酶切與連接課件

1、酶切與連接 核酸酶：通過切割相鄰的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵，從而導致核酸分子多核核苷酸鏈發(fā)生水解斷裂的蛋白酶。 分兩類：1 核酸外切酶，從核酸鏈的一端逐個水解核甘酸的核酸酶。 2 核酸內切酶，能夠水解核酸分子內磷酸二酯鍵的核酸酶。 一 核酸限制性內切酶與DNA分子的體外切割1簡介 核酸限制性內切酶：是一種在特殊核甘酸序列處水解雙鏈DNA的內切酶 ，簡稱限制性酶。限制性酶分三型：、 型酶結合于識別位點并隨機的切割識別位點不遠處的DNA，而型酶在識別位點上切割DNA分子,然后從底物上解離。型限制酶的限制修飾系統(tǒng)分別由限制酶和修飾酶兩種不同的酶組成，它切割某一特異的核苷酸序列; 另一種為獨立的甲基

2、化酶,它修飾同一識別序列。 限制修飾系統(tǒng)簡稱 R/M系統(tǒng) restriction modification類似于免疫體系，他能夠識別自己的DNA和外來的DNA，并使外來的DNA降解。由兩種酶來控制：修飾的甲基轉移酶和核酸限制性內切酶。當外源的含有限制性酶特定位點的核酸進入細胞時，相應的核酸限制性酶就會將其解。但是菌體內的很多核酸也同樣含有這樣的序列，這時特異的甲基化酶就起作用了。甲基化酶在內源的部分核酸還沒被限制以前就被甲基化了，這種甲基化核酸序列是限制性酶無法作用的。2型限制性內切酶的基本特性型限制性內切酶的識別序列通常由48個堿基對組成，它們具有二重旋轉對稱軸，這些堿基對的序列呈回文結構。

3、所以限制酶切割DNA后，均產生含5磷酸基和3羥基的末端。限制酶作用所產生的DNA片段有以下兩種形式：（1）形成黏性末端 不在識別序列的對稱軸上切割，而是交錯切割結果形成的DNA限制片段具有黏性末端。例如，Hind 切割結果形成5單鏈突出的粘性末端；而Pst 切割結果卻形成3單鏈突出的粘性末端。（2）形成平末端 有些限制酶在識別序列的對稱軸上切割，形成的DNA片段具有平末端。例如Hpa切割結果形成平末端。Hind 的識別序列是： Hpa的識別序列是：5A AGCT T3 5G TTAA C33T TCGA A5 3C AATT G5（3）限制片斷末端的連接作用 許多種限制酶切割DNA分子形成的短

4、片斷能夠自發(fā)的重新環(huán)化起來。如果環(huán)化分子加熱后又會重新線性化。但是，如果馬上使用連接酶處理，使他們的3OH基團和5P基團之間封閉起來，環(huán)化就是永久的了。連接分為：分子間連接和分子內連接。 相連后，其序列變?yōu)镚GATCT CCTAGA， 與原來兩個限制酶的識別序列均不相同，因此不再為原來的酶所切割。3. 影響核酸限制性內切酶活性的因素 （1）DNA 純度 （2）DNA甲基化的程度 （3）酶切消化反應溫度 （4）DNA的分子結構 （5）限制性內切酶的緩沖液 （1）DNA 純度污染在DNA制劑中的某些物質，例如：蛋白質、酚、酒精、異丙醇、EDTA、高鹽離子等。所以 在純化過程中，空摔一定要時間充足，

5、要徹底；用微堿的TE洗脫；提高限制內切酶的用量；延長酶切時間；擴大酶切體積，使?jié)撛诘囊种埔蛩乇幌鄳南♂尅＃? ）限制性內切酶的緩沖液緩沖液一般的組成部分包括：氯化鎂、Tris-Hcl,巰基乙醇或者二硫蘇糖醇（DTT），牛血清蛋白（BSA）等。適合的二價金屬離子濃度,通常為Mg離子。 適合的PH 通常為7.4左右。限制性內切酶的星號活性類限制酶雖然識別和切割的序列都是有特異性，但是這種特異性受特定條件的限制，即在一定條件下表現(xiàn)出來的特異性。條件的改變，限制酶的特異性就會松動，識別的序列和切割都有一些改變，改變后的活性通常稱的二活性，而將這種因條件的改變會出現(xiàn)第二活性的酶右上角角一個星號表示，因

6、此第二活性又稱星號活性。概括起來，誘導星號的因素有以下幾種：1,高甘油含量(5%,v/v);2,限制性內切酶用量過高(100u/ug DNA)；3,低離子強度(25mmol/L);4,高ph(8.0以上)；5,含有機溶劑，如DMSD,乙醇等，6,有非Mg2+的二價陽離子存在(如Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+等）二、DNA連接酶與DNA分子的體外連接 核酸限制性內切酶將DNA分子切割為不同大小的片斷，然而要將不同來源的DNA片斷組成新的雜種DNA分子，還必須將他們彼此連接并且封閉起來。1DNA連接酶能夠催化兩個雙鏈DNA片段相鄰的5端磷酸與3端羥基之間形成磷酸二酯鍵。它既能催化雙鏈DNA

7、中單鏈切口的封閉，也能催化兩個雙鏈DNA片段進行連接，是一種吸能反應，需要能源物質NAD+或者ATP。DNA連接酶并不能連接兩條單鏈的DNA，被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分。即封閉DNA缺口上的缺口 nick，而不能封閉裂口gap 。DNA連接酶主要有兩種：一種是T4DNA連接酶，另一種是大腸桿菌DNA連接酶。2幾種連接方式 A 用粘性末端DNA片斷的連接 B 平端DNA片斷的連接A 用粘性末端DNA片斷的連接用特定限制性內切酶酶切過的質粒載體與以相同酶酶切過的具有粘性末端的DNA片斷連接。載體可能自發(fā)的環(huán)化，這時可以用堿性磷酸酶處理酶切過的質粒載體，移去末端的5磷酸基團，這樣

8、質粒載體就不能自發(fā)的環(huán)化了。而DNA片斷在與這種載體連接后，會留下一個3-OH和5-OH的缺口，這種情況下仍然可以導入宿主菌。這種分子在宿主菌中完成缺口的修復。B 平端DNA片斷的連接（1） 直接用T4ligase連接（2） 同聚物加尾法（3） 銜接物連接法（1）直接用T4ligase連接提高平末端連接效率常用措施提高T4DNA連接酶濃度；提高DNA片段濃度；降低ATP濃度，以增強連接酶與DNA的結合；加入多胺化合物，如亞精胺，降低DNA的靜電排斥力；加濃縮劑，如大分子排阻物聚乙二醇（PEG）、強水化物三氯化六鈷等。（2）同聚物加尾法末端脫氧核苷酸轉移酶，它能夠將核苷酸加到 DNA分子單鏈延伸末端的3-OH基團上。當只加入DNA，dATP和末端脫氧核苷酸混合反應物時 產生poly A的尾巴。 加入dTTP 產生poly T尾巴。 這樣兩個用互補基團延伸過的DNA和載體，就能連接在一起（相當于有了個粘末端）。（3） 銜接物連接法銜接物：指合成的兩條互補