DNA合成講解課件

1、中心法則(central dogma)闡述了生物世代、個(gè)體以及從遺傳物質(zhì)到性狀的遺傳信息流向，即遺傳信息在遺傳物質(zhì)復(fù)制、性狀表現(xiàn)過(guò)程中的信息流向1956年由Crick提出；1970年，發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象。中心法則(central dogma)第二章 DNA的生物合成第一節(jié) DNA復(fù)制的基本特征 以親代DNA為模板，按照堿基配對(duì)原則合成兩個(gè)子代DNA拷貝，稱為DNA復(fù)制（DNA replication）復(fù)制的基本條件dNTPs底物寡核苷酸引物單鏈DNA模板DNA聚合酶Mg2+ 生成3,5-磷酸二酯鍵；合成方向53；一、半保留復(fù)制半保留復(fù)制(semiconservative replication)D

2、NA在復(fù)制時(shí)，兩條親代DNA鏈解開，分別作為模板，按照堿基配對(duì)原則指導(dǎo)合成新的互補(bǔ)鏈，最后形成兩個(gè)與親代DNA相同的子代DNA分子，每個(gè)子代DNA分子都含有一股親代DNA鏈和一股新生DNA鏈。DNA復(fù)制假設(shè)三種情況半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)證明細(xì)胞生長(zhǎng)在N15 標(biāo)記培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)入正常N14源培養(yǎng)基中分離各代DNA分析各代DNA的浮力密度 CsCL密度梯度離心 浮力密度 N15DNA 1.742g/ml N15-N14DNA 1.717g/ml N14DNA 1.710g/mlDNA半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)證據(jù)1958 年Meselson和 Stahl的實(shí)驗(yàn)同位素14N代替15N，CsCl離心0N15DNA（重鏈）

3、N14DNA輕鏈雜交鏈321二、從復(fù)制起點(diǎn)雙向復(fù)制復(fù)制起始點(diǎn) DNA的復(fù)制總是開始于某一特定的位置，復(fù)制起點(diǎn)長(zhǎng)度為幾十至幾百bp，富含A-T。復(fù)制子和復(fù)制叉從一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)引發(fā)復(fù)制的全部DNA序列稱為一個(gè)復(fù)制子（replicon）；是DNA復(fù)制時(shí)的復(fù)制單位；DNA復(fù)制時(shí)在解鏈點(diǎn)形成分叉結(jié)構(gòu)，即復(fù)制叉（relication fork）。復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)：富含A-T區(qū)域經(jīng)常處于開放和閉合的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，產(chǎn)生瞬時(shí)單鏈。原核生物：?jiǎn)螐?fù)制子，即整個(gè)染色體只有一個(gè)復(fù)制單位真核生物：多復(fù)制子， 即一個(gè)基因組中有多個(gè)復(fù)制單位復(fù)制叉起始點(diǎn)起始點(diǎn)起始點(diǎn)復(fù)制叉復(fù)制叉未復(fù)制DNA單向復(fù)制雙向復(fù)制環(huán)狀 DNA復(fù)制時(shí)所形成

4、的結(jié)構(gòu)起始點(diǎn)復(fù)制叉的推進(jìn)三、半不連續(xù)復(fù)制在一個(gè)復(fù)制叉的兩股DNA模板中，有一股模板的解鏈方向（35）與新生鏈的合成方向（ 53 ）一致，這條新生鏈的合成連續(xù)進(jìn)行。另一股模板的解鏈方向（ 5 3）與新生鏈的合成方向（ 53 ）一致，這條新生鏈的合成無(wú)法連續(xù)進(jìn)行，而是先按照53方向合成小的片段（岡崎片段），然后再將其連接成完整的鏈。三、半不連續(xù)復(fù)制前導(dǎo)鏈（leading strand）與復(fù)制叉移動(dòng)方向一致，通過(guò)連續(xù)的53聚合合成的新的DNA鏈。后隨鏈（lagging strand）與復(fù)制叉移動(dòng)方向相反，通過(guò)不連續(xù)的53聚合合成的新的DNA鏈。岡崎片段（Okazaki fragment）后隨鏈中分段

5、合成的短的DNA片段。長(zhǎng)度為1000-2000bp的，能被連接形成一條完整的DNA鏈。The replication fork前導(dǎo)鏈后隨鏈岡崎片段復(fù)制叉DNA雙鏈在復(fù)制叉處同時(shí)合成第二節(jié) 原核生物DNA的復(fù)制原核生物DNA復(fù)制有關(guān)的蛋白和酶原核生物DNA復(fù)制的過(guò)程一、參與 DNA復(fù)制的酶和蛋白質(zhì) 解鏈有關(guān)的酶 DNA聚合酶類DNA polymerase） 引發(fā)酶DNA連接酶解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物酶和引發(fā)體DNA聚合酶ISSB335355RNA引物（一）解鏈有關(guān)的酶解鏈酶解開DNA雙鏈中氫鍵，消耗ATP解旋酶（helicase）Rep蛋白、DnaB 單鏈結(jié)合蛋白（SSB）起

6、穩(wěn)定單鏈DNA的作用拓?fù)洚悩?gòu)酶復(fù)制前拓?fù)洚悩?gòu)酶切斷DNA雙鏈，松開正超螺旋，復(fù)制后重新使DNA雙鏈連接，形成負(fù)超螺旋。 1.解旋酶（helicase）DnaB沿后滯鏈模板53方向并隨著復(fù)制叉的前進(jìn)而移動(dòng)；Rep蛋白 沿前導(dǎo)鏈模板35方向移動(dòng)；2.單鏈結(jié)合蛋白Single-stranded binding proteins (SSBs)SSB以四聚體的形式存在于復(fù)制叉處，待單鏈復(fù)制后才掉下來(lái)，重新循環(huán)。SSB選擇性地結(jié)合并覆蓋在單鏈DNA上，起穩(wěn)定單鏈的作用。3.拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶在復(fù)制叉處消除解鏈過(guò)程中產(chǎn)生的超螺旋。型拓?fù)洚悩?gòu)酶切開一條鏈，釋放超螺旋后，再連接封閉。型拓?fù)洚悩?gòu)酶同時(shí)切開兩條鏈

7、，再連接封閉。（二） DNA聚合酶類DNA聚合酶（DNA polymerase）作用特點(diǎn)單鏈DNA模板（template）；需要引物（primer）：提供3-OH；RNA引物-細(xì)胞內(nèi)；DNA引物體外；53方向延伸；原核細(xì)胞中的DNA聚合酶 pol 主要在DNA修復(fù)中起作用。 多功能酶，活性包括：53DNA聚合酶活性；35核酸外切酶活性；（校正作用）53核酸外切酶活性；（缺口平移或切除岡崎片段5引物）Klenow片段：53DNA聚合酶活性； 35核酸外切酶活性；pol 又稱為DNA聚合酶全酶 真正的DNA復(fù)制酶。 活性53DNA聚合酶活性35核酸外切酶活性pol 具有35核酸外切酶活性，所以在D

8、NA修復(fù)中有作用。 1956年 Kornberg發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶I（100kg大腸桿菌可以分離0.5g純化的酶）由一條肽鏈組成，有53聚合酶活力， 53外切酶活力，和3 5外切酶活力。用蛋白酶水解得到的Klenow片段有3 5外切酶活力和5 3聚合酶活力。DNA聚合酶 Protease cleavage（三）引物酶DnaG：以DNA為模板互補(bǔ)合成RNA；DnaG與DnaB結(jié)合，構(gòu)成引發(fā)體（primosome）合成方向：53。Mg2+連接酶ATP或NADAMP+PPi或NMN+AMPATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP

9、缺口33555533模板鏈模板鏈（四）DNA連接酶DNA復(fù)制中的酶和蛋白質(zhì)拓?fù)洚悩?gòu)酶解鏈酶5/ 3/3/ 5/ 3/ 5/DNA聚合酶單鏈結(jié)合蛋白DNA聚合酶前導(dǎo)鏈 后隨鏈DNA連接酶岡崎片段引物酶二、復(fù)制過(guò)程在復(fù)制過(guò)程中，各種與復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白因子結(jié)合在復(fù)制叉上，構(gòu)成復(fù)制體（replisome）。起始延長(zhǎng)終止（一） 復(fù)制起始 親代DNA從復(fù)制起點(diǎn)解鏈、解旋，形成復(fù)制叉1.復(fù)制起點(diǎn)（oriC）同向串聯(lián)排列的三個(gè)13bp序列，富含AT，共有序列為GATCTNTTNTTT；四個(gè)反向重復(fù)排列的9bp序列，共有序列為TTATCCACAGATCTNTTNTTT成串排列的三個(gè)13bp序列共有序列共有序列

10、TTATCCACA DnaA蛋白結(jié)合位點(diǎn)四個(gè)9bp序列OriC in E. coli chromosomal DNA 大腸桿菌的DNA復(fù)制起點(diǎn) 四個(gè)9bp的重復(fù)序列 dnaA結(jié)合位點(diǎn) 三個(gè)13bp的重復(fù)序列若干GATC位點(diǎn)DnaADnaB(解螺旋酶)SSB大腸桿菌DNA復(fù)制起點(diǎn)在起始階段的結(jié)構(gòu)模型（一） 復(fù)制起始2.起始有關(guān)的蛋白和酶引發(fā)體（起始復(fù)合物）形成：DnaA、DnaB、DnaC、組蛋白樣蛋白（HU）、旋轉(zhuǎn)酶、SSB。3. 起始過(guò)程20個(gè)DnaAATP復(fù)合物結(jié)合到oriC的9bp序列；HU類組蛋白結(jié)合，13bp序列解鏈；2個(gè)DnaB六聚體結(jié)合于開放區(qū)域，沿著DNA鏈53移動(dòng)解鏈；形成2

11、個(gè)復(fù)制叉；SSB，拓?fù)洚悩?gòu)酶開放復(fù)合物聚合酶III核心酶大腸桿菌復(fù)制體結(jié)構(gòu)示意圖聚合酶I聚合酶III核心酶滯后鏈前導(dǎo)鏈解螺旋酶引物合成酶RNA引物引發(fā)體拓?fù)洚悩?gòu)酶II-夾子-聚體-夾子 -復(fù)合物RNA引物單鏈結(jié)合蛋白（SSB）DNA聚合酶全酶與引發(fā)體、螺旋酶等構(gòu)成蛋白復(fù)合體。DNA聚合酶全酶一半合成先導(dǎo)鏈，另一半合成后滯鏈上短的DNA片段，從而保證了先導(dǎo)鏈和后滯鏈的同時(shí)復(fù)制。后滯鏈的引發(fā)過(guò)程由引發(fā)體來(lái)完成。 復(fù)制體（二） 復(fù)制延長(zhǎng) 1.先導(dǎo)鏈的合成35親本鏈為模板；pol 全酶延伸。2.后滯鏈的合成隨先導(dǎo)鏈的延伸置換出模板，其上RNA引物信號(hào)序列出現(xiàn)即合成RNA引物；pol 延伸岡崎片段；po

12、l切除引物和填補(bǔ)空缺；DNA連接酶連接片段。 復(fù)制終止由兩個(gè)復(fù)制叉相遇而終止。終止序列：終止位點(diǎn)Ter ，22bpDNA，結(jié)合特異的蛋白。專一性終止蛋白，Tus蛋白：結(jié)合到Ter位點(diǎn)，復(fù)制叉暫停。子代二價(jià)體的解套 （三）大腸桿菌染色體復(fù)制的終止ori復(fù)制叉2復(fù)制叉1終止復(fù)制叉2終止復(fù)制叉1E.coli 有兩個(gè)終止區(qū)域序列一：terE terD terA序列二： terF terB terC每個(gè)區(qū)域只對(duì)一個(gè)方向的復(fù)制叉起作用子代二價(jià)體的解套修復(fù)前進(jìn)行，子代鏈上有缺口，由拓?fù)洚悩?gòu)酶在親本鏈上打開缺口，而解套；修復(fù)后進(jìn)行，則由拓?fù)洚悩?gòu)酶在親本鏈和子代鏈上打開缺口，而解套； 三、原核生物DNA合成抑制

13、劑喹諾酮類環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星等；作用：革蘭氏陰性菌的解旋酶、革蘭氏陽(yáng)性菌的拓?fù)洚悩?gòu)酶；硝基呋喃類呋喃妥因還原產(chǎn)生的中間物攻擊DNA、核糖體蛋白等；硝基咪唑類甲硝唑厭氧菌還原后與DNA結(jié)合，產(chǎn)生抑制。第三節(jié) 真核生物DNA的復(fù)制染色體DNA的復(fù)制線粒體DNA的復(fù)制一、 真核生物染色體DNA的復(fù)制（一） 真核生物DNA復(fù)制特點(diǎn)復(fù)制速度較慢，大約3000bp/min；染色質(zhì)解離與重塑多起點(diǎn)、雙向復(fù)制復(fù)制子相對(duì)較小(13-900kb)，岡崎片段150200NT；終止端粒的復(fù)制DNA復(fù)制檢驗(yàn)點(diǎn)復(fù)制過(guò)程中核小體解體與組裝DNA 聚合酶位置細(xì)胞核細(xì)胞核線粒體細(xì)胞核細(xì)胞核功能后隨鏈的合成和前導(dǎo)鏈的引

14、發(fā)修復(fù)復(fù)制前導(dǎo)鏈的合成修復(fù)引物切除分子量300K40K180-300K170-230K250K3-5外切酶活性+-引發(fā)酶活性+-（二） 真核細(xì)胞中的DNA聚合酶 （三）復(fù)制過(guò)程1.自主復(fù)制序列（ARS） SV40復(fù)制起始點(diǎn)4個(gè)5-GAGGC-3序列；一個(gè)15bp的回文結(jié)構(gòu)（復(fù)制時(shí)最早解鏈區(qū)域）；一個(gè)只有A-T組成的17bp區(qū)域（促進(jìn)解鏈）；（三）復(fù)制過(guò)程2. 解鏈DNA從核小體內(nèi)解開形成復(fù)制子；每個(gè)復(fù)制泡開始于固定的起點(diǎn)，雙向伸展，與相鄰復(fù)制泡匯合；DNA螺旋酶、SSB、復(fù)制蛋白（RPA）的作用。 真核生物DNA復(fù)制叉上發(fā)生的事件（三）復(fù)制過(guò)程3. 合成引物并延長(zhǎng)引物酶和聚合酶緊密偶聯(lián)，合成引

15、物；聚合酶在引物3末端合成一段DNA；先導(dǎo)鏈上聚合酶取代聚合酶；（后滯鏈上聚合酶取代聚合酶；） 4. RNA引物的切除和缺口的封閉RNase HDNA polymerase DNA ligase（三）復(fù)制過(guò)程 線性DNA的末端復(fù)制的問題（四）端粒與復(fù)制終止1.端粒 (Telomeres) 結(jié)構(gòu)端粒DNA末端所含的簡(jiǎn)單的不含遺傳信息的重復(fù)序列及與其特異結(jié)合的蛋白質(zhì)組成的復(fù)合物。TTGGGG(T2G4) 序列高度重復(fù)的末端 （人：TTAGGG）;重復(fù)序列重復(fù)數(shù)十次甚至上萬(wàn)次；反折式二級(jí)結(jié)構(gòu)：末端富含G的端粒鏈；Chromosome Ends are specialized structures c

16、alled TelomeresBlue = chromosomesWhite = Telomere protein端粒的形成“爬行”過(guò)程，模板RNA結(jié)合于染色體末端突出的3端，開始合成一段GGGTTG序列，然后端粒酶移動(dòng)到新的末端，再次合成重復(fù)序列，如此反復(fù)，形成端粒結(jié)構(gòu)。端粒酶一種含有短RNA分子的蛋白質(zhì)復(fù)合物。具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，以自身RNA為模板。Telomerase is composed of both RNA and protein and Primase（四）端粒與復(fù)制終止2.端粒的功能完成染色體末端的復(fù)制，防止染色體DNA的降解、末端融合、缺失和非正常重組而影響細(xì)胞分裂，維持染色

17、體的穩(wěn)定完整。端粒的核苷酸序列的重復(fù)程度與細(xì)胞的壽命呈正相關(guān)，作為細(xì)胞的“分裂鐘”。3.端粒酶的活性胚胎細(xì)胞中端粒酶具有活性。干細(xì)胞中端粒酶保持活性，一般體細(xì)胞中的端粒酶活性很低或失活。腫瘤細(xì)胞中，端粒酶具有高活性。In most somatic tissues, telomerase is expressed at verylow levels or not at all - as cells divide, telomeres shortenTelomerase and SenescenceShort telomeres may be a signal for cells to senes

18、ce (stop dividing)二、 線粒體DNA復(fù)制 1.線粒體DNA的結(jié)構(gòu)mtDNA為雙鏈閉環(huán)DNA；重鏈（H鏈）：含嘌呤堿基較多，密度大；輕鏈（L鏈）：含嘧啶堿基較多，密度??；每條鏈各有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，錯(cuò)位相距mtDNA總長(zhǎng)的1/3同時(shí)有編碼功能，但有分工。2. 線粒體DNA復(fù)制過(guò)程聚合酶負(fù)責(zé)mtDNA的復(fù)制。D環(huán)復(fù)制方式，又稱置換式復(fù)制。 D環(huán)復(fù)制H鏈為模板，從OH開始；新的L鏈取代原來(lái)的L鏈與H鏈互補(bǔ)結(jié)合；原來(lái)的L鏈呈D環(huán)；至1/3時(shí)暴露OL，起動(dòng)以L鏈為模板的復(fù)制；復(fù)制完成，以環(huán)狀雙螺旋形式釋放，形成兩條環(huán)形DNA分子。第四節(jié) 病毒DNA的復(fù)制滾環(huán)復(fù)制滾環(huán)復(fù)制模式過(guò)程 “”鏈產(chǎn)生

19、缺口RF；以“”鏈為模板，DNA聚合酶催化延伸反應(yīng)；“”鏈被置換；第七節(jié) DNA的逆轉(zhuǎn)錄合成逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription）以RNA為模板，以dNTP為原料，在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下合成DNA的過(guò)程一、逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶的活性RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；RNAaseH活性，即從53或35水解DNA-RNA雜交分子中的RNA。DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；逆轉(zhuǎn)錄酶活性依賴RNA的DNA聚合酶核糖核酸酶H活力依賴DNA的DNA聚合酶二、逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組反轉(zhuǎn)錄病毒RNA的末端是正向重復(fù)序列。反轉(zhuǎn)錄病毒線型DNA的末端是LTRs整合到宿主DNA中時(shí)，兩端各丟失了2 bp翻譯區(qū)長(zhǎng)末端重復(fù)序列引物結(jié)合位點(diǎn)PBS三、逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組為正鏈RNA。宿主tRNA 與U5互補(bǔ)，作為合成DNA負(fù)鏈的引物。生成DNA-RNA雜交雙鏈片段，含U5和R互補(bǔ)序列；三、逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程R U5 U3 RR U5R U5 U3 R U3 RR U5 U5 U3 R U5RNAaseH水解DNA-RNA雜交雙鏈中RNA模板5端的一段RNA；（包括R序列和U5）新合成的DNA負(fù)鏈從模板RNA的5端跳到3端，通過(guò)R序列形成雜交鏈；（第一次跳躍）DNA負(fù)鏈向5端延伸；三、逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程RNAaseH將tRNA引物水解切除； DNA-RNA雜交雙鏈中絕大部