p16蛋白對(duì)喉癌生長(zhǎng)的抑制和對(duì)自然殺傷細(xì)胞抗腫瘤免疫的調(diào)控

1、16 蛋白對(duì)喉癌生長(zhǎng)的抑制和對(duì)自然殺傷細(xì)胞抗腫瘤免疫的調(diào)控喉癌 (laryngeal carcinoma)是常見的頭頸部惡性腫瘤, 其主要的病理類型為鱗狀細(xì)胞癌。近年來(lái) , 喉癌的發(fā)病率明顯增加 , 吸煙、飲酒、環(huán)境因素、放射線、病毒感染以及微量元素的缺乏, 常常通過(guò)多種途徑、多個(gè)階段以及多種分子因素的綜合作用 , 而導(dǎo)致喉癌的發(fā)生。目前 , 喉癌主要的治療方案仍以手術(shù)治療和放射治療為主, 其他還有化療、免疫治療、基因治療、中醫(yī)治療等綜合措施。喉癌的有效治療應(yīng)是：最大程度的根除腫瘤 , 保全喉的功能 , 保證患者的生存率 , 同時(shí)提高生存質(zhì)量。近年來(lái)隨著各地診療水平的提高, 電子喉鏡檢查以及早

2、期局部活檢, 可使喉癌患者的生存率得到較大的提高。 即便如此 , 仍有許多患者預(yù)后不佳 , 手術(shù)復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)有發(fā)生。因此 , 探尋安全、有效、毒副作用小的治療道路 , 依舊任重而道遠(yuǎn)。 惡性腫瘤細(xì)胞最大的特點(diǎn)是正常生長(zhǎng)調(diào)控系統(tǒng)對(duì)其失去控制, 能不斷地分裂與增殖 , 具有“不死性”。因此 , 對(duì)腫瘤治療的重點(diǎn)是抑制其增殖, 促進(jìn)其死亡。腫瘤的發(fā)生常涉及多個(gè)抑癌基因的突變、磷酸化或失活。將正常腫瘤抑制基因?qū)肽[瘤細(xì)胞以替代失去功能的基因, 從而可以達(dá)到逆轉(zhuǎn)其惡性表型、抑制腫瘤生長(zhǎng) , 甚至消滅腫瘤的目的 , 是腫瘤基因治療的熱點(diǎn)。 p16基因是人體內(nèi)重要的腫瘤抑制基因, 該基因的突變和缺失與包

3、括頭頸癌在內(nèi)的多種腫瘤密切相關(guān) , 恢復(fù)野生型 p16 蛋白的功能成為抗腫瘤基因治療研究的重要途徑。P16蛋白是一種周期依賴性蛋白激酶抑制劑, 直接或間接調(diào)控細(xì)胞周期, 使細(xì)胞周期停滯于G1期 , 而且它還具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。因此本課題將研究 p16 蛋白對(duì)人喉癌細(xì)胞系 Hep-2 生長(zhǎng)的影響 , 并從細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期兩個(gè)方面進(jìn)行機(jī)制探討。自然殺傷細(xì)胞 (naturalkillercell,NK)是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分,無(wú)需預(yù)先致敏即可識(shí)別和殺傷靶細(xì)胞, 是機(jī)體抗腫瘤免疫防御的第一道防線。由于 NK細(xì)胞的殺傷活性受到細(xì)胞表面受體和細(xì)胞因子等多種分子的調(diào)控 , 在機(jī)體免疫系統(tǒng)中發(fā)

4、揮抗腫瘤作用。而同時(shí) , 腫瘤細(xì)胞可通過(guò)表達(dá)免疫抑制因子或表面配體等途經(jīng)反過(guò)來(lái)調(diào)節(jié)或抑制 NK細(xì)胞的功能 , 負(fù)性調(diào)節(jié)機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答 , 從而造成免疫逃逸的環(huán)境。近年來(lái) , 已有證據(jù)表明導(dǎo)入 p16 基因的腫瘤細(xì)胞其細(xì)胞表面分子的表達(dá)和細(xì)胞因子的分泌都會(huì)發(fā)生一定的改變 , 這可能有助于改變腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸狀態(tài)。因此 , 本研究還將初步探討 Hep-2 細(xì)胞的 p16 蛋白導(dǎo)入與機(jī)體 NK細(xì)胞抗腫瘤作用之間的關(guān)系 , 為 p16 作為腫瘤治療靶點(diǎn)的應(yīng)用提供更為詳實(shí)的理論依據(jù)。研究目的 1. 擴(kuò)增攜帶野生型 p16 基因的重組腺病毒載體 , 并導(dǎo)入人喉癌細(xì)胞 Hep-2中 , 觀察 p16

5、 蛋白的表達(dá)情況。觀察表達(dá)野生型 p16 蛋白的人喉癌 Hep-2 細(xì)胞的增殖情況 , 并從細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期兩方面探討其作用機(jī)制。 3. 初步探討表達(dá)野生型 p16 的人喉癌 Hep-2細(xì)胞對(duì) NK細(xì)胞殺傷敏感性的變化 , 同時(shí)觀察該細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞殺傷活性的調(diào)控作用。研究方法第一部分重組腺病毒載體的擴(kuò)增及其感染喉癌細(xì)胞Hep-2 后 p16蛋白的表達(dá)情況利用人胚腎細(xì)胞系HEK-293擴(kuò)增攜帶野生型 p16基因的重組腺病毒載體；采用 293 細(xì)胞空斑試驗(yàn)測(cè)定重組腺病毒的滴度；重組腺病毒感染Hep-2細(xì)胞后 , 采用流式細(xì)胞術(shù)和Western blot法檢測(cè) p16 蛋白的表達(dá)情況。 第二部分野

6、生型 p16 蛋白對(duì)人喉癌細(xì)胞Hep-2 體外生長(zhǎng)和體內(nèi)生長(zhǎng)的影響采用CCK8法檢測(cè) p16 蛋白對(duì) Hep-2 細(xì)胞增殖的影響；流式細(xì)胞儀檢測(cè) p16 蛋白對(duì) Hep-2 細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期的影響； 采用電子顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)； 采用 Q-PCR法檢測(cè)相關(guān)細(xì)胞凋亡蛋白和細(xì)胞周期蛋白的基因表達(dá)情況； Hep-2 細(xì)胞接種于裸鼠背部皮下 , 采用重組腺病毒瘤內(nèi)注射的方式觀察 p16 蛋白體內(nèi)抑瘤作用；采用Tunnel 法檢測(cè)瘤體組織的細(xì)胞凋亡情況。第三部分野生型 p16 蛋白對(duì)人喉癌細(xì)胞Hep-2 與 NK細(xì)胞之間相互作用的影響采用 CCK8法檢測(cè) p16 導(dǎo)入后喉癌 Hep-2 細(xì)胞對(duì)

7、 NK細(xì)胞殺傷敏感性的情況； 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) p16 導(dǎo)入后 Hep-2 細(xì)胞表面 NK活化受體配體的表達(dá)情況； qRT-PCR檢測(cè) p16 導(dǎo)入后 Hep-2 細(xì)胞 IL-6 、IFN- 、 IL-10 和 TGF- 的基因表達(dá)情況；ELISA 檢測(cè) p16 導(dǎo)入后 Hep-2 培養(yǎng)上清中 TGF-的分泌情況； p16 蛋白導(dǎo)入后Hep-2 細(xì)胞培養(yǎng)上清孵育 NKL細(xì)胞 ,CCK8法檢測(cè)該 NKL對(duì) Hep-2 細(xì)胞的殺傷情況；采用添加或阻斷的 TGF-方式 , 確認(rèn) Hep-2 細(xì)胞培養(yǎng)上清的 TGF- 是否參與了對(duì)NK細(xì)胞殺傷功能的調(diào)節(jié)作用。研究結(jié)果第一部分重組腺病毒載體的擴(kuò)增及其感染人

8、喉癌細(xì)胞 Hep-2 后 p16 蛋白的表達(dá)情況1. 利用 HEK-293細(xì)胞擴(kuò)增重組腺病毒載體后 , 采用 293 細(xì)胞空斑試驗(yàn)測(cè)定重組腺病毒的滴度,Ad-p16 的滴度為 6.51010, Ad-LacZ 的滴度為 4.8 1010。流式細(xì)胞儀檢測(cè) p16 蛋白表達(dá)的結(jié)果顯示 ,Ad-p16 組 Hep-2 細(xì)胞感染重組腺病毒 3h、6h、 12h 和 24h 時(shí) p16 蛋白的表達(dá)率分別為 29.5%、85.0%、92.7%和95.4%。未感染 Ad-p16 組的 Hep-2 細(xì)胞中無(wú) p16 蛋白表達(dá)。Western blot 檢測(cè)結(jié)果也顯示 Ad-p16 感染的 Hep-2 有明顯

9、p16 蛋白的表達(dá)。第二部分野生型 p16 蛋白對(duì)人喉癌細(xì)胞 Hep-2 體外生長(zhǎng)和體內(nèi)生長(zhǎng)的影響1.Hep-2 細(xì)胞感染重組腺病毒24h,48h,72h,96h后 ,Ad-p16 組 Hep-2 細(xì)胞的增殖抑制率分別為 3.003% 0.497(24h),12.031% 1.946(48h) 、 24.857%1.473(72h) 和 30.35% 1.916(96h),與 Ad-LacZ 比較 , 均有顯著性差異； 2. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 ,Ad-p16 組 Hep-2 細(xì)胞凋亡率從 24h 的 9.99%增加到26.98%(48h) 和 37.87%(72h), 在 Ad-Lac

10、Z 組和 Ad-p16 組之間進(jìn)行比較 , 細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)率 24h 時(shí)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 , 但 48h 和 72h 有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異； 3. 電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn) Ad-p16 感染的細(xì)胞染色質(zhì)濃縮和明顯的凋亡小體。而 Ad-LacZ 感染的 Hep-2 細(xì)胞少見染色質(zhì)濃縮和凋亡小體。4. 與 Ad-LacZ比較 ,Ad-p16 感染 Hep-2 細(xì)胞后 24h, 使其 G0/G1期細(xì)胞明顯增加 (48.36%),S 期細(xì)胞明顯減少 (38.26%), 而 G2/M期細(xì)胞無(wú)明顯變化； 5. 與 Ad-LacZ 組比較 , 促凋亡基因 p53、Caspase-8 和 Bak 在 Ad-p16 組的

11、表達(dá)上調(diào) , 抑凋亡基因 Survivin和 bcl-2 的表達(dá)下調(diào) , 均具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異, 而 Bcl-xl的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；6. 與 Ad-LacZ 組相比較 , 細(xì)胞周期蛋白 p21 和 cyclinDl基因在 Ad-p16 組的表達(dá)上調(diào) , 有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 , 而 E2F2和 CDK4基因的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異； 7. 裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示untreated組及 Ad-LacZ 組小鼠腫瘤生長(zhǎng)迅速 , 且體積與時(shí)間呈一定線性關(guān)系 , 兩組在各時(shí)間點(diǎn)瘤體體積對(duì)比, 均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與 Ad-LacZ 組比較 ,Ad-p16 治療組的腫瘤體積在12 天前均無(wú)統(tǒng)計(jì)差異 , 但 16

12、天開始 , 腫瘤生長(zhǎng)緩慢 , 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 , 且 24 天出現(xiàn)腫瘤生長(zhǎng)消退的趨勢(shì)；8.喉癌 Hep-2 細(xì)胞移植瘤組織 Tunnel 染色結(jié)果顯示 ,untreated組 Tunnel 陽(yáng)性細(xì)胞百分率為 30.56%1.842, Ad-LacZ組為 34.44%2.572,Ad-p16 組為 71.78% 3.244, 可見 Ad-p16 組腫瘤組織的凋亡程度明顯增高, 與 Ad-LacZ 組比較 ,p0.0001 。第三部分野生型 p16 蛋白對(duì)人喉癌細(xì)胞 Hep-2 與 NK細(xì)胞之間相互作用的影響 1. 用 CCK8法檢測(cè) NK細(xì)胞對(duì) Hep-2 細(xì)胞的殺傷率 , 結(jié)果顯示 , 與Ad

13、-LacZ 組對(duì)比 , 不同效靶比的條件下 ,NK 細(xì)胞對(duì) Ad-p16 組 Hep-2 細(xì)胞的殺傷效率均有不同程度的提高 , 且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異； 2. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,Ad-p16組 Hep-2 細(xì)胞表面 NK細(xì)胞活化性受體 NKG2D的配體 MICA/B和 ULBP2的表達(dá)均上調(diào) , 與 Ad-LacZ 比較 , 均具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異； 3. 采用 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示 ,表達(dá) p16 的 Hep-2 細(xì)胞可下調(diào) IL-10 、TGF- 和 IL-6 的基因表達(dá) , 上調(diào) IFN- 的基因表達(dá) , 與 Ad-LacZ 比較 , 均具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；4. ELISA 檢測(cè)

14、結(jié)果顯示 ,Ad-p16 組培養(yǎng)上清中 TGF-p的濃度低于另外兩組 , 且具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；用不同組 Hep-2 培養(yǎng)上清孵育 NKL細(xì)胞后 , 按照效靶比 4：1 的比例 , 利用 CCK8法檢測(cè) NKL的殺傷活性。結(jié)果顯示 , 單純 Hep-2 細(xì)胞培養(yǎng)上清孵育后的NKL細(xì)胞殺傷 Hep-2 細(xì)胞的效率為 44.80%1.277,Ad-LacZ 處理組的為 44.43%1.241, 二者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而 Ad-p16 組的為 77.10%1.850, 與 Ad-LacZ 組比較 ,p0.0001。Ad-LacZ 組培養(yǎng)上清添加 anti-TGF- Ab 以阻斷 TGF-的作用 ,

15、 結(jié)果顯示 , 阻斷后 NK細(xì)胞的殺傷活性由 44.43%1.241 增加到 58.33%1.525, 且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Ad-p16 組培養(yǎng)上清補(bǔ)充 TGF-蛋白 , 結(jié)果顯示 , 補(bǔ)充后 NK細(xì)胞的殺傷活性由 77.10%1.850 減少到 58.73%2.554, 且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究結(jié)論 1. 人喉癌細(xì)胞系 Hep-2 細(xì)胞缺失 p16 蛋白的表達(dá) , 而重組腺病毒Ad-p16 感染 Hep-2 細(xì)胞后 ,p16 蛋白在該細(xì)胞的表達(dá)率可高達(dá)95%左右 , 補(bǔ)充了Hep-2 細(xì)胞缺失的 p16 蛋白 , 重組腺病毒 Ad-p16 可為下一步的實(shí)驗(yàn)研究提供良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。2. 野生型 p

16、16 蛋白在 Hep-2 細(xì)胞的表達(dá)可使該細(xì)胞體內(nèi)外的生長(zhǎng)均受到抑制；野生型 p16 蛋白可使 Hep-2 細(xì)胞停滯于 G0/G1期, 減少細(xì)胞進(jìn)入 S 期,說(shuō)明 p16 蛋白可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期來(lái)發(fā)揮其抑瘤作用；野生型p16 蛋白可促進(jìn)Hep-2 細(xì)胞的凋亡 , 且呈時(shí)間依賴性； 電子顯微鏡顯示存在經(jīng)典的細(xì)胞凋亡形態(tài)；移植瘤組織 Tunnel 染色也顯示 p16 蛋白可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡, 表明 p16 蛋白促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡是其發(fā)揮抑瘤作用的另一機(jī)制。野生型 p16 蛋白在 Hep-2 細(xì)胞的表達(dá) , 一方面 , 引起 Hep-2 細(xì)胞高表達(dá)NKG2D配體 , 使其對(duì) NK細(xì)胞的殺傷敏感性增加； 另一方面 ,Hep-2 細(xì)胞中細(xì)