酶切與連接課件

1、酶切與連接 核酸酶：通過切割相鄰的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵，從而導(dǎo)致核酸分子多核核苷酸鏈發(fā)生水解斷裂的蛋白酶。 分兩類：1 核酸外切酶，從核酸鏈的一端逐個(gè)水解核甘酸的核酸酶。 2 核酸內(nèi)切酶，能夠水解核酸分子內(nèi)磷酸二酯鍵的核酸酶。 一 核酸限制性內(nèi)切酶與DNA分子的體外切割1簡介 核酸限制性內(nèi)切酶：是一種在特殊核甘酸序列處水解雙鏈DNA的內(nèi)切酶 ，簡稱限制性酶。限制性酶分三型：、 型酶結(jié)合于識別位點(diǎn)并隨機(jī)的切割識別位點(diǎn)不遠(yuǎn)處的DNA，而型酶在識別位點(diǎn)上切割DNA分子,然后從底物上解離。型限制酶的限制修飾系統(tǒng)分別由限制酶和修飾酶兩種不同的酶組成，它切割某一特異的核苷酸序列; 另一種為獨(dú)立的甲基

2、化酶,它修飾同一識別序列。 限制修飾系統(tǒng)簡稱 R/M系統(tǒng) restriction modification類似于免疫體系，他能夠識別自己的DNA和外來的DNA，并使外來的DNA降解。由兩種酶來控制：修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶和核酸限制性內(nèi)切酶。當(dāng)外源的含有限制性酶特定位點(diǎn)的核酸進(jìn)入細(xì)胞時(shí)，相應(yīng)的核酸限制性酶就會(huì)將其解。但是菌體內(nèi)的很多核酸也同樣含有這樣的序列，這時(shí)特異的甲基化酶就起作用了。甲基化酶在內(nèi)源的部分核酸還沒被限制以前就被甲基化了，這種甲基化核酸序列是限制性酶無法作用的。2型限制性內(nèi)切酶的基本特性型限制性內(nèi)切酶的識別序列通常由48個(gè)堿基對組成，它們具有二重旋轉(zhuǎn)對稱軸，這些堿基對的序列呈回文結(jié)構(gòu)。

3、所以限制酶切割DNA后，均產(chǎn)生含5磷酸基和3羥基的末端。限制酶作用所產(chǎn)生的DNA片段有以下兩種形式：（1）形成黏性末端 不在識別序列的對稱軸上切割，而是交錯(cuò)切割結(jié)果形成的DNA限制片段具有黏性末端。例如，Hind 切割結(jié)果形成5單鏈突出的粘性末端；而Pst 切割結(jié)果卻形成3單鏈突出的粘性末端。（2）形成平末端 有些限制酶在識別序列的對稱軸上切割，形成的DNA片段具有平末端。例如Hpa切割結(jié)果形成平末端。Hind 的識別序列是： Hpa的識別序列是：5A AGCT T3 5G TTAA C33T TCGA A5 3C AATT G5（3）限制片斷末端的連接作用 許多種限制酶切割DNA分子形成的短

4、片斷能夠自發(fā)的重新環(huán)化起來。如果環(huán)化分子加熱后又會(huì)重新線性化。但是，如果馬上使用連接酶處理，使他們的3OH基團(tuán)和5P基團(tuán)之間封閉起來，環(huán)化就是永久的了。連接分為：分子間連接和分子內(nèi)連接。 相連后，其序列變?yōu)镚GATCT CCTAGA， 與原來兩個(gè)限制酶的識別序列均不相同，因此不再為原來的酶所切割。3. 影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素 （1）DNA 純度 （2）DNA甲基化的程度 （3）酶切消化反應(yīng)溫度 （4）DNA的分子結(jié)構(gòu) （5）限制性內(nèi)切酶的緩沖液 （1）DNA 純度污染在DNA制劑中的某些物質(zhì)，例如：蛋白質(zhì)、酚、酒精、異丙醇、EDTA、高鹽離子等。所以 在純化過程中，空摔一定要時(shí)間充足，

5、要徹底；用微堿的TE洗脫；提高限制內(nèi)切酶的用量；延長酶切時(shí)間；擴(kuò)大酶切體積，使?jié)撛诘囊种埔蛩乇幌鄳?yīng)的稀釋。（5 ）限制性內(nèi)切酶的緩沖液緩沖液一般的組成部分包括：氯化鎂、Tris-Hcl,巰基乙醇或者二硫蘇糖醇（DTT），牛血清蛋白（BSA）等。適合的二價(jià)金屬離子濃度,通常為Mg離子。 適合的PH 通常為7.4左右。限制性內(nèi)切酶的星號活性類限制酶雖然識別和切割的序列都是有特異性，但是這種特異性受特定條件的限制，即在一定條件下表現(xiàn)出來的特異性。條件的改變，限制酶的特異性就會(huì)松動(dòng)，識別的序列和切割都有一些改變，改變后的活性通常稱的二活性，而將這種因條件的改變會(huì)出現(xiàn)第二活性的酶右上角角一個(gè)星號表示，因

6、此第二活性又稱星號活性。概括起來，誘導(dǎo)星號的因素有以下幾種：1,高甘油含量(5%,v/v);2,限制性內(nèi)切酶用量過高(100u/ug DNA)；3,低離子強(qiáng)度(25mmol/L);4,高ph(8.0以上)；5,含有機(jī)溶劑，如DMSD,乙醇等，6,有非Mg2+的二價(jià)陽離子存在(如Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+等）二、DNA連接酶與DNA分子的體外連接 核酸限制性內(nèi)切酶將DNA分子切割為不同大小的片斷，然而要將不同來源的DNA片斷組成新的雜種DNA分子，還必須將他們彼此連接并且封閉起來。1DNA連接酶能夠催化兩個(gè)雙鏈DNA片段相鄰的5端磷酸與3端羥基之間形成磷酸二酯鍵。它既能催化雙鏈DNA

7、中單鏈切口的封閉，也能催化兩個(gè)雙鏈DNA片段進(jìn)行連接，是一種吸能反應(yīng)，需要能源物質(zhì)NAD+或者ATP。DNA連接酶并不能連接兩條單鏈的DNA，被連接的DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分。即封閉DNA缺口上的缺口 nick，而不能封閉裂口gap 。DNA連接酶主要有兩種：一種是T4DNA連接酶，另一種是大腸桿菌DNA連接酶。2幾種連接方式 A 用粘性末端DNA片斷的連接 B 平端DNA片斷的連接A 用粘性末端DNA片斷的連接用特定限制性內(nèi)切酶酶切過的質(zhì)粒載體與以相同酶酶切過的具有粘性末端的DNA片斷連接。載體可能自發(fā)的環(huán)化，這時(shí)可以用堿性磷酸酶處理酶切過的質(zhì)粒載體，移去末端的5磷酸基團(tuán)，這樣

8、質(zhì)粒載體就不能自發(fā)的環(huán)化了。而DNA片斷在與這種載體連接后，會(huì)留下一個(gè)3-OH和5-OH的缺口，這種情況下仍然可以導(dǎo)入宿主菌。這種分子在宿主菌中完成缺口的修復(fù)。B 平端DNA片斷的連接（1） 直接用T4ligase連接（2） 同聚物加尾法（3） 銜接物連接法（1）直接用T4ligase連接提高平末端連接效率常用措施提高T4DNA連接酶濃度；提高DNA片段濃度；降低ATP濃度，以增強(qiáng)連接酶與DNA的結(jié)合；加入多胺化合物，如亞精胺，降低DNA的靜電排斥力；加濃縮劑，如大分子排阻物聚乙二醇（PEG）、強(qiáng)水化物三氯化六鈷等。（2）同聚物加尾法末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶，它能夠?qū)⒑塑账峒拥?DNA分子單鏈延伸末端的3-OH基團(tuán)上。當(dāng)只加入DNA，dATP和末端脫氧核苷酸混合反應(yīng)物時(shí) 產(chǎn)生poly A的尾巴。 加入dTTP 產(chǎn)生poly T尾巴。 這樣兩個(gè)用互補(bǔ)基團(tuán)延伸過的DNA和載體，就能連接在一起（相當(dāng)于有了個(gè)粘末端）。（3） 銜接物連接法銜接物：指合成的兩條互補(bǔ)