金銀花提取物體外抗甲型流感病毒FM1株的研究

1、金銀花提取物體外抗甲型流感病毒FM1株的研究潘曌曌,王雪峰,閆麗娟,南春紅,岳志軍【摘要】目的不雅察金銀花提取物體外按捺甲型流感病毒f1株的作用。要領(lǐng)接納血凝試驗要領(lǐng),測定差異濃度金銀花提取物體外和雞胚內(nèi)按捺流感病毒效價,闡發(fā)金銀花提取物對病毒增殖的影響。結(jié)果與病毒比較組比力,金銀花提取物組血凝效價低落,其按捺作用時間可從1h一連到24h,其對病毒的按捺作用隨著藥物濃度的低落而漸漸削弱；金銀花提取物在100、50、25g/l時,對熏染流感病毒雞胚具有防范和庇護治療作用(p0.001),而在100g/l時的防范作用顯著優(yōu)于陽性比較病毒唑組(p0.05)。結(jié)論金銀花提取物可有用按捺甲型流感病毒f1

2、株?！娟P(guān)鍵詞】甲型流感病毒；金銀花提取物；綠原酸；雞胚abstrat：bjetivetbservetheeffetfextratsfrflslnieraeinhibitinginfluenzaavirusf1strain.ethdusetheethdfheagglutinatintest,deterinetheheagglutinatininhibitintiterthatextratsfrflslnieraeinhibitinginfluenzaavirusinvitrandinebrynatedegg.resultparediththentrlgrup,theheagglutinatini

3、nhibitintiterfextratsfrflslnieraegruperedegraded.thedepressanteffetkeptnfr1hurt24hur,andthedepressanteffeteredegradediththesteppingdnfthenentratin.atthenentratinf100,50,25g/l,extratsfrflslnieraehadthepreventativeeffetandtherapeutialeffetnebrynatedegginfetedbyinfluenzaavirus(p0.001).atthenentratinf10

4、0g/l,thepreventativeeffetfextratsfrflslnieraegrupasbetterthanribaviringrup(p0.05).nlusinextratsfrflslnieraeansuppressinfluenzaavirusf1strainatively.keyrds：influenzaavirus；extratsfrflslnierae；hlrgeniaid；ebrynatedegg本實行對金銀花體外抗流感病毒作用舉行系列研究,旨在闡發(fā)該藥在中藥復(fù)方銀翹散中抗流感病毒作用的物質(zhì)底子,為將該藥及其有關(guān)復(fù)方研制成治療病毒性呼吸道疾病的當(dāng)代(復(fù)方)中藥奠基基

5、矗1實行質(zhì)料1.1藥物及重要試劑金銀花飲片購于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)隸屬病院門診藥局,經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥闡發(fā)教研室張振秋傳授斷定為忍冬科植物忍冬的花蕾金銀花。利巴韋林注射液(江蘇吳中實業(yè)股份,批號060208)；綠原酸比較品(自配,濃度0.1112g/l)。1.2病毒甲型流感病毒鼠肺順應(yīng)株a/f1/47(h1n1),中國防范醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所提供,凍存于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)病毒室,經(jīng)鼠肺、雞胚傳代后為f19e21e32e41e5。1.3雞胚9日齡尼克白種雞胚,spf級,購于遼寧省益康生物成品廠。1.41%雞紅細(xì)胞懸液網(wǎng)羅康健公雞血,阿氏液抗凝,生理鹽水1500r/in離心洗滌3次,棄上清,以無菌生理鹽水

6、配制成1%懸液,4冷藏備用1。1.5重要儀器級生物寧靜柜(美國baker公司,型號：sg403txe)；高效液相色譜儀(日本島津spd-10avp)；n-2000雙通道色譜事情站(浙江大學(xué)智能信息事情研究所)；低溫高速離心機(德國heraeus,型號：bifuge28rs)；臺式壓力蒸汽滅菌器(沈陽盛達生物電子裝備)；電熱恒溫造就箱(上海躍進醫(yī)療東西廠)；as3120電子超聲儀。2實行要領(lǐng)2.1金銀花提取物的制備及其斷定電子天平稱量金銀花飲片放入圓底燒瓶中,參加配制好的80%乙醇14倍量,電熱套加熱回流2h；第1次提取后傾倒濾液,藥渣再加80%乙醇10倍量,加熱回流1h；歸并濾液,加熱濃縮,水

7、浴箱透風(fēng)櫥加熱揮發(fā)成膏狀,置于電熱烘箱內(nèi)烘干,研成粉末避光冷藏備用。用于體外實行時,用生理鹽水配成濃度為400g/l的溶液,高速離心機4000r/in離心30in,取上清,高溫高壓滅菌后4冷藏備用。精稱樣品粉末0.1751g,置錐形瓶中,加50%甲醇50l定容,超聲30in；放冷,過濾,取續(xù)濾液5l,入棕色量瓶保存待測,檢測時用0.45微孔濾膜過濾。汲取比較品溶液5l注入液相色譜儀,以乙腈-0.4%磷酸(1387)為活動相,柱溫為35；流速為1.0l/in,于327n波優(yōu)點檢測；以綠原酸峰面積為縱坐標(biāo),綠原酸量(g)為橫坐標(biāo),繪制尺度曲線,得到回歸方程。并在上述色譜條件下測定比較品溶液及供試品

8、溶液的峰面積。2.2流感病毒增毒及其在雞胚上半數(shù)熏染量的測定將病毒原液接種于局部消毒后的9日齡spf雞胚尿囊腔,每胚接種0.1l,白臘封口,3335溫箱孵育48h,4留宿。收取尿囊液,紅細(xì)胞凝集試驗測血凝滴度。將流感病毒原液系列對數(shù)稀釋(10-110-12),別離接種在事先標(biāo)識表記標(biāo)幟好的雞胚尿囊腔內(nèi),每個濃度接種4個雞胚,并做生理鹽水比較。將注射了流感病毒的雞胚放入3335溫箱內(nèi),48h后取出,放入4冰箱內(nèi)留宿；收取尿囊液,每胚0.1l依次參加作好標(biāo)識表記標(biāo)幟的血凝板上,再參加預(yù)先配制好1%的雞血球0.1l,輕搖后40in不雅察結(jié)果,用krber公式2盤算。測得eid50為10-6.28,實

9、行用100eid50。2.3金銀花提取物最大不凝血濃度的測定中藥中含有植物血凝素,在體外實行中每每引起紅細(xì)胞凝集,造成假陽性結(jié)果。因此,應(yīng)用血凝試驗探究中藥體外按捺病毒作用,必需測定中藥的最大不凝血濃度以去除影響因素。處置懲罰好的藥液從原濃度始,用ph值7.4的hank,s事情液2倍系列稀釋6個濃度：2-12-6(40012.5g/l),別離參加等量結(jié)實血凝單元的流感病毒,3335溫箱中和2h,測定血凝效價,同時設(shè)hank,s液比較和病毒比較。結(jié)果測得金銀花提取物不引起血凝的最大濃度為25g/l。2.4金銀花提取物及利巴韋林注射液對雞胚最大無毒濃度的測定用含ps10%的生理鹽水將藥物原液作一連

10、2倍系列稀釋至1512濃度,每次抽取0.2l別離接種在預(yù)先作好標(biāo)識表記標(biāo)幟的雞胚上,每個濃度接種4個雞胚,并設(shè)生理鹽水比較。將接種好的雞胚放入35溫箱內(nèi)孵育48h,每12h不雅察記載雞胚存活環(huán)境,24h內(nèi)殞命的雞胚不記入藥物毒性作用致死數(shù)。金銀花提取物的最大無毒濃度為100g/l,利巴韋林注射液最大無毒濃度為50g/l。2.5金銀花提取物差異濃度、差異時間體外按捺病毒作用用ph為7.4的hank,s事情液,將金銀花提取物溶液從最大不凝血濃度起作系列2倍稀釋3個濃度,每個濃度4支試管,別離參加等量100eid50的流感病毒,置3335溫箱中和1、4、8、14、16、24h,測各組藥物差異濃度、差

11、異時間點血凝效價,同時設(shè)病毒比較和hank,s液比較。2.6金銀花提取物對甲型流感病毒熏染雞胚防范和庇護作用藥物原液自td0開始2倍比稀釋3個濃度(100、50、25g/l),每胚0.1l別離接種雞胚,每個濃度8個雞胚,37孵育2h,并設(shè)生理鹽水和病毒比較；然后別離接種0.1l的100eid50的病毒懸液,放入35溫箱內(nèi)48h,再4留宿。抽取尿囊液,測定血凝滴度。用100eid50病毒懸液接種雞胚,34孵育2h,再別離接種與防范實行同濃度的藥液,每組8個雞胚,并設(shè)生理鹽水及病毒比較。34溫箱內(nèi)48h,再4留宿。抽取尿囊液,測定血凝滴度。3結(jié)果(見圖1,表1表3)表1金銀花提取物體外直接按捺流感

12、病毒作用(略)表2差異濃度金銀花提取物對流感病毒熏染雞胚防范作用(略)注：與病毒比較組比力,*p0.001；與病毒唑組比力,#p0.05下同。表3差異濃度金銀花提取物對流感病毒熏染雞胚治療作用(略)在供試樣品溶液色譜圖中,與比較品溶液色譜圖相應(yīng)的位置上,有一雷同保存時間的色譜峰,經(jīng)盤算金銀花提取物樣品中綠原酸含量為1.76%。4討論我們的前期實行得出銀翹散全方、君藥組和臣藥組均具有按捺流感病毒在小鼠體內(nèi)增殖、庇護肺構(gòu)造的作用。單味藥金銀花提取物抗甲型流感病毒f1株的體外實行結(jié)果表白,該藥具有很強的直接殺滅甲型流感病毒f1株的作用,而且對流感病毒的防范及治療作用結(jié)果明顯。綠原酸是金銀花的重要藥用身分,具有明顯的清熱解毒和抗菌消炎作用,國度藥典也以綠原酸為指標(biāo)操縱含量。本實行接納80%乙醇回流提取要領(lǐng),去除部門雜質(zhì),得到金銀