王鏡巖生物化學(xué)002氨基酸與蛋白質(zhì)課件

1、2022/9/151第三章 蛋白質(zhì)2022/9/152蛋白質(zhì)是由20種L-型氨基酸組成的長鏈分子。第一節(jié) 蛋白質(zhì)概論一、 蛋白質(zhì)的化學(xué)組成與分類1、元素組成碳 50% 氫7% 氧23% 氮16% 硫 0-3% 微量的磷、鐵、銅、碘、鋅、鉬 凱氏定氮：粗蛋白質(zhì)含量=蛋白氮6.25 2、 氨基酸組成2022/9/153酶、運(yùn)輸?shù)鞍?、營養(yǎng)和貯存蛋白、激素、受體蛋白、運(yùn)動(dòng)蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、防御蛋白。3、分類（1） 按組成簡單蛋白 結(jié)合蛋白（2）按分子外形的對(duì)稱程度球狀蛋白質(zhì) 纖維狀蛋白質(zhì) 膜蛋白質(zhì)（3）按功能2022/9/154蛋白質(zhì)分子量 = 氨基酸數(shù)目*110二、蛋白質(zhì)的大小與形狀 少于50個(gè)氨基酸

2、的低分子量氨基酸多聚物稱為肽，寡肽或生物活性肽、多肽。多于50個(gè)氨基酸的稱為蛋白質(zhì)。110=氨基酸殘基的平均分子量（P160）2022/9/1561 酶 2結(jié)構(gòu)成分（結(jié)締組織的膠原蛋白、血管和皮膚的彈性蛋白、膜蛋白）3貯藏（卵清蛋白、種子蛋白）4物質(zhì)運(yùn)輸（血紅蛋白、Na+-K+-ATPase、葡萄糖運(yùn)輸載體、脂蛋白、電子傳遞體）5細(xì)胞運(yùn)動(dòng)（肌肉收縮的肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白）6激素功能（胰島素）7自我保護(hù)（抗體、皮膚的角蛋白、血凝蛋白8接受、傳遞信息（受體蛋白，味覺蛋白）9調(diào)節(jié)、控制細(xì)胞生長、分化、和遺傳信息的表達(dá)（組蛋白、阻遏蛋白）四、 蛋白質(zhì)功能的多樣性2022/9/157第二節(jié) 氨基酸 四大類

3、生物分子中，蛋白質(zhì)是生物功能的主要載體，而氨基酸是蛋白質(zhì)的構(gòu)件分子。 自然界中存在的成千上萬種蛋白質(zhì)，在結(jié)構(gòu)和功能上的驚人的多樣性歸根結(jié)底是由20中常見的氨基酸的內(nèi)在性質(zhì)造成的。這些性質(zhì)包括：聚合能力酸堿性側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的多樣性化學(xué)功能的多樣性2022/9/159非蛋白質(zhì)氨基酸：存在于生物體內(nèi)但不組成蛋白質(zhì) (約150種)二、氨基酸的結(jié)構(gòu)與分類基本氨基酸（編碼的蛋白質(zhì)氨基酸）：組成蛋白質(zhì)，20種稀有氨基酸：是多肽合成后由基本氨基酸經(jīng)酶促修飾而來重點(diǎn)2022/9/1510-氨基酸的一般結(jié)構(gòu)-氨基酸 與羧基相鄰的-碳原子（C）上有一個(gè)氨基的氨基酸。COO-C-RH3N可變的側(cè)鏈H2022/9/1511（

4、1）R為脂肪烴基的氨基酸（5種）（一）基本氨基酸（編碼的蛋白質(zhì)氨基酸，20種）1、按照R基的化學(xué)結(jié)構(gòu)分類2022/9/1512Gly是唯一不含手性碳原子的氨基酸，因此不具旋光性 從Gly至Ile，R基團(tuán)疏水性增加 特點(diǎn)R基均為中性烷基，R基對(duì)分子酸堿性影響很小，它們幾乎有相同的等電點(diǎn)。（6 .00.03）2022/9/1513（2） R中含有羥基和硫的氨基酸（共4種）2022/9/1514 Ser的-CH2OH基（pKa=15）在生理?xiàng)l件下不解離，但在大多數(shù)酶的活性中心都發(fā)現(xiàn)有Ser殘基存在。 Ser和Thr的-OH往往與糖鏈相連，形成糖蛋白。 Cys的R中含巰基（-SH），具有兩個(gè)重要性質(zhì)：

5、 （1）在較高pH值條件，巰基離解。 （2）兩個(gè)Cys的巰基氧化生成二硫鍵，生成胱氨酸。 Met在生物合成中是一種重要的甲基供體。特點(diǎn)2022/9/1516（4）R中含有酸性基團(tuán)（2種） Asp、GluAsp側(cè)鏈羧基pKa為3.86，Glu側(cè)鏈羧基pKa為4.25 它們是唯一在生理?xiàng)l件下帶有負(fù)電荷的的兩個(gè)氨基酸 2022/9/1517（5）R中含堿性基團(tuán)（3種）2022/9/1519在280nm處，Trp吸收最強(qiáng)，Tyr次之，Phe最弱。（6） 芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸）CH2H3N+-C-HCOO-CH2H3N+-C-HCOO-OHNHCHCCH2H3N+-C-HCOO-苯丙氨

6、酸（Phe,F）酪氨酸（Tyr,Y）色氨酸（Trp,W）2022/9/1520（7）、雜環(huán)族氨基酸（2種）Pro的-亞氨基是環(huán)的一部分，因此具有特殊的剛性結(jié)構(gòu)。一般出現(xiàn)在兩段-螺旋之間的轉(zhuǎn)角處，Pro殘基所在的位置必然發(fā)生骨架方向的變化，2022/9/1521嬰兒期：Arg（精氨酸）和His（組氨酸）供給不足， 屬半必需氨基酸。u必需氨基酸u成年人：Thr 蘇氨酸 Val 纈氨酸 Leu 亮氨酸 Ile 異亮氨酸 Phe 苯丙氨酸 Trp 色氨酸 Lys 賴氨酸 Met 甲硫氨酸攜（纈氨酸）一（異亮氨酸）兩（亮氨酸）本（苯丙氨酸）單（蛋氨酸，即甲硫氨酸）色（色氨酸）書（蘇氨酸）來（賴氨酸）。

7、攜（寫）一兩本單色書來；一兩色素本來淡些；假設(shè)來寫一兩本書（一）賴氨酸（Lysine）：促進(jìn)大腦發(fā)育，是肝及膽的組成成分，能促進(jìn)脂肪代謝，調(diào)節(jié)松果腺、乳腺、黃體及卵巢，防止細(xì)胞退化；（二）色氨酸（Tryptophane）：促進(jìn)胃液及胰液的產(chǎn)生；（三）苯丙氨酸（Phenylalanine）：參與消除腎及膀胱功能的損耗；（四）蛋氨酸（又叫甲硫氨酸）（Methionine）；參與組成血紅蛋白、組織與血清，有促進(jìn)脾臟、胰臟及淋巴的功能；（五）蘇氨酸（Threonine）：有轉(zhuǎn)變某些氨基酸達(dá)到平衡的功能；（六）異亮氨酸（Isoleucine）：參與胸腺、脾臟及腦下腺的調(diào)節(jié)以及代謝；腦下腺屬總司令部作用于

8、甲狀腺、性腺；（七）亮氨酸（Leucine）：作用平衡異亮氨酸；（八）纈氨酸（Viline）：作用于黃體、乳腺及卵巢。（九）組氨酸（Hlstidine）：作用于代謝的調(diào)節(jié)；2022/9/15222022/9/1523 在維持蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)中起著重要（蛋白質(zhì)的疏水核心）。（1）非極性氨基酸 9種這類氨基酸的側(cè)鏈都能與水形成氫鍵，因此很容易溶于水（2） 不帶電何的極性氨基酸 6種（3）帶負(fù)電荷的氨基酸(酸性氨基酸) 2種（4）帶正電荷的氨基酸(堿性氨基酸) 3種2022/9/1524非極性氨基酸 在維持蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)中起著重要作用（蛋白質(zhì)的疏水核心）。2022/9/1526不帶電荷的極性氨基酸

9、這類氨基酸的側(cè)鏈都能與水形成氫鍵，因此很容易溶于水。2022/9/1527帶負(fù)電荷的氨基酸(酸性氨基酸)2022/9/1529 膠原蛋白中的Lys側(cè)鏈氧化時(shí)能形成很強(qiáng)的分子間(內(nèi))交聯(lián)。Arg的側(cè)鏈堿性很強(qiáng)，與NaOH相當(dāng)。 His是一個(gè)弱堿，是天然的緩沖劑，往往存在于許多酶的活性中心。 非極性氨基酸一般形成蛋白質(zhì)的疏水核心，帶電荷的氨基酸和極性氨基酸位于表面。酶的活性中心：His、Ser、Cys2022/9/1530（二） 非編碼的蛋白質(zhì)氨基酸也稱修飾氨基酸，是在蛋白質(zhì)合成后，由基本氨基酸修飾而來。（1）4-羥脯氨酸 （2）5-羥賴氨酸 這兩種氨基酸主要存在于結(jié)締組織的纖維狀蛋白中。（3）6

10、-N-甲基賴氨酸 存在于肌球蛋白中 （4）-羧基谷氨酸 存在于凝血酶原及某些具有結(jié)合Ca2+離子功能的蛋白質(zhì)中。（5）Tyr的衍生物：3.5 -二碘酪氨酸、甲狀腺素 存在于甲狀腺蛋白中（6）鎖鏈素由4個(gè)Lys組成 存在于彈性蛋白中2022/9/15312022/9/1532-Ala（泛素的前體）、-氨基丁酸（神經(jīng)遞質(zhì)） （三） 非蛋白質(zhì)氨基酸不組成蛋白質(zhì)，但有生理功能的氨基酸 L-瓜氨酸、L-鳥氨酸是尿素循環(huán)的中間物1、L-型 氨基酸的衍生物2、D-型氨基酸D-Glu、D-Ala（肽聚糖中）、D-Phe（短桿菌肽S）3、-、-、-氨基酸2022/9/15332022/9/1535精氨酸、瓜氨酸

11、、鳥氨酸是尿素循環(huán)的中間物。三、氨基酸的功能1、組成蛋白質(zhì)2、一些氨基酸及其衍生物充當(dāng)化學(xué)信號(hào)分子-氨基丁酸，色氨酸衍生物：5-羥色胺、褪黑激素，都是神經(jīng)遞質(zhì)。甲狀腺素（Tyr衍生物），吲哚乙酸（Trp衍生物）都是激素3、氨基酸是許多含N分子的前體物核酸的含氮堿基、血紅素、葉綠素的合成都需要氨基酸。4、一些基本氨基酸和非基本氨基酸是代謝中間物2022/9/1536Gly（甘氨酸）只有一種構(gòu)型,無旋光性Thr（蘇氨酸）和Ile（異亮氨酸）有四種光學(xué)異構(gòu)體。其余17種氨基酸有兩種光學(xué)異構(gòu)體：L型、D型。構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸均屬L-型。 四、氨基酸的構(gòu)型、旋光性和光吸收1、 氨基酸的構(gòu)型2022/9/

12、15372022/9/1538L-蘇氨酸和D-蘇氨酸組成消旋物。L-別一蘇氨酸和D-別-蘇氨酸組成消旋物2、 氨基酸的旋光性氨基酸的旋光性（符號(hào)和大小）取決于它的R基的性質(zhì)，并與溶液的pH值有關(guān)。外消旋物：D-型和L-型的等摩爾混合物。2022/9/1539胱氨酸有三種立體異構(gòu)體： L-胱氨酸、D-胱氨酸、內(nèi)消旋胱氨酸。 L-胱氨酸和D-胱氨酸是外消旋物 內(nèi)消旋物：分子內(nèi)消旋2022/9/15403、氨基酸的光吸收性Tyr、Phe、Trp的R基含有共軛雙鍵，在220-300nm近紫外區(qū)有吸收。p1452022/9/1541五、 氨基酸的酸堿性質(zhì)1、氨基酸在晶體和水溶液中主要以兼性離子形式存在2

13、、氨基酸的兩性解離和酸堿滴定曲線（1）pKa/ 就是氨基酸50%解離（堿 = 酸）時(shí)溶液的pH值， Ka/就是此時(shí)溶液的H+（2）當(dāng)HA50%解離時(shí)，溶液的pH值等于pKa/（3） pH = pKa/ 時(shí)，堿 = 酸 （ 50%解離 ） pH pKa/ 時(shí)，堿 酸（50%解離） pH 堿（50%解離）2022/9/1542甘氨酸的滴定曲線（解離曲線）2022/9/1543起點(diǎn)： 100% G+ 凈電荷：+1第一拐點(diǎn)： 50%G + ，50%G 平均凈電荷：+0.5 pH=pK1+lgG/G+ = pK1 = 2.34第二拐點(diǎn)：0%G 凈電荷：0 等電點(diǎn)pI=5.97第三拐點(diǎn)： 50%G ，50

14、%G- 平均凈電荷：-0.5 pH=pK2+lgG-/G=pK2=9.6終點(diǎn)： 100% G- 凈電荷：-1在pH2.34和pH9.60處，Gly具有緩沖能力。2022/9/15442022/9/1545Gly等電點(diǎn)的計(jì)算2022/9/154622)3()3()(RNHNHCOOHpKpKpIpKpKpI+=+=-a2)(RCOOHpKpKpI+=-aaa中性氨基酸堿性氨基酸酸性氨基酸氨基酸等電點(diǎn)的計(jì)算2022/9/1547 pH pI時(shí)， -COOH解離成-COO-，氨基酸帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)作用下向正極移動(dòng)。 pH = pI時(shí)，氨基酸凈電荷為零，在電場(chǎng)中不移動(dòng)2022/9/1548六、 氨基酸

15、的化學(xué)性質(zhì)+ HNO2+ N2 收集反應(yīng)放出的氮?dú)?，可用來測(cè)定氨基酸的含量，這種測(cè)定氨基酸含量的方法稱為范斯萊克（Van slyke）氨基測(cè)定法。1、與亞硝酸反應(yīng) （一）-NH2參加的反應(yīng)2022/9/1549 芐氧甲酰氯（carbobenzyloxychloride,Cbz-Cl) 叔丁氧甲酰氯 對(duì)-甲苯磺酰氯 鄰苯二甲酸酐2、與酰化試劑反應(yīng)氨基酸的氨基與酰氯或酸酐在弱堿溶液中發(fā)生作用時(shí)，氨基即被?；?。酰化試劑?；噭┰诙嚯牡娜斯ず铣芍斜挥米靼被Ｗo(hù)劑。P1362022/9/1550（ DNS-氨基酸 ，黃色熒光）丹磺酰氯（DNS-Cl，5二甲基氨基萘-1-磺酰氯）常用于多肽鏈NH2末端氨

16、基酸的標(biāo)記和微量氨基酸的定量測(cè)定。2022/9/1551Sanger 反應(yīng)（2，4一二硝基氟苯，DNFB） DNP-氨基酸被Sanger用來測(cè)定多肽的NH2末端氨基酸 3、 烴基化反應(yīng)（弱堿）（黃色） 氨基酸氨基的一個(gè)H原子可被烴基（包括環(huán)烴及其衍生物）取代。2022/9/1552苯異硫氰酸酯，PITC 苯氨基硫甲酰衍生物（PTC-多肽）苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物（PTH-氨基酸），無色，可以用層析法分離鑒定。被Edman用來鑒定多肽的NH2末端氨基酸 （弱堿）（CH3NO2/H+）Edman反應(yīng)2022/9/1553甲醛甲醛西佛堿是某些酶促反應(yīng)的中間產(chǎn)物（如轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)的中間產(chǎn)物）。4、生成西佛堿的反

17、應(yīng)（Schiff）氨基酸的-氨基能與醛類化合物反應(yīng)生成弱堿（Schiffs base）2022/9/15545、脫氨基反應(yīng) 氨基酸在生物體內(nèi)經(jīng)氨基酸氧化酶催化即脫去-氨基而轉(zhuǎn)變成酮酸。CH3CCOOHO氨基酸氧化酶2022/9/1555（二）-羧基參加的反應(yīng)1、成鹽、成酯反應(yīng)可以屏蔽羧基活化氨基RCHCOOHNH2+C2H5OH干燥， HCl回流RCHCOOC2O5NH3Cl-+H2O成酯反應(yīng)RCHCOOHNH2+NaOHRCHCOONaNH2+H2O2022/9/1556 氨基被保護(hù)后，羧基可與二氯亞砜或五氯化磷反應(yīng)，生成酰氯， 使羧基活化，在多肽的人工合成中常用。 2、成酰氯的反應(yīng)HN-保

18、護(hù)基R-CH-COOH+PCl5HN-保護(hù)基R-CH-COOCl+POCl3+HCl2022/9/15573、疊氮反應(yīng)活化羧基，可用于肽的人工合成。YNH OR-CH-C-OCH3酰化氨基酸甲酯（Y=?；℡NH OR-CH-C-NHNH2酰化氨基酸酰肼NH2NH2YNH OR-CH-C-N-N=N+H2O?；被岑B氮2022/9/1558將-氨基酸加熱時(shí)，可脫去CO2得到胺。Ba(OH)2尸胺4、脫羧基反應(yīng)2022/9/1559 茚三酮在弱酸中與-氨基酸共熱，引起氨基酸的氧化脫氨，脫羧反應(yīng)，最后，茚三酮與反應(yīng)產(chǎn)物氨和還原茚三酮反應(yīng)，生成紫色物質(zhì)（max=570nm）。（三） -NH2和-C

19、OOH共同參加的反應(yīng)1、與茚三酮反應(yīng)+ NH3CO2RCHOH+ +CCCOHOCCCOON藍(lán)紫色復(fù)合物Pro、Hy-Pro與直接形成黃色化合物（ max=440nm）茚三酮還原茚三酮還原茚三酮茚三酮（max=570nm）2022/9/15612、成肽反應(yīng) 一個(gè)氨基酸的氨基與另一個(gè)氨基酸的羧基可以縮合成肽，形成的鍵稱肽鍵。肽鍵2022/9/1562（四） 側(cè)鏈R基參加的反應(yīng) 用于蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾略2022/9/1563（一）基于電荷性質(zhì)差異的分離方法七、 氨基酸的分離和分析Glu、Leu 、His 、Lys，4種混合樣，在pH6.0時(shí)，泳動(dòng)方向1、電泳分離電泳的基本原理 Glu Leu His

20、 LyspI 3.22 5.98 7.59 9.74+-2022/9/15642、 離子交換柱層析磺酸型陽離子交換樹脂氨基酸與樹脂上解離基團(tuán)之間的靜電引力氨基酸與樹脂基質(zhì)聚苯乙烯之間的疏水作用NH3-CH-COOHR+2022/9/15652022/9/15662022/9/15671、 紙層析流動(dòng)相：丁醇、醋酸、水基本步驟：點(diǎn)樣、展層、現(xiàn)色、定性（定量）（二）基于分配系數(shù)（極性）差異的分離方法 分配層析分配系數(shù)：在流動(dòng)相中分配系數(shù)越大，移動(dòng)越快。固定相：吸附的水逆流分溶原理2022/9/15682、薄層層析基本步驟：鋪板、點(diǎn)樣、展層、現(xiàn)色、定性（定量）支持劑：纖維素粉、 硅膠、 氧化鋁粉20

21、22/9/15693、分配柱層析支持劑：纖維素、淀粉、硅膠固定相：吸附水流動(dòng)相；苯酚、正丁醇2022/9/1570固定相：涂有薄層液體的惰性顆粒流動(dòng)相：H2、N2、CO2前提：樣品能汽化、熱穩(wěn)定（三）氣液層析（氣相層析、氣相色譜）2022/9/1571分配層析離子交換層析吸附層析 凝膠過濾層析（四）高效液相層析（HPLC）2022/9/1572第三節(jié) 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu) （共價(jià)結(jié)構(gòu)）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)層次2022/9/1573蛋白質(zhì)分子中氨基酸殘基的排列順序(含二硫鍵)一級(jí)結(jié)構(gòu)（共價(jià)結(jié)構(gòu)）二級(jí)結(jié)構(gòu) 多肽主鏈中各個(gè)肽段借助于相鄰氨基酸之間的氫鍵形成的構(gòu)象。主要有-螺旋、折疊、-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲。超二級(jí)結(jié)構(gòu)

22、由兩個(gè)以上二級(jí)結(jié)構(gòu)單元相互聚集形成的有規(guī)則的二級(jí)結(jié)構(gòu)的組合體如、。2022/9/15742022/9/15752022/9/15762022/9/15772022/9/1578 大的球蛋白分子中，多肽鏈形成幾個(gè)緊密的球狀構(gòu)象，彼此以松散的肽鏈相連，此球狀構(gòu)象是結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域是多肽鏈的獨(dú)立折疊單位，一般由100-200個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。結(jié)構(gòu)域2022/9/1579單鏈蛋白質(zhì)只有一、二、三級(jí)結(jié)構(gòu)，無四級(jí)結(jié)構(gòu)。三級(jí)結(jié)構(gòu) 整條多肽鏈或亞基通過盤旋、折疊，形成緊密的、借各種次級(jí)鍵維持的球狀構(gòu)象。四級(jí)結(jié)構(gòu)寡聚蛋白中亞基種類、數(shù)目、空間排布及亞基間相互作用力。2022/9/15802022/9/158120

23、22/9/1582酰胺平面，肽單位間以-C原子相隔，構(gòu)成肽鏈。一、肽和肽鍵的結(jié)構(gòu)肽 一個(gè)氨基酸的羧基和另一個(gè)氨基酸的氨基脫水縮合而成的化合物。其中的氨基酸單位稱氨基酸殘基。肽鍵氨基酸間脫水后形成的共價(jià)鍵稱肽鍵（酰氨鍵）。肽單位2022/9/1583五 肽名稱：絲氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸寫法： Ser-Gly-Try-AlaLeu或，2022/9/1584肽鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，不能自由旋轉(zhuǎn)。肽鍵具有平面性，組成肽鍵的4個(gè)原子和2個(gè)C幾乎處在同一平面內(nèi)（酰氨平面）。肽鍵亞氨基在pH014內(nèi)不解離。肽鍵的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)2022/9/1585多肽鏈可以看成由C串聯(lián)起來的無數(shù)個(gè)酰胺平面組成2022/9/1

24、586 短肽在晶體和水溶液中也是以偶極離子形式存在。 肽的酸堿性質(zhì)主要取決于端和端COOH以及側(cè)鏈上可解離的基團(tuán)。 在長肽或蛋白質(zhì)中，可解離的基團(tuán)主要是側(cè)鏈基團(tuán)。 二、肽的重要性質(zhì)1、旋光性一般短肽的旋光度等于其各個(gè)氨基酸的旋光度的總和。2、 肽的酸堿性質(zhì)2022/9/1587雙縮脲反應(yīng)是肽和蛋白質(zhì)特有的反應(yīng)，游離氨基酸無此反應(yīng)。3、肽的化學(xué)反應(yīng) 肽的-羧基，-氨基和側(cè)鏈R基上的活性基團(tuán)都能發(fā)生與游離氨基酸相似的反應(yīng)。雙縮脲反應(yīng) 凡是有肽鍵結(jié)構(gòu)的化合物都會(huì)發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，可用于定量分析。H2N-CO-NH-CO-NH2雙縮脲CuSO4-NaOH紫紅色化合物2022/9/1588 紅細(xì)胞中的巰基

25、緩沖劑。 參與氧化還原過程，清除內(nèi)源性過氧化物和自由基，維護(hù)蛋白質(zhì)活性中心的巰基處于還原狀態(tài)。 三、天然存在的活性肽1、谷胱甘肽 GluCysGly2022/9/1589 由短桿菌產(chǎn)生的10肽環(huán)?？垢锾m氏陽性細(xì)菌，臨床用于治療化濃性病癥。 2、 短桿菌肽（抗生素）2022/9/1590 合成蛋白質(zhì)的剪切、修飾 酶專一性逐步合成（如谷胱甘肽）、 動(dòng)物腸道可吸收寡肽3、 腦啡肽（5肽） Met 腦啡肽： TyrGlyGlyPheMet Leu腦啡肽： TyrGlyGlyPheLeu 具有鎮(zhèn)痛作用。生物體內(nèi)寡肽的來源2022/9/15914、肽類激素2022/9/1592四、蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定（一）

26、 蛋白質(zhì)測(cè)序的基本策略 對(duì)于一個(gè)純蛋白質(zhì)，理想方法是從N端直接測(cè)至C端，但目前只能測(cè)60個(gè)N端氨基酸。1、直接法（測(cè)蛋白質(zhì)的序列）2、間接法（測(cè)核酸序列推斷氨基酸序列）2022/9/1593（1） 測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目（2） 拆分蛋白質(zhì)分子中的多肽鏈。（3）斷裂鏈內(nèi)二硫鍵。（4） 分析多肽鏈的N末端和C末端。 （5） 測(cè)定多肽鏈的氨基酸組成。（6） 多肽鏈部分裂解成肽段。（7） 測(cè)定各個(gè)肽段的氨基酸順序（8） 確定肽段在多肽鏈中的順序。（9） 確定多肽鏈中二硫鍵的位置。（二）蛋白質(zhì)測(cè)序的一般步驟2022/9/1594估算氨基酸殘基數(shù)，確定肽鏈數(shù) 方法： SDS 凝膠過濾法 沉降系數(shù)法（

27、三） 測(cè)序前的準(zhǔn)備工作1、 蛋白質(zhì)的純度鑒定要求：純度97%以上，均一。鑒定方法： 聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)要求一條帶。 DNSCl（二甲氨基萘磺酰氯）法測(cè)N端氨基酸。2、測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量2022/9/1595酸水解的同時(shí)輔以堿水解。確定肽鏈中各種氨基酸出現(xiàn)的頻率,便于選擇裂解方法及試劑。3、 確定亞基種類及數(shù)目根據(jù)分子量和N末端數(shù)4、拆分多肽鏈，分別分離純化非共價(jià)鍵結(jié)合： 8mol/L尿素， SDS二硫鍵結(jié)合： 過甲酸氧化： SS + HCOOOH SO3H 巰基乙醇還原5、 測(cè)定氨基酸組成2022/9/15966、端基分析N端分析DNS-Cl法最常用，黃色熒光，靈敏度極高，DNS-

28、多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。DNFB法Sanger試劑，DNP-多肽，酸水解，黃色DNP-氨基酸，有機(jī)溶劑（乙酸乙酯）抽提分離，紙層析、薄層層析、液相等 PITC法Edman法，逐步切下。無色PTH-氨基酸，有機(jī)溶劑抽提，層析2022/9/1597無水肼NH2NH2 100 5-10h。 苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，C端游離氨基酸留在上清中。Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。C端分析肼解法2022/9/1598羧肽酶A： 除Pro、Arg、Lys外的所有C端氨基酸羧肽酶B： 只水解Arg、Lys羧肽酶法測(cè)C末端羧肽酶法（Pro不能測(cè)）2022/9/1599 溴化氰 MetX 產(chǎn)率

29、85% 亞碘?；郊姿?TrpX 產(chǎn)率70-100% NTCB（2-硝基-5-硫氰苯甲酸） XCys 羥胺NH2OH AsnGly 約150個(gè)氨基酸出現(xiàn)一次（四） 肽鏈的部分裂解和肽段的分離純化1、化學(xué)裂解法2022/9/15100胰蛋白酶 LysX (X Pro) Arg X胰凝乳蛋白酶 TyrX (X Pro) TrpX PheX胃蛋白酶 Phe(Trp、 Try、 Leu)Phe(Trp、 Try、 Leu)Glu蛋白酶 GluX （Vs蛋白酶）Arg蛋白酶 ArgXLys蛋白酶 XLysPro蛋白酶 ProX2、酶法裂解2022/9/15101 電泳法 根據(jù)分子量大小分離 離子交換層析

30、法（DEAECellulose、DEAESephadex） 根據(jù)肽段的電荷特性分離 反相法 根據(jù)肽段的極性分離凝膠過濾 根據(jù)肽段的大小分離3、肽段的分離純化要求： 單帶 單峰 端單一（常用C l法）2022/9/15102（1）耦聯(lián) PITC HNA-B-C-D pH89，40 PTCA-B-C-D（2）裂解 無水三氟乙酸（TFA） ATZA + H2NB-C-D（3）轉(zhuǎn)化 PTHAPTC肽：苯氨基硫甲酰肽ATZ：噻唑啉酮苯胺（一氨基酸）PTH：苯乙內(nèi)酰硫脲（一氨基酸）（五） 肽段序列測(cè)定及肽鏈的拼接1、 Edman法2022/9/15103熒光基-團(tuán)或有色試劑標(biāo)記的PITC試劑。4-N、N-

31、二甲基氨基偶氮苯-4異硫氰酸酯。2、DNS-Edman法用DNS法測(cè)N末端，用Edman法提供（n-1）肽段。 3、有色 Edman法2022/9/15104儀器原理：Edman法。1967液相測(cè)序儀 自旋反應(yīng)器，適于大肽段。1971固相測(cè)序儀表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦連肽段的端。1981氣相測(cè)序儀 用Polybrene反應(yīng)器。 （聚陽離子）四級(jí)銨鹽聚合物 液相：5nmol 20-40肽 97% 氣相：5pmol 60 肽 98%4、用自動(dòng)序列分析儀測(cè)序2022/9/1510516肽，端H 端 法裂解：ONS PS EOVE RLA HOWT 法裂解：SEO WTON VERL APS

32、HO重疊法確定序列：HOWTONSEOVER LAPS5、肽段拼接成肽鏈2022/9/151062022/9/151072022/9/15108碘乙酰胺封閉-SH胃蛋白酶酶解蛋白質(zhì)第一向電泳過甲酸氧化SS生成-SO3H第二向電泳分離出含二硫鍵的兩條短肽，測(cè)序與拼接出的肽鏈比較，定出二硫鍵的位置。（六）二硫鍵、酰胺及其他修飾基團(tuán)的確定1、二硫鍵的確定（對(duì)角線電泳法）方法2022/9/15109Asp Asn、Glu-Gln 酶解肽鏈，產(chǎn)生含單個(gè)Asx或Glx的肽，用電泳法確定是Asp還是AsnLeu-Glx-Pro-Val肽 在pH=6.0 時(shí)，電荷量是 Leu+ Pro0 Val- 此肽除Gl

33、x外，凈電荷為0，可根據(jù)此肽的電泳行為確定是Glu或是Gln。2、酰胺的確定舉例2022/9/15110Lys(Arg)-Ser-Asn-Ser(PO4)Arg-Thr-Leu-Ser(PO4)Lys(Arg) Ala-Ser(PO4)3、糖、脂、磷酸基位置的確定糖 類通過Asn、Ser與蛋白質(zhì)連接，-N-糖苷 -0-糖苷脂 類Ser、 Thr、Cys磷 酸Ser、 Thr、His經(jīng)驗(yàn)性序列2022/9/15111牛胰RNase變性一復(fù)性實(shí)驗(yàn)五、蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)與生物功能（一） 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)和功能用(8M尿素+硫基乙醇)變性、失活透析后構(gòu)象恢復(fù)，活性恢復(fù)95%以上。牛胰RNas

34、e共有124個(gè)氨基酸殘基 4個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵。分子量：12600p1812022/9/151122022/9/15113血紅蛋白在不同的脊椎動(dòng)物中都具有輸送氧氣的功能細(xì)胞色素在所有的生物中都是電子傳遞鏈的組分。（二） 同源蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬差異與生物進(jìn)化同源蛋白質(zhì)在不同的生物體內(nèi)行使相同或相似功能的蛋白質(zhì)。例2022/9/15114同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有明顯的相似性（序列同源性）有許多位置的氨基酸對(duì)所有種屬來說都是相同的，稱不變殘基，不變殘基高度保守，是必需的。 除不變殘基以外，其它位置的氨基酸對(duì)不同的種屬有很大變化，稱可變殘基，可變殘基中，個(gè)別氨基酸的變化不影響蛋白質(zhì)的功能。多肽鏈長度相同

35、或相近同源蛋白質(zhì)的特點(diǎn)2022/9/15115親源關(guān)系越遠(yuǎn)，同源蛋白的氨基酸順序差異就越大。 通過比較同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列的差異可以研究不同物種間的親源關(guān)系和進(jìn)化。2022/9/15116分子量：12,500左右氨基酸殘基：100個(gè)左右，單鏈。25種生物中，細(xì)胞色素C的不變殘基35個(gè)。60種生物中，細(xì)胞色素C的不變殘基27個(gè)。親源關(guān)系越近的，其細(xì)胞色素C的差異越小。親源關(guān)系越遠(yuǎn)的，其細(xì)胞色素C的差異越大。人與黑猩猩 0人與猴 1人與狗 10人與酵母 441、細(xì)胞色素C2022/9/15117有24個(gè)氨基酸殘基位置始終不變：AB鏈上6個(gè)Cys 不變，其余18個(gè)氨基酸多數(shù)為非極性側(cè)鏈，對(duì)穩(wěn)定蛋白

36、質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)起重要作用。其它可變氨基酸對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)作用不大，但對(duì)免疫反應(yīng)起作用。豬與人接近，而狗則與人不同，因此可用豬的胰島素治療人的糖尿病。2、胰島素2022/9/151182022/9/15119 鐮刀形紅細(xì)胞貧血現(xiàn)是由于血紅蛋白發(fā)生了遺傳突變引起的鏈第6位的aa線基由正常的Glu變成了疏水性的Val。正常人血紅蛋白 .NGlu 6鐮刀型貧血 .NVal 6生理?xiàng)l件下電荷： Glu- Va10 親水 疏水 （三） 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的突變分子病分子病基因突變引起的某個(gè)功能蛋白的某一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基發(fā)生了遺傳性替代從而導(dǎo)致整個(gè)分子的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，功能部分或全部喪失。例2022/9

37、/151202022/9/151212022/9/15122（四） 一級(jí)結(jié)構(gòu)的部分切除與蛋白質(zhì)的激活1、 血液凝固的機(jī)理凝血因子（凝血酶原致活因子）凝血酶原凝血酶血纖維蛋白原血纖維蛋白血纖維蛋白凝塊2022/9/15123（1）凝血酶原在凝血酶原致活因子催化下，凝血酶原分子中的Arg274Thr275、Arg323Ile324斷裂，產(chǎn)生活性凝血酶。 A鏈49 氨基酸 B鏈259 氨基酸2022/9/15124（2） 血纖維蛋白原從二條鏈和二條鏈的N端各斷裂一個(gè)特定的肽鍵-ArgGly-，釋放出二個(gè)纖維肽A（19個(gè)氨基酸）和二個(gè)纖維肽B（21個(gè)氨基酸），它們含有較多的酸性氨基酸殘基。2022/9

38、/15125A、B肽切除后，減少了蛋白質(zhì)分子的負(fù)電荷，促進(jìn)分子間聚集，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。在凝血因子XIIIa（纖維蛋白穩(wěn)定因子）催化下，纖維蛋白質(zhì)單體間形成共價(jià)?。℅ln-Lys結(jié)合），生成交聯(lián)的纖維蛋白。2022/9/151262、胰島素原的激活前胰島素原（含信號(hào)肽）胰島素原活性胰島素（在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上信號(hào)肽被信號(hào)肽酶切除）（在高爾基體上切除C肽）2022/9/15127胰島素原活性胰島素2022/9/151282022/9/15129從理論上講，一個(gè)多肽主鏈能有無限多種構(gòu)象。但是，只有一種或很少幾種天然構(gòu)象，且相當(dāng)穩(wěn)定。因?yàn)椋禾烊坏鞍踪|(zhì)主鏈上的單鍵并不能自由旋轉(zhuǎn)。第四節(jié) 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和纖維狀蛋白

39、質(zhì)一、多肽主鏈折疊的空間限制2022/9/151301、 肽鏈的二面角環(huán)繞CN鍵旋轉(zhuǎn)的角度為 環(huán)繞CC鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱只有碳原子連接的兩個(gè)鍵（CN和C-C）是單鍵，能自由旋轉(zhuǎn)。2022/9/15131從C沿鍵軸方向看，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)的 ()角為正值，反之為負(fù)值。 當(dāng)()旋轉(zhuǎn)鍵兩側(cè)的主鏈呈順式時(shí)，規(guī)定() =02022/9/15132和同時(shí)為0的構(gòu)象實(shí)際不存在二面角（、）所決定的構(gòu)象能否存在，主要取決于兩個(gè)相鄰肽單位中非鍵合原子間的接近有無阻礙。C上的R基的大小與帶電性影響和2、拉氏構(gòu)象圖：可允許的和值拉氏構(gòu)象圖Ramachandran根據(jù)蛋白質(zhì)中非鍵合原子間的最小接觸距離，確定了哪些成對(duì)二面角（、）

40、所規(guī)定的兩個(gè)相鄰肽單位的構(gòu)象是允許的，哪些是不允許的，并且以為橫坐標(biāo)，以為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)圖上標(biāo)出，該坐標(biāo)圖稱拉氏構(gòu)象圖。p2062022/9/151332022/9/15134實(shí)線封閉區(qū)域一般允許區(qū)，非鍵合原子間的距離大于一般允許距離，此區(qū)域內(nèi)任何二面角確定的構(gòu)象都是允許的，且構(gòu)象穩(wěn)定。虛線封閉區(qū)域是最大允許區(qū)，非鍵合原子間的距離介于最小允許距離和一般允許距離之間，立體化學(xué)允許，但構(gòu)象不夠穩(wěn)定。虛線外區(qū)域是不允許區(qū)，該區(qū)域內(nèi)任何二面角確定的肽鏈構(gòu)象，都是不允許的，此構(gòu)象中非鍵合原子間距離小于最小允許距離，斥力大，構(gòu)象極不穩(wěn)定。對(duì)非Gly 氨基酸殘基，一般允許區(qū)占全平面的7.7%，最大允許區(qū)占全

41、平面20.32022/9/151352022/9/15136The crystal structure of pyruvate kinase2022/9/15137多肽主鏈按右手或左手方向盤繞，形成右手螺旋或左手螺旋，相鄰的螺圈之間形成鏈內(nèi)氫鍵構(gòu)成螺旋的每個(gè)C都取相同的二面角、。二、 二級(jí)結(jié)構(gòu)的基本類型1、 螺旋螺旋的一般特征2022/9/151382022/9/151392022/9/151402022/9/15141 二面角：= -57, = - 48，是一種右手螺旋 每圈螺旋：3.6個(gè)a.a殘基， 高度：0.54nm 每個(gè)殘基繞軸旋轉(zhuǎn)100，沿軸上升0.15nm 氨基酸殘基側(cè)鏈向外 相鄰

42、螺圈之間形成鏈內(nèi)氫鏈，氫鍵的取向幾乎與中心軸平行。 肽鍵上C=O氧與它后面（C端）第四個(gè)殘基上的N-H氫間形成氫鍵。典型的螺旋有如下特征2022/9/15142 多肽鏈上連續(xù)出現(xiàn)帶同種電荷基團(tuán)的氨基酸 殘基,(如Lys，或Asp，或Glu)，不能形成穩(wěn)定的螺旋。如多聚Lys、多聚Glu。 Gly在肽中連續(xù)存在時(shí)，不易形成螺旋。 R基大（如Ile）不易形成螺旋 Pro、脯氨酸中止螺旋。 R基較小，且不帶電荷的氨基酸利于螺旋的形成。如多聚丙氨酸在pH7的水溶液中自發(fā)卷曲成螺旋。R側(cè)鏈對(duì)螺旋的影響2022/9/15143pH對(duì)螺旋的影響2022/9/15144右手螺旋比左手螺旋穩(wěn)定。 蛋白質(zhì)中的螺旋幾乎都是右手，但在嗜熱菌蛋白酶中有很短的一段左手螺旋。右手-螺旋與左手-螺旋2022/9/15145-螺旋結(jié)構(gòu)是一種不對(duì)稱的分子結(jié)構(gòu)： 碳原子的不對(duì)稱性， 構(gòu)象本身的不對(duì)稱性。天然螺旋能引起偏振光右旋-螺旋的比旋不等于構(gòu)成其本身的氨基酸比旋的加和，而無規(guī)卷曲的肽鏈比旋則等于所有氨基酸比旋的加和。-螺旋結(jié)構(gòu)的旋光性2022/9/15146平行式：所有參與-折疊的肽鏈的