基因組學第7章課件

1、第7章 基因的轉錄調控 原核生物與真核生物基因轉錄的差別原核生物與真核生物基因表達的方式有很大差別，主要表現(xiàn)在：1) 原核生物基因的轉錄與mRNA的翻譯偶聯(lián)，轉錄與翻譯同步進行，因此原核生物不存在mRNA的加工問題；2) 真核生物基因的轉錄與mRNA的翻譯在空間上是分開的，轉錄在細胞核中進行。轉錄的產物加工后輸出到細胞質，由游離在胞質中或內質網(wǎng)上的核糖體將mRNA翻譯成蛋白質。真核生物的轉錄初級產物要經(jīng)過許多加工與修飾才能成為成熟的mRNA，未成熟的mRNA不能輸出細胞核。 大腸桿菌基因表達調控的方式大腸桿菌基因的轉錄起始控制有2種截然不同的方式：1) 組成型調控-主要依賴于啟動子的結構.2）

2、調節(jié)型控制-主要依賴于調控蛋白的活 性.由于原核生物的轉錄與翻譯是偶聯(lián)的,因此原核生物的轉錄可以通過翻譯機制進行調控,如衰減調控. 細菌轉錄起始調控的特點1) RNA多聚酶全酶包含與啟動子互作的成分-西格瑪因子和RNA多聚酶. 轉錄起始后, RNA多聚酶脫離西格瑪因子合成mRNA, 西格瑪因子仍然保留在啟動子位置.2) 啟動子的專一性可由西格瑪因子識別, 它們之間的互作決定基因是否表達.3) 啟動子的組成決定了轉錄起始的基準水平.4) 細菌轉錄調控元件(-35bp位置)的順序比真核生物調控元件要長, 可提高識別的專一性.大腸桿菌RNA多聚酶定點突變表明,-35位影響RNA聚合酶與DNA結合,

3、稱為識別域. -10位影響雙鏈的解鏈,稱為解旋域. 啟動子的結構規(guī)定了轉錄起始的基準水平大腸桿菌啟動子-35盒和-10盒的一致順序在不同的基序允許的范圍內有很大的變化。這些變化與轉錄起始點周圍以及下游50 bp內的核苷酸順序的組成共同影響啟動子的工作效率，它們限定了單位時間內轉錄起始的次數(shù)，與RNA多聚酶離開啟動子開始合成全長轉錄物直接相關?，F(xiàn)在還不清楚啟動子的順序組成以何種方式來影響轉錄起始，但從一些比較分析的結果可推知： 1）-35盒的組成主要影響亞基的識別以及RNA多聚 酶附著的速率； 2）-10盒的組成同轉錄起始復合物從封閉狀態(tài)轉向開 放狀態(tài)有關。 大腸桿菌因子因子 識別的啟動子 啟動

4、子一致順序 35盒框 10盒框 _ 70 大多數(shù)基因 TTGACA TATAAT32 熱激誘導基因 TCTCNCCCTTGAA CCCCATNTA28 運動與趨化性基因 CTAAA CCGATAT38 穩(wěn)定期表達基因 ？ ？ 24盒框 12盒框54 氮代謝與其它功能 CTGGNA TTGCA抗終止與衰減調控 1） 第一種機制稱為抗終止（antitermination）。當RNA多聚酶遇到終止信號時可無視其存在繼續(xù)前進，直至第二個終止信號出現(xiàn)。這種情況常常出現(xiàn)在第一個終止信號的下游仍有一個或數(shù)個基因，它們與前面的基因共享同一啟動子時。當多聚酶在第一個終止信號處停止時，其后的基因不表達；若多聚酶不

5、理睬第一個終止子繼續(xù)前進，其下游的基因則可表達。多聚酶本身不能作出是否停止的決定，需要借助一個抗終子蛋白（antitermination protein）。 2）第二種控制終止的類型為衰減（attenuation），主要涉及氨基酸如色氨酸合成有關的操縱子。色氨酸操縱子啟動子下游有一段140 bp的引導順序，終止信號位于+100+140 bp之間，可形成發(fā)夾結構，但取決于RNA多聚酶與核糖體之間的相對位置。引導順序+50+60 bp有兩個色氨酸密碼子，當細胞中色氨酸水平很低時，核糖體會在這兒停留，拉開與RNA多聚酶間的距離，阻止終止信號形成發(fā)夾結構，轉錄正常進行。當細胞中有足夠的色氨酸存在時，核

6、糖體緊跟RNA聚合酶，在轉錄到達近+140 bp位置時，終止信號形成發(fā)夾結構，RNA多聚酶脫離模板，轉錄停止。其它一些氨基酸，如組氨酸，亮氨酸和蘇氨酸的生物合成也采取衰減控制模式。 3）衰減調控僅出現(xiàn)在細菌中，它要求轉錄與翻譯同步進行。此外，轉錄與翻譯的速度必須大體一致，如果轉錄太快，或翻譯太慢都無法協(xié)調衰減控制必需的幾種因素之間的互作?？菇K止機理 轉錄衰減調控大腸桿菌轉錄的速率為40 nt/s, 翻譯的速率為15 aa/s, 兩者速度大致相同. 如果一個太快或者一個太慢, 就不易利用衰減調控. 在色氨酸豐余時, 核糖體翻譯快速通過1區(qū)和2區(qū), 導致1和2區(qū), 3和4區(qū)互配形成雙鏈. 核糖體到

7、達3和4區(qū)時受阻, 由于4區(qū)后的一連串-UUUUU-, 促使mRNA脫離模版DNA, 翻譯停止. 在色氨酸不足時, 核糖體緩慢通過1區(qū), 導致2和3區(qū)形成莖環(huán)結構, 不影響翻譯. 真核生物轉錄起始調控的特點1) 多層次調控: 染色質水平, 核小體水平, DNA 甲基化水平, 啟動子水平等.2) 真核生物RNA多聚酶不直接與啟動子接觸. 普遍性轉錄因子與啟動子互作, 構建 RNA多 聚酶結合的平臺.3) 普遍性轉錄因子與啟動子互作受控于增強子.4) 增強子在基因轉錄起始調控中起關鍵作用, 增強子由許多調控元件組合而成, 有不同的組合調控方式, 是基因差別表達的結構基.真核生物三種RNA多聚酶及基

8、因分類-RNA多聚酶I 28S,5.8S,18S核糖體RNA基因RNA多聚酶II 蛋白質編碼基因，小分子細胞核RNA （snRNA，U RNA）基因RNA多聚酶III 轉運RNA（tRNA），5S核糖體RNA U6- snRNA，小分子核仁R（snoRNA） 小分子細胞質RNA（sc RNA）基因-1) 三種RNA多聚酶的命名系根據(jù)這三種酶在層析柱上洗 脫時出現(xiàn)的先后秩序依次命名.2) 根據(jù)基因轉錄時采用的RNA多聚酶類型分別將基因分 為PolI基因, PolII基因,PolIII基因. POLI基因-rRNA基因的結構t2和t3: 轉錄終止信號.真核生物rRNA基因的組成1) 真核生物Pol

9、 I基因只有一種類型，即核糖體 RNA基因（rRNA基因）。2) 真核生物rRNA基因含3個成員，即18s，5.8 和28s rRNA基因共同組成一個表達單位。3) 所有真核生物rRNA基因均為多拷貝，彼此首 尾串聯(lián)，簇集在染色體的特定區(qū)域。DNA足跡法DNAase footprinting a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity: The technique is a simple conjoining of the Maxam-Gilbert DNA-sequencing method and

10、 the technique of DNAase-protected fragment isolation. 1) Fragments of a 5 end-labelled, double-stranded DNA segment, 2) partially degraded by DNAase in the presence and absence of the binding protein, 3) visualized by eletrophoresis and autoradiography alongside the base-specific reaction products

11、of the Maxam-Gilbert sequencing method. It is then possible to see the protective footprint of the binding protein on the DNA sequence. 調控順序種間專一性人類和小鼠rRNA基因的UCE和Core區(qū)具有很強的種屬專一性. POLI基因的調控順序真核生物細胞核rDNA轉錄區(qū)在各物種間顯示很強的保守性，而非轉錄區(qū)與內間區(qū)在長度與順序組成上則表現(xiàn)很大的變異。非轉錄區(qū)是rDNA中變化最大，也是十分重要的一個區(qū)域。非轉錄區(qū)有以下三個特點：1）含有啟動子，控制rRNA基因的

12、轉錄；2）很多小段的重復序列，又稱亞重復子（subrepeat）， 具有增強子功能；3）存在與rRNA基因的轉錄終止有關的信號。4）rRNA基因的調控順序有一突出特點，即表現(xiàn)高度的 種屬專一性。不同種屬的rRNA基因缺少普遍適用的 保守的啟動子順序。rRNA基因轉錄控制上游結合因子UBF含HMG盒,可插入DNA小溝.兩個UBF因子與上上游調控順序結合將DNA鏈彎曲約30度, 再征招TIT-IB復合物. 核仁顯性的分子機制位與增強子區(qū)的重復順序單元數(shù)目是決定爪蟾種間rRNA基因顯性表達的控制元件. POLII基因 1）蛋白質基因 2）U RNA基因或 sn/snoRNA基因高等真核生物蛋白質編碼

13、基因表達調控研究的策略與方法1) 高等真核生物基因表達調控的研究方法與原核生物有很大的不同. 因為高等真核生物基因位于染色體中, 在細胞核內轉錄, 很難獲得大量的轉錄產物供實驗研究.2) 高等真核生物基因的表達調控必須在真核細胞的背境下研究才能獲得和體內表達調控相似的結果. 原核生物有質粒這樣的克隆表達載體, 而高等真核生物缺少類似的系統(tǒng).3) 因此高等真核生物基因表達調控的研究首先必須尋找和建立有效的研究體系, 它們具有可以進行體外重組DNA操作, 又可在真核生物細胞內部進行表達研究.4) 早期的高等真核生物基因表達研究是從動物病毒入手, 因為動物病毒具有結構簡單, 拷貝數(shù)高, 可以體外操作

14、等優(yōu)點. 同時病毒基因的表達調控直接利用了寄主細胞基因調控裝置, 可以反應細胞內部的調控機理.SV40基因組結構與轉錄SV40 為猿猴病毒, 基因組為一環(huán)狀DNA, 全長5 243 bp, 編碼7個基因. 僅有一個雙向啟動子控制左右兩個方向的轉錄.SV40基因組啟動子功能解剖 增強子結構與功能剖析該實驗說明: 1) 缺少增強子基因不能表達(E,F). 2) 增強子元件可以正反方向排列, 不影響基因表達效率(A,B). 3) 增強子有冗余現(xiàn)象(C, D).增強子與啟動子的位置關系該實驗說明: 增強子和啟動子(TATA盒框)之間的距離與DNA雙螺旋螺距的倍數(shù)有關. 如插入的堿基對為整倍數(shù)可以轉錄,

15、 但效率不同. 如插入的堿基對增強子與啟動子間的距離與螺距為非整倍數(shù), 轉錄效率急劇下降(72bp和21bp之間). 在早期mRNA的兩個轉錄起點(1, 2)與TATA之間插入5bp盒和10bp, 轉錄效率不同. 啟動子的功能 1）為RNA多聚酶的 結合提供平臺 2）確定轉錄的方向 3）規(guī)定轉錄起始點 POLII增強子的結構特點(1)1）增強子無啟動子特異性，例如將SV40的增強子插 入到兔子 - 球蛋白啟動子的上游區(qū)，可提高轉 錄效率200倍。雙子葉花椰菜相嵌病毒35S啟動子 可在水稻細胞中啟動報告基因的表達。2）增強子為順式作用，即與啟動子位于同一DN鏈， 或者說只要找到編碼基因，即可在同

16、一DNA鏈或 近或遠的位置發(fā)現(xiàn)相關的增強子。3）增強子的功能與其排列方向無關, 可雙向調控，例 如當增強子反向插入時，仍然保持其原有功能。4）增強子具有獨立的結構，改變其兩側的順序組成 不影響增強子的作用。 5）增強子調節(jié)功能可以超長距離，例如白蛋白基因 的增強子位于起始位點上游10 kb的位置。POLII增強子的結構特點(2) 6）增強子含有許多可與不同轉錄因子結合的基序， 可以不同的組合方式調控基因的表達，在已研究 過的絕大多數(shù)基因的表達調控模式中都發(fā)現(xiàn)組成 增強子的不同基序或模塊（module）之間可形成 不同的組合,它們是基因差別表達（differential expression）的

17、主要原因.7) 增強子中的不同基序即有增強表達的成分,也有抑 制表達的成分, 有些不同的基序之間有順序重疊.8）冗余 有許多增強子的結構成分即模塊含有重復 拷貝.這些重復拷貝中如果缺失其中某些成員并不 喪失整個增強子的正常功能。增強子可雙向調控人類基因組中約11%的基因為頭-頭(dead-dead)排列, 或者說兩個基因共享相同的調控元件,它們的表達調控具有協(xié)同性.見:Jane M. Lin 等:Transcription factor binding and modified histones in human bidirectional promoters Genome Res. 2007

18、 17: 818-827 調控基序與轉錄因子轉錄因子(反式因子)與調控基序(順式元件)之間具有特定的對應關系, 轉錄因子可與特定DNA順序結合.Sp1蛋白與結合基序 增強子基序與組合調控控制基因差異表達的主要原因在于轉錄因子與增強子中不同元件的結合,這里有許多的組合方式, 它們決定基因是否表達及表達強度. 酵母半乳糖代謝基因調控 酵母半乳糖代謝基因突變轉錄因子GAL4的結構與功能缺失分析鑒定了GAL4蛋白存在5個功能區(qū), 分別執(zhí)行4種不同的功能: 1) 與DNA結合. 2) 形成二聚體. 3)與GAL80結合. 4)激活轉錄. GAL4蛋白功能域分析GAL4蛋白DNA結合域和激活域檢測實驗:

19、1) GAL4的DNA結合域只能與USA順序結合; 2) DNA結合域和激活域具獨立結構,可組成嵌合蛋白. 酵母雙雜交原理基因順式元件和反式因子的分離酵母單雜交可用于基因順式調控元件和反式作用因子的分離:1) cis-acting elements: 順式元件, 位于基因上游區(qū)可控制基因表達的DNA順序, 有一系列較短的序列組成;2) trans-acting factor: 反式因子, 可與基因上游區(qū)特定順式元件結合的蛋白質, 可控制基因的表達.酵母GAL基因調控順序分析基因順式元件區(qū)域的確定基因順式元件的實驗鑒別反式因子的分離與克隆BP: DNA-binding protein, 可與順式

20、元件結合. 將BP編碼順序與GAL4激活域編碼順序構建成融合蛋白編碼順序, 可在酵母細胞中激活標記基因lacZ的表達,使細胞變?yōu)樗{色.反式因子DNA結合域的鑒別 POLII U RNA基因的表達調控 POLII基因的轉錄起始 普遍性轉錄因子的功能 普遍轉錄因子 功 能- TFIID（TBP組合） 識別TATA盒框及Inr順序，形成 TFIIB結合的平臺 TFIID（TAFs） 識別核心啟動子，調節(jié)TBP的結合 TFIIA 穩(wěn)定TBP和TAF的結合 TFIIB 介導RNA多聚酶II的結合，影響轉錄 起始點的選擇 TFIIF 征召RNA多聚酶II TFIIE 介導TFIIH的結合，調節(jié)TFIIH的

21、活 性 TFIIH 具解旋酶活性子，負責使轉錄起始復 合物由閉合狀態(tài)向開放狀態(tài)轉變； 可能同多聚酶撤離核心啟動子有關- POLIII基因的種類 1）5S RNA基因 2）tRNA基因 3）7SK RNA，7SL RNA基因 4）U6 RNA 5) 某些病毒RNA基因 5S rRNA基因啟動子 tRNA基因的結構 POLIII基因的結構 POLIII基因的轉錄起始 種間POLIII啟動子可以互換POLII和POLIII啟動子與編碼區(qū)互換實驗 POLII和POLIII基因的轉換實驗TFIIIA與5S rRNA基因啟動子的結合 5S rRNA基因的表達調控（1）TFIIIA轉錄因子即可與5S RNA

22、基因調控區(qū)結合,也可與轉錄產物5S RNA結合. 當5S RNA產物豐余時, 5S RNA即可與TFIIIA結合, 從而抑制TFIIIA的轉錄活性, 5S RNA產物減少. 5S rRNA基因的表達調控（2）TFIIIA與組蛋白H1的競爭性結合可調控5S RNA基因的轉錄.體細胞與卵母細胞5S rRNA基因的差別表達爪蟾基因組有兩種5S RNA基因, 一種在卵母細胞表達, 拷貝數(shù)約24 000. 另一種為體細胞5S RNA基因, 拷貝數(shù)約400. 卵母細胞5S RNA基因啟動子與TFIIIA轉錄因子的結合能力低于體細胞5S RNA基因啟動子. 在胚胎發(fā)育過程中, 體細胞5S RNA基因的表達最

23、后取代卵母細胞5S RNA基因.體細胞5S rRNA基因的表層取代與卵母細胞5S rRNA基因表達的機制1) 卵母細胞階段, 由于TFIIIA轉錄因子的數(shù)量非常多, 加之卵母細胞5S RNA基因的拷貝數(shù)很高, 因此卵母細胞的轉錄占優(yōu)勢.2) 受精后, 由于細胞迅速分裂, 但TFIIIA并不合成, 因而每個細胞中TFIIIA的數(shù)量大幅度減少, 可轉錄的卵母細胞5S RNA基因的數(shù)量減少.3) 當胚胎發(fā)育到囊胚期, 每個體細胞數(shù)中TFIIIA的數(shù)量與卵母細胞5S RNA基因數(shù)量的比例降到10:1. 由于體細胞5S RNA基因啟動子與TFIIIA的結合能力更強,體細胞5S RNA基因的轉錄產物接近卵

24、母細胞5S RNA基因.4) 當體細胞數(shù)中TFIIIA的數(shù)量與卵母細胞5S RNA基因數(shù)量的比例降到2:1時,體細胞5S RNA基因的轉錄完全取代卵母細胞5S RNA基因.5) 不轉錄的卵母細胞5S RNA基因大量關閉, 加之卵母細胞5S RNA基因的復制時間更晚, 導致TFIIIA基因與更多的早復制的體細胞5S RNA基因結合,最終使卵母細胞5S RNA基因全部關閉.Dynamic changes in the CTD phosphorylation profile coordinate the Pol II transcription cycle with pre-mRNA process

25、ing and histone modification. (A) The general transcription factors (GTFs) form a complex with initiation-competent hypo-phosphorylated Pol II (Pol IIA) at the promoter. Transcription starts at the same time as Ser5 phosphorylation of the CTD (thick black line) by TFIIH. (B) Shortly after transcript

26、ion initiation, capping enzyme (CE) is recruited to the phosphorylated Pol II (Pol IIO) through its direct binding to Ser5-phosphorylated CTD. The histone methyltransferase Set1-containing complex is also recruited and tri-methylates histone H3 Lysine 4 (H3K4). Transcription pausing induced by DSIF/

27、NELF is relieved by P-TEFb-mediated CTD phosphorylation. (C) Elongating Pol IIO is increasingly phosphorylated at Ser2 by P-TEFb and associated with histone methyltransferase Set2, which tri-methylates histone H3 Lysine 36 (H3K36). Pol IIO also helps the recruitment of the splicing machinery (SP), w

28、hich splices sites in the pre-mRNA (red line). This step is mediated by an unknown phosphorylated CTD-binding factor (X) that facilitates the efficient excision of introns (red broken line). (D) Near the 30 end of the gene, 30 end processing factors (PA) are increasingly recruited to Pol IIO through

29、 direct interaction between Pcf11 and the Ser2-phosphorylated CTD. After transcribing the poly(A) signal (AATAAA), 30 end processing factors possibly transfer to RNA to catalyse endonucleolytic cleavage (black arrow) and induce subsequent transcription termination, which is presumably helped by the

30、5030 exonucleases Xrn2 and Pcf11. (E) After dissociating from the DNA template, Pol IIO is possibly dephosphorylated by the action of the CTD phosphatases, FCP1 and Ssu72, before recycling or reinitiation. 線粒體基因的轉錄人類線粒體基因的轉錄酵母線粒體基因組線粒體DNA有5-7個轉錄起始位點. 葉綠體基因的轉錄 葉綠體基因轉錄的RNA多聚酶 古細菌基因的轉錄裝置1) 古細菌基因的啟動子含有典

31、型的真核生物Pol II 基因TATA盒框（-TTTAWA-），距離轉錄起始點274 bp，與大多數(shù)Pol II 基因啟動子的距離相似。2) 古細菌Sulfolobus solfataricus和詹氏甲烷球菌（Methanococcus jannaschii）都只有一種RNA多聚酶，與真核生物RNA多聚酶非常相似。3) TBP和TFB是真核生物轉錄系統(tǒng)中的關鍵因子，TFB（TFIIB和TFIIIB）可將多聚酶定位在啟動子區(qū).古細菌也有編碼類似真核生物轉錄因子TBP和TFB的基因，但未鑒定出與真核生物普遍轉錄因子同源的其它蛋白。4) 在Sulfolobus solfataricus基因組中還發(fā)現(xiàn)

32、與真核生物轉錄延伸因子TF11S同源的順序，但只位于某些編碼區(qū)段。 因此, 古細菌轉錄因子的結構更接近真核生物. 轉錄因子的結構特征(1)1) DNA結合域（DNA-binding domain） 其核心成分為 DNA結合基序（motif）， 它們可識別雙螺旋DNA的 堿基順序，與靶位專一性結合。具有相同DNA結合 域的轉錄因子具有類似的功能，屬于同一基因家族成 員。 2) 激活域（activation domain） 這是與其它轉錄因子 蛋白互作的結構成分，可控制前起始復合物的組裝與 轉錄起始. 同一家族轉錄因子的可變區(qū)通常發(fā)生在激 活功能域，通過可變區(qū)順序的變異擴大調節(jié)的范圍.二聚體結合區(qū) 有許多轉錄因子是以二聚體形式與 DNA調控區(qū)結合,為了維持二聚體結構, 單體蛋白質有 二聚體互做區(qū), 如亮氨酸拉鏈蛋白質的拉鏈區(qū). 轉錄因子的結構特征(2)4) 轉錄因子激活功能域雖然變化很大，但可歸 于下述三個類群之一： 酸性功能域（acidic domain） 在其激活功能域中含較 多的酸性氨