獸醫(yī)現(xiàn)代監(jiān)測診斷技術(shù)(終稿)課件

1、獸醫(yī)現(xiàn)代監(jiān)測診斷技術(shù)(終稿)獸醫(yī)現(xiàn)代監(jiān)測診斷技術(shù)(終稿) 獸醫(yī)監(jiān)測診斷技術(shù)在動物疫病防控和獸醫(yī)公共衛(wèi)生工作中具有重要作用，是預(yù)防、控制和撲滅重大動物疫病中的重要一環(huán)，為養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展和公共衛(wèi)生安全提供保障。前言 獸醫(yī)監(jiān)測診斷技術(shù)在動物疫病防控和獸醫(yī)公共衛(wèi)生工作提綱面臨的復(fù)雜形勢動物疫病診斷技術(shù)現(xiàn)狀 檢測技術(shù)發(fā)展方向與未來展望 提綱面臨的復(fù)雜形勢1面臨的復(fù)雜形勢 1面臨的復(fù)雜形勢 動物疫病種類多 農(nóng)業(yè)部一、二、三類動物疫病病種名錄中列入157種；其中一類17種；二類77種；三類63種。OIE陸生動物衛(wèi)生法典2010版中列入94種； 包括多種動物共患病26種；牛病14種； 綿羊和山羊病11種；馬病

2、11種；豬病8種；禽病14種； 兔病2種；蜂病6種；其他疫病2種。獸醫(yī)現(xiàn)代監(jiān)測診斷技術(shù)(終稿)新發(fā)動物疫病威脅國外威脅： 非洲豬瘟（俄羅斯）等；周邊省威脅：小反芻獸疫（西藏）、 口蹄疫A型（ 2008年湖北）等；新發(fā)亞型： 口蹄疫亞洲I型（2005年出現(xiàn)）等。新發(fā)動物疫病威脅國外威脅： 非洲豬瘟（俄羅斯）等；動物疫病病原型別多、變異快口蹄疫：7個型，多個亞型； 我國O型、亞洲I型（2005年4月傳入中國）、A型流感：A、B、C3個型； A型：H1H16亞型；H5亞型：變異株不斷出現(xiàn) 疫苗：-1、-4、-5株P(guān)RRS：1996年美洲型； 2006年變異株； 2009年歐洲型1株。另外，還有小反芻

3、獸疫（西藏）、瘋牛病、非洲豬瘟、尼帕病等外來重大疫病的威脅動物疫病病原型別多、變異快2010年列入國家監(jiān)測計劃的動物疫病（16種）高致病性禽流感、口蹄疫、高致病性藍耳病、豬瘟雞新城疫、布魯菌病、牛結(jié)核病、血吸蟲病、狂犬病牛海綿狀腦病、癢病、牛傳染性胸膜肺炎、牛瘟、小反芻獸疫、非洲豬瘟、藍舌病 國家強制免疫 動物疫病 外來動物疫病2010年列入國家監(jiān)測計劃的動物疫?。?6種）高致病性禽流感主要疫病的國家指定監(jiān)測方法病 名指定診斷方法口蹄疫正向間接血凝試驗、液相阻斷ELISA VP1-ELISA高致病性禽流感血凝抑制試驗（HI）豬瘟正向間接血凝試驗、阻斷ELISA高致病性豬藍耳病ELISA、雞新城

4、疫血凝抑制試驗（HI）布魯菌病虎紅平板試驗、試管凝集試驗血吸蟲病斑點ELISA、免疫金標(biāo)快速試紙條牛結(jié)核病結(jié)核菌素變態(tài)反應(yīng)試驗主要疫病的國家指定監(jiān)測方法病 名指定診斷方法口蹄疫正向地市級、縣級實驗室的適用試驗技術(shù)縣級實驗室地市級實驗室凝集試驗（高致病性禽流感、口蹄疫、豬瘟、新城疫等?。籈LISA（豬瘟、口蹄疫、高致病性藍耳病等?。┛h級實驗室開展的試驗技術(shù)RT-PCR技術(shù)（豬瘟，PRRS 等?。┑厥屑墶⒖h級實驗室的適用試驗技術(shù)凝集試驗（高致病性禽流感、口省內(nèi)診斷試劑使用的現(xiàn)狀 主要診斷試劑 提供單位有：蘭州獸醫(yī)研究所哈爾濱獸醫(yī)研究所豬瘟和口蹄疫O型正向間接血凝；口蹄疫型、 AsiaI和 O型液

5、相阻斷ELISA；3ABC-ELISA，VP1-ELISA；豬圓環(huán)病毒ELISA； 禽流感H5血凝抑制抗原； 雞新城疫血凝抑制抗原；其他：豬藍耳病ELISA法國進口； 豬偽狂犬、豬細小病毒ELISA荷蘭賽迪診斷公司； 豬藍耳病RT-PCR，豬乙型腦炎RT-PCR， 豬細小病毒PCR等北京愛德士元亨生物技術(shù)有限公司。省內(nèi)診斷試劑使用的現(xiàn)狀 主要診斷試劑豬瘟和口蹄疫O型正向間接疫苗種類各異、診斷試劑和方法多樣以口蹄疫為例 抗體檢測試劑品種 病原檢測試劑品種 正向間接血凝瓊脂凝膠免疫擴散試劑液相阻斷ELISA試劑盒非結(jié)構(gòu)蛋白ELISA試劑盒(3ABC)結(jié)構(gòu)蛋白ELISA試劑盒（VP1）免疫膠體金試劑

6、盒（測抗體）RT-PCR試劑盒熒光RT-PCR試劑盒ELISA試劑盒免疫膠體金試劑盒（測抗原）反向間接血凝試劑疫苗種類各異、診斷試劑和方法多樣以口蹄疫為例正向間接血凝國內(nèi)動物疫病診斷試劑存在的主要問題技術(shù)方法：標(biāo)準(zhǔn)? 各企業(yè)生產(chǎn)診斷試劑的的標(biāo)準(zhǔn)不一。診斷試劑：文號？ 302個產(chǎn)品中，有新獸藥證書產(chǎn)品7.6%，有生產(chǎn)批準(zhǔn)文號產(chǎn)品4.3%，列入標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品7%。法規(guī)管理：完善？ 市場秩序混亂：國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)不具有資質(zhì)、產(chǎn)品無新獸藥證書或批準(zhǔn)文號、 國外生產(chǎn)企業(yè)注冊生產(chǎn)的產(chǎn)品進入國內(nèi)未經(jīng)注冊、非法生產(chǎn)產(chǎn)品 產(chǎn)品質(zhì)量：不齊？ 1.質(zhì)量水平低，試驗特異性不高，產(chǎn)品保質(zhì)期短； 2.適用范圍窄，操作復(fù)雜； 3.生

7、產(chǎn)能力小，購買難； 4.檢測目的不明確（型/亞型、感染/免疫抗體等）。國內(nèi)動物疫病診斷試劑存在的主要問題技術(shù)方法：標(biāo)準(zhǔn)?國外動物疫病診斷試劑 進口獸用診斷試劑質(zhì)量好，但是成本高、購買周期長，有的不適合中國的實際情況。國外動物疫病診斷試劑國內(nèi)獸用診斷試劑問題之根源行業(yè)特點產(chǎn)品種類多，成分復(fù)雜，生命周期長，技術(shù)含量高，質(zhì)量要求嚴(yán)格，單位用量小投入資金巨大，產(chǎn)品開發(fā)周期長監(jiān)管措施不完善研發(fā)：基礎(chǔ)研究、高科技研究投入力度小，科研與生產(chǎn)脫節(jié)。生產(chǎn)、經(jīng)營：企業(yè)規(guī)模小、效率低、利潤低，發(fā)展不均衡，且部分沒有生產(chǎn)資質(zhì)；診斷試劑注冊審批程序繁瑣，進入市場門檻高。使用：盲目選擇診斷試劑，采購、驗收、保藏制度不健全

8、。產(chǎn)業(yè)化和商品化發(fā)展滯后，非法診斷試劑產(chǎn)品市場占有比例大。國內(nèi)獸用診斷試劑問題之根源行業(yè)特點研發(fā)：基礎(chǔ)研究、高科技研究動物疫病診斷試劑行業(yè)發(fā)展建議先進的產(chǎn)學(xué)研模式，提高自主創(chuàng)新能力，建設(shè)科研院所和企業(yè)的產(chǎn)業(yè)鏈 嚴(yán)格市場準(zhǔn)入完善的質(zhì)量監(jiān)控體系，進行規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化管理達到擴充獸用診斷試劑種類，提高產(chǎn)品質(zhì)量，滿足動物疫病監(jiān)測、診斷工作需要動物疫病診斷試劑行業(yè)發(fā)展建議2動物疫病診斷技術(shù)現(xiàn)狀2動物疫病診斷技術(shù)現(xiàn)狀常用實驗室檢測技術(shù)組織病理學(xué)檢測技術(shù)血清學(xué)檢測技術(shù)分子生物學(xué)檢測技術(shù)病原學(xué)檢測技術(shù)常用實驗室檢測技術(shù)組織病理學(xué)檢測技術(shù)組織病理學(xué)檢測技術(shù)1.病理學(xué)檢測技術(shù) 是利用疫病引起的動物組織發(fā)生特征性的病

9、變和病理變化對動物疫病進行診斷。2.免疫病理學(xué)檢測技術(shù)(免疫組織化學(xué)技術(shù)) 免疫組織化學(xué)方法不僅可在臟器組織中特異地檢出病原,又可發(fā)揮病理學(xué)檢測所具有直觀、抗原定位準(zhǔn)確的特點,還可在臟器組織原位檢測出病原（原位PCR）的同時，觀察到組織病變與該病原的關(guān)系，從而有助于了解疫病的發(fā)病機理和病理過程。組織病理學(xué)檢測技術(shù)1.病理學(xué)檢測技術(shù)血清學(xué)檢測技術(shù)按其反應(yīng)性質(zhì)的不同可分為：凝集性反應(yīng)(如凝集試驗和沉淀試驗) 標(biāo)記抗體技術(shù)(包括熒光抗體、酶標(biāo)抗體、放射性標(biāo)記抗體等 特點： 敏感、快速（ELISA 只需要12小時）。補體參與的反應(yīng)(補體結(jié)合試驗、免疫粘附血凝試驗等)。中和試驗(病毒中和試驗和毒素中和試

10、驗) 特點： 時間長，約需要18小時才能獲得結(jié)果。免疫轉(zhuǎn)印技術(shù)。血清學(xué)檢測技術(shù)按其反應(yīng)性質(zhì)的不同可分為：正向間接血凝診斷技術(shù)特點：正向間接血凝為一種微量的定量反應(yīng)試驗，其應(yīng)用廣泛，其無需昂貴的設(shè)備，操作簡單，并且有快速、敏感、特異性。操作要點及注意事項：A. 試驗準(zhǔn)備： 采集3只以上未免疫雞全血混合制紅細胞懸液； 選用孔底應(yīng)光潔透明無可見沉淀附著物的反應(yīng)板(一次性的最好)； 待檢血清要新鮮，未腐敗、溶血，無懸浮物。B. 操作過程：盡可能的保證樣品被全部加入反應(yīng)孔；每次滴加抗原前應(yīng)充分搖勻，從稀釋度高的孔開始加起，并避免滴頭和孔內(nèi)的液體直接接觸；避免稀釋時孔內(nèi)產(chǎn)生氣泡，直接影響結(jié)果判定。 C.

11、結(jié)果判定： 正確識別“+”的凝集現(xiàn)象。待檢樣品2待檢樣品1陽性對照陰性對照正向間接血凝診斷技術(shù)特點：正向間接血凝為一種微量的定量反應(yīng)試正向間接血凝反應(yīng)原理圖間接血凝抑制反應(yīng)原理示意圖紅細胞間接血凝反應(yīng)原理示意圖抗體致敏紅細胞正向間接血凝反應(yīng)原理圖間接血凝抑制反應(yīng)原理示意圖紅細胞間接血聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）具有靈敏度高、特異性強、快速、簡便、重復(fù)性好、安全、適合大批量標(biāo)準(zhǔn)化檢測的特點。是當(dāng)前應(yīng)用最廣、發(fā)展最快的一項新技術(shù)，目前該方法已被廣泛用于多種細菌和病毒等疾病的診斷。其基本過程是將抗原(或抗體)吸附于固相載體，在載體上進行免疫酶反應(yīng)，底物顯色后用分光光度計或酶標(biāo)儀判定結(jié)果。 其可分為以

12、下幾種方法：聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）原理及分類原理及分類常用的直接法ELISA（測抗體）常用的直接法ELISA（測抗體）分子生物學(xué)檢測技術(shù)用于動物疫病特異性快速診斷和病原基因變異與進化分析，及時準(zhǔn)確掌握動物疫病分子流行病學(xué)動態(tài)，為疫病防治提供基因理論分析依據(jù)。核酸探針技術(shù)、基因序列分析 比如基因芯片試劑盒。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）（應(yīng)用最廣） 疫病的早期診斷和不完整病原的檢測 快速、準(zhǔn)確、安全的檢測病原體 在病原體分類和鑒別中的應(yīng)用PCR儀基因芯片儀分子生物學(xué)檢測技術(shù)用于動物疫病特異性快速診斷和病原基因變異與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR) 是以DNA變性、復(fù)制的某些特性為原理設(shè)計的。通過PCR技術(shù)

13、獲取病原微生物的特異DNA片段，從而為疾病診斷提供重要依據(jù)。 特點：快速； 敏感； 步驟較多。 PCR反應(yīng)原理圖聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)PCR反應(yīng)原理圖反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)即RT-PCR技術(shù)。用于檢測RNA病毒。首先提取總RNA，然后加入引物在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA，加熱變性成為單鏈cDNA后，加入與之互補的另一引物，進行PCR反應(yīng)。分為一步法和兩步法兩種RTRT-PCR反應(yīng)原理圖反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)即RT-PCR技術(shù)。用于檢測RNA病毒。首先多重PCR技術(shù)(Multi-PCR） 它是一種特殊的PCR形式，其最突出的特點是一次PCR反應(yīng)在同一反應(yīng)體系中同時加入多對不同PCR引物和相應(yīng)的模板，可同

14、時檢測、鑒別出多種病原體，在臨床混合感染的鑒別診斷上具有其獨特優(yōu)勢和很高的實用價值。多重PCR技術(shù)(Multi-PCR）病原學(xué)檢測技術(shù)1.細菌的分離與鑒定2.病毒的分離與鑒定 是病毒性疫病檢測、診斷、流行病學(xué)調(diào)查和未知新病毒進行分類鑒定的重要方法之一。如，此法稱為檢測口蹄疫的黃金標(biāo)準(zhǔn)。但是對實驗室能力要求較高，且耗時長。3.寄生蟲檢測 寄生蟲病診斷中其定性的實質(zhì)性方法有以下幾種:蟲卵檢查法、蟲體檢查法、免疫學(xué)檢查法和分子生物學(xué)檢查法。病原學(xué)檢測技術(shù)1.細菌的分離與鑒定診斷新技術(shù)及應(yīng)用我國免疫預(yù)防為主的動物防疫政策，決定了在現(xiàn)實的動物疫病監(jiān)測工作中，迫切需要實用的對動物疫病病原的快速診斷技術(shù)以及

15、能區(qū)分免疫動物和自然感染動物的鑒別診斷技術(shù)。目前國內(nèi)符合上述要求的診斷新技術(shù)主要有以下3種: 1.免疫膠體金快速診斷試紙條 2. 熒光PCR 3. 鑒別診斷技術(shù) 4. 原位PCR技術(shù)診斷新技術(shù)及應(yīng)用我國免疫預(yù)防為主的動物防疫政策，決定了在現(xiàn)實免疫膠體金快速診斷試紙條特點：操作簡易，速度快快，10分鐘內(nèi)出結(jié)果，方便基層開展工作目前已經(jīng)有了口蹄疫、豬瘟、禽流感、血吸蟲等病的膠體金快速診斷試紙條。技術(shù)原理：試紙條的正面和側(cè)面免疫膠體金快速診斷試紙條特點：操作簡易，速度快快，10分鐘內(nèi)免疫層析快速檢測試紙結(jié)構(gòu)及原理免疫層析快速檢測試紙結(jié)構(gòu)及原理實時熒光定量PCR 與普通PCR相比：1. 自動化程度高，

16、極短的檢測時間（沒有了制膠和PCR產(chǎn)物電泳步驟，快速熱循環(huán)儀也縮減了運行時間，在30分鐘內(nèi)可以得到完美的實驗結(jié)果 ）；2. 敏感性為普通PCR的100倍；3. 直觀的軟件分析；4. 有效解決PCR污染問題；5. 安全性更好。6.不足：資金投入大， 檢測成本高。實時熒光定量PCR反應(yīng)軟件分析截圖實時熒光定量PCR儀實時熒光定量PCR 與普通PCR相比：實時熒光定量PCR反應(yīng)鑒別診斷技術(shù)鑒別診斷技術(shù)的重要性： A：區(qū)分自然感染抗體和疫苗免疫抗體的鑒別診斷技術(shù)； B：從普遍免疫的動物群體中甄別出自然感染和帶毒的動物。該項技術(shù)的核心是基因工程技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)與診斷技術(shù)的綜合運用，其科技水平高，研究

17、的難度葉較大。單克隆抗體技術(shù) 目前市場上已有部分利用單克隆抗體制備的金標(biāo)快速檢測卡和ELISA試劑盒 （比如豬瘟）。鑒別診斷技術(shù)鑒別診斷技術(shù)的重要性：原位PCR分子病理學(xué)新技術(shù)是一種將PCR技術(shù)與原位雜交技術(shù)結(jié)合起來的可以檢測組織細胞中微量DNA或RNA且可精確定位的新技術(shù)。特點：敏感度更高，優(yōu)于免疫組化技術(shù)。目前應(yīng)用情況：主要用于病毒檢測，也有檢測組織中寄生蟲感染的報道。原位PCR分子病理學(xué)新技術(shù)是一種將PCR技術(shù)與原位雜交技3檢測技術(shù)發(fā)展方向與未來展望3檢測技術(shù)發(fā)展方向與未來展望血清學(xué)檢測技術(shù)發(fā)展方向簡單、快速便于普及的快速診斷技術(shù) 以膠體金標(biāo)記技術(shù)為代表，操作簡單、快捷，實現(xiàn)現(xiàn)地現(xiàn)用。高度集成、自動化的儀器診斷技術(shù) 以ELISA（全自動酶免工作站）為代表，可實現(xiàn)大規(guī)模操作，且靈敏度高、特異性強。血清學(xué)檢測技術(shù)發(fā)展方向簡單、快速便于普及的快速診斷技術(shù)分子檢測技術(shù)的發(fā)展方向自動化 利用全自動儀器完成核酸提取、反應(yīng)液配制、上機反應(yīng)和結(jié)果分析的所有步驟多功能新型生物液體處理工作站：可以一機實現(xiàn)DNA/ RNA提取和PCR反應(yīng)建立 實時熒光定量PCR儀：可以一機實現(xiàn)上機反應(yīng)和結(jié)果分析分子檢測技術(shù)的發(fā)展方向自動化多功能新型生物液體處理工作站：可高通量