑（cro

9、sslinker)，又稱為共聚體的N，N一甲叉雙丙烯酰胺(methylene bisacrylamide, 簡稱Bis)在加速劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。在催化劑過硫酸銨ammonium persulfate (NH4) 2S408 ,簡稱AP和加速劑N，N，N，N一四甲基乙二胺(N，N，N，N一tetramethyl ethylene diamine，簡稱TEMED)的作用下，聚合含酰胺側(cè)鏈的脂肪族長鏈，相鄰的兩個鏈由甲叉橋連接起來的三維網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)。 催化劑和加速劑的種類很多，目前常用的有兩種催化體系（1、化學聚合；2、光聚合。）介紹一種最常用的化學聚合足夠用了。1、化學聚

10、合?；瘜W聚合的催化劑一般是過硫酸銨，加速劑是脂肪叔胺，如四甲基乙二胺即TEMED(CH3) 2N一CH2一CH2一N(CH3) 2，三乙醇胺和二甲基氨丙腈等。其中以TEMED為最好。它的堿基可以催化過硫酸銨(NH4)2S2O8立即產(chǎn)生自由硫酸基，硫酸自由基的氧原子激活丙烯酰胺單體連接形成單體長鏈。含有這種丙烯酰胺單體長鏈的溶液盡管比較粘稠，但不能形成凝膠。只有當交聯(lián)劑(Bis)存在時，才能形成凝膠。Bis將單體長鏈連接成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。在過硫酸銨一TEMED催化系統(tǒng)中，Acr和Bis聚合的初速率與硫酸銨濃度的平方根成正比，并且在堿性條件下反應迅速。此外，溫度、氧分子和雜質(zhì)等都會影響聚合速度。溫度較高

11、聚合較快，溶液預先抽氣的比不抽氣的聚合快。4313 丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺量的確定 聚丙烯酰胺凝膠的孔徑大小取決于膠的濃度和交聯(lián)度(Bis在膠中的分含量)。例如75%的膠，平均孔徑5nm，30%的膠孔徑為2nm。若Bis與Acr之比由1:15改變到1:60，則明顯改變了膠的分子篩性質(zhì)，使同工酶的相對遷移率增大，如乳酸脫氫酶的相對遷移率由0148變到0273。凝膠的濃度大或交聯(lián)度大，蛋白質(zhì)遷移的速度慢，電泳時間長；反之遷移速度快，電泳時間短。 通常凝膠的篩孔、透明度和彈性是隨著凝膠濃度的增加而降低的，而機械強度卻隨著凝膠濃度的增加而增加。凝膠總濃度(T)的計算公式如下: T(A+B)/M100

12、% 式中叫代表Acr的重量(g)；B代表交聯(lián)劑Bis的重量(g);M代表溶液的體積(mL)。 交聯(lián)度(C)可按下式計算: C=B /(A+B)l00% A與B的比值(W/W)對凝膠的篩孔、透明度和機械強度等性質(zhì)也有明顯影響。A/B l00時，5%凝膠成糊狀，且易斷裂。由此可知，凝膠濃度不同，其交聯(lián)度是不同的。交聯(lián)度隨著總濃度的增加而降低。要制備完全透明而又有彈性的凝膠，應將A/B控制在30左右。不同濃度的單體對凝膠性能影響很大，Acr 2%，Bis mPaP mGaG根據(jù)有效遷移率的大小區(qū)分，把最快的Cl-稱為快離子(又稱前導離子，leading ion);把最慢的稱為慢離子H2N一CH2一C

13、OO-(又稱尾隨離子，trailing ion)。在電泳剛開始時，三層凝膠(樣品膠、濃縮膠和分離膠)中都含有快離子，只是電極緩沖液中含有慢離子。電泳進行時，由于快離子的遷移率最大，因此很快超過蛋白質(zhì)，于是在快離子后面形成一個離子濃度低的區(qū)域，即低電導區(qū)。電場強度與電導成反比關系: E = I/在低電導區(qū)就產(chǎn)生了較高的電場強度。這種環(huán)境使蛋白質(zhì)和慢離子在快離子后面加速移動。當快離子、慢離子和蛋白質(zhì)的遷移率與電場強度的乘積彼此相等時，則三種離子移動速度相同。在快離子和慢離子移動速度相等的穩(wěn)定狀態(tài)建立之后，則在快離子和慢離子之間形成一穩(wěn)定而又不斷向陽極移動的界面，也就是說，在高電場強度區(qū)和低電場強度

14、區(qū)之間形成一個迅速移動的界面。由于樣品蛋白質(zhì)的有效遷移率正好介于快、慢離子之間，因而它就聚集在這個移動界面的附近，被濃縮為一個狹窄的中間層。一般樣品可濃縮300多倍。樣品被濃縮的程度與其本身濃度無關，而起決定作用的因子是Cl的濃度，當Cl濃度高時，樣品被濃縮的程度也高。當樣品進入pH89的分離膠時，甘氨酸解離度增加，其有效遷移率超過蛋白質(zhì)，因此Cl及H2NCH2COO-沿著離子界面繼續(xù)前進，蛋白質(zhì)分子由于相對分子質(zhì)量大，被留在后面，然后再分成多個區(qū)帶。因此，濃縮膠與分離膠之間pH的不連續(xù)性是為了控制慢離子的解離度，從而控制其有效遷移率。在樣品膠和濃縮膠中，要求慢離子較所有被分離樣品的有效遷移率

15、低，以使樣品夾在快慢離子之間被濃縮。進入分離膠后，慢離子的有效遷移率比所有樣品的有效遷移率高，使樣品不再受離子界面的影響 。(2)電荷效應。蛋白質(zhì)混合物在界面處被高度濃縮，堆積成層，并形成一狹窄的高濃度蛋白質(zhì)區(qū)，但由于每種蛋白質(zhì)分子所載的有效電荷不同，故遷移率不同，所以各種蛋白質(zhì)樣品經(jīng)分離膠電泳后，若樣品組分的相對分子質(zhì)量相等，則它們就以電荷順序一條帶一條帶地排列起來。(3)分子篩效應。相對分子質(zhì)量或構(gòu)型不同的蛋白質(zhì)通過一定孔徑的分離膠時所受摩擦不同，受阻滯的程度不同，因此表現(xiàn)出不同的遷移率即為分子篩效應。蛋白質(zhì)樣品在均一的電場強度和pH條件下通過一定孔徑的分離膠，相對分子質(zhì)量小且為球形的蛋白

16、質(zhì)分子所受阻力小，移動速度快，走在前面;反之，則阻力大，移動慢，走在后面，從而通過凝膠的分子篩作用將各種蛋白質(zhì)分成各自的區(qū)帶。聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作(1)制備凝膠。把含有一定濃度的Acr和Bis與引發(fā)劑的電泳膠緩沖液抽真空，同時將電泳槽下槽底部加1%瓊脂封口，如果是圓盤電泳，則是把一端用玻璃棒將橡皮管塞住的玻璃管垂直放著，向抽真空的溶液中再加入加速劑（TEMED），即可把分離膠溶液加入管子內(nèi)或兩玻璃板之間，高度為2/3左右，用注射器小心地在膠液的表面上蓋上一層水，使膠有一個水平的表面，并與空氣隔絕，有利于凝膠的聚合。凝膠形成后，可看到一個清晰的界面，吸去覆蓋的水層，在分離膠上加濃縮膠后，插進

17、梳子，待膠凝固后再拔出梳子。(2)加樣將樣品與甘油或蔗糖混合，直接加在濃縮膠面上，含高濃度鹽的樣品要在電泳前透析去鹽，必須使樣品溶液電導低于分離膠的電導才能達到預期的濃縮效果。(3)電泳。膠做好后，把玻璃管或玻板置入電泳槽，安裝好后，上、下槽都加入電極緩沖液通電，上槽接負極，下槽接正極，等到染料走到離底部lcm處為止，斷掉電源，取下玻管或玻板。(4)樣品固定、染色和脫色432 瓊脂糖凝膠電泳4321瓊脂糖凝膠的性質(zhì)瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。瓊脂糖由D-半乳糖和L-半乳糖連接構(gòu)成不帶電荷的多糖鏈，這種多糖鏈在l00左右時呈液態(tài)，當溫度下降到45以下時，它們之間以氫鍵方式相

18、互連接成線性的雙鏈單環(huán)的瓊脂糖，經(jīng)凝聚即呈束狀的瓊脂糖凝膠。在pH4.09.0的緩沖液中是穩(wěn)定的。用瓊脂糖凝膠分離雙鏈DNA時，其遷移率大小主要與樣品的相對分子質(zhì)量有關，而與核酸的一級結(jié)構(gòu)以及堿基的組成無關。這種方法具有操作方便、設備簡單、需樣品量少、分辨能力高等優(yōu)點，是基因工程研究中常用的一門生物技術。 瓊脂糖凝膠電泳的優(yōu)點可歸納如下。(1)瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)均勻，含水量大(約占98%，卯%)，近似自由電泳，電泳圖譜清晰，分辨率高，重復性好。(2)瓊脂糖呈透明狀，無紫外吸收，電泳后的樣品可直接用紫外檢測;電泳后區(qū)帶易染色，樣品易洗脫，便于定量測定。(3)操作簡單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可

19、進行電泳。瓊脂糖凝膠電泳可用于核酸的分離鑒定，為DNA相對分子質(zhì)量測定提供了重要手段。4322凝膠濃度的選擇瓊脂糖凝膠電泳對核酸的分離作用與膠的濃度有密切關系。不同濃度的凝膠，可獲得不同大小的孔徑。故應根據(jù)需要選擇適當濃度的凝膠。4323 電極緩沖液瓊脂糖凝膠電極緩沖液有TAE、TBE、TPE和堿性緩沖液。其配方是:(1)5OTAE緩沖液。242gTris+57.1冰醋酸+l00mL O.5 mol/LEDTA(pH8.0)定容至1000mL，室溫放置。(2)5TBE緩沖液。54gTris+27.5g硼酸+2O mL O.5 mol/L EDTA調(diào)pH8.0，加水定容至1000mL，室溫放置。

20、TAE緩沖能力弱，在長時間電泳中緩沖能力逐漸喪失。因此，重復使用次數(shù)少。而TBE的緩沖能力較強，可重復使用數(shù)次。4324 瓊脂凝膠電泳操作 (1)制板。一般常用瓊脂板最合適的濃度為07%15%。稱取一定量的瓊脂糖盛入玻璃瓶中，按所需凝膠的濃度加入適量的電極緩沖液（已滅菌），在微波爐中加熱至沸騰熔化約10min。待該溶液冷卻到60左右，加溴化乙錠使之最后濃度為0.5g/mL。搖勻后即可制膠。溫放置約30min后，小心地移走梳子，即制成了瓊脂糖凝膠板。(2)加樣、電泳及檢測。 將瓊脂糖凝膠板移至電泳槽后，注入緩沖液(液面高于膠面)。核酸樣品濃度為0.10.6g/l,樣品一般與比重大的蔗糖或甘油混合

21、，同時加入一定量的指示劑(0.25%漠酚藍)，加核酸樣品110g，樣品一般加在瓊脂板靠近一端的梳子孔，接通電源，調(diào)節(jié)電壓，一般電壓高，跑得快，但分辨率差;電壓低，跑得慢，分辨率高。一般維持在5V/cm左右，當漠酚藍移至陽極端時，關閉電源。核酸已被膠中的EB染色，可置于紫外燈下觀察。434 等電聚焦電泳利用各種蛋白質(zhì)pI不同，以聚丙烯酚胺為電泳支持物，并在其中加入兩性電解質(zhì)載體(carrier ampholyes,瑞典LKB公司生產(chǎn)的兩性載體商品名為Ampholine)，在電場作用下，蛋白質(zhì)在pH梯度凝膠中泳動，當遷移至pI的pH處，則不再泳動，而濃縮成狹窄的區(qū)帶，這種分離蛋白質(zhì)的方法稱為聚丙烯

22、酞胺凝膠等電聚焦電泳(isoelectric focusing，簡稱IEF)。等電聚焦電泳簡稱等電聚焦。4341基本原理等電聚焦就是在一定抗對流介質(zhì)(如凝膠)中放人載體兩性電解質(zhì)，當通以直流電時，兩性電解質(zhì)即形成一個由陽極到陰極逐步增加的pH梯度。兩性化合物在此電泳過程中，就被濃集在與其等電點相同的pH區(qū)域，從而使不同化合物能按其各自等電點得到分離。(l)pH梯度的形成當一些兩性電解質(zhì)在支持物中，它們在陽極的酸性介質(zhì)時會得到質(zhì)子帶正電，在陰極的堿性介質(zhì)中則失掉質(zhì)子帶負電，這樣就會受其附近的電極所排斥而向相反方向移動?？雌渲兴嵝宰顝姷膬尚噪娊赓|(zhì)(甲)，當它由陰極泳動到陽極端支持物時，與陽極溶液電

23、離出來的H中和，會失去電荷而停止運動，它所在位置是它的pI。若有另一個pI稍高于甲的物質(zhì)(乙)，它排在甲的陰極側(cè)。若有很多兩性電解質(zhì)就會依pI遞增的次序，在支持物中從陽極排向陰極，形成平穩(wěn)的由陽極到陰極逐步上升的pH梯度。(2)等電聚焦分離蛋白質(zhì)的過程。蛋白質(zhì)是典型的兩性電解質(zhì)物質(zhì)。它所攜帶的電荷是隨著溶液pH的變化而變化的。即在酸性溶液中帶正電荷，在堿性溶液中帶負電荷。因此，蛋白質(zhì)在外加電場作用下或向正極或向負極移動。例如，當一個等電點為pIa的蛋白質(zhì)置于具有從正極向負極逐漸遞增的pH梯度的支持物的陰極端時，因其處于堿性環(huán)境中，其帶負電荷，故在電場作用下將向正極移動，當移動到pH等于其pIa的區(qū)域時，泳動將停止。如果把此蛋白質(zhì)放在陽極端，則其帶正電荷，向負極移動，最后也會泳動到pIa的pH區(qū)域。因此，無論把蛋