發(fā)酵工程：青霉素的生產(chǎn)工藝

1、青霉素的生產(chǎn)工藝青霉素的定義 青霉素是抗菌素的一種，是指從青霉菌培養(yǎng)液中提制的分子中含有青霉烷、能破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁并在細(xì)菌細(xì)胞的繁殖期起殺菌作用的一類抗生素，是第一種能夠治療人類疾病的抗生素。青霉素類抗生素是-內(nèi)酰胺類中一大類抗生素的總稱。主要對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有效。青霉素的結(jié)構(gòu)示意圖 青霉素的結(jié)構(gòu)式常見(jiàn)的青霉素產(chǎn)品 青霉素類抗生素的毒性很小，由于-內(nèi)酰胺類作用于 細(xì)菌的細(xì)胞壁，而人類只有細(xì)胞膜無(wú)細(xì)胞壁，故對(duì)人類的毒性較小，除能引起嚴(yán)重的過(guò)敏反響外，在一般用量下，其毒性不甚明顯，是化療指數(shù)最大的抗生素。青霉素針劑和口服青霉素能分別治療肺炎、肺結(jié)核、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、白喉、炭疽等病。 青霉屬于曲霉科

2、(Eurotiaceae)。青霉與人類生活息息相關(guān)，少數(shù)種類能引起人和動(dòng)物的疾病，許多種青霉能造成柑桔、蘋果、梨等水果的腐爛；對(duì)工業(yè)產(chǎn)品、食品、衣物也造成危害；在生物實(shí)驗(yàn)室中，它也是一種常見(jiàn)的污染菌。加強(qiáng)通風(fēng)、降低溫度、減少空氣相對(duì)濕度，可以大大減輕青霉的危害。 在另一方面，青霉對(duì)人類非常重要：在工業(yè)上，它可用于生產(chǎn)檸檬酸、延胡索酸、葡萄糖酸等有機(jī)酸和酶制劑；非常名貴的婁克馥干酪、丹麥青干酪都是用青霉釀制而成的；最著名的抗生素青霉素就是從青霉的某些品系中提取而來(lái)，它是最早發(fā)現(xiàn)、最先提純、臨床上應(yīng)用最早的抗生素；近期發(fā)現(xiàn)的另一重要抗生素灰黃霉素，是由灰黃青霉產(chǎn)生的，是抑制諸如腳癬之類的真菌性皮膚

3、病的最好抗生素。青霉素生產(chǎn)的工藝過(guò)程某公司的仿真系統(tǒng)，模擬整個(gè)流程一、青霉素的發(fā)酵工藝過(guò)程1、工藝流程1絲狀菌三級(jí)發(fā)酵工藝流程 冷凍管25C，孢子培養(yǎng)，7d斜面母瓶25C，孢子培養(yǎng)，7d大米孢子26C，種子培養(yǎng)56h一級(jí)種子培養(yǎng)液27C，種子培養(yǎng)，24h二級(jí)種子培養(yǎng)液2726C,發(fā)酵,7d發(fā)酵液。2球狀菌二級(jí)發(fā)酵工藝流程 冷凍管25C，孢子培養(yǎng)，68d親米25C，孢子培養(yǎng)，810d生產(chǎn)米28C，孢子培養(yǎng)，5660h種子培養(yǎng)液2625-24C，發(fā)酵，7d發(fā)酵液。二、影響發(fā)酵產(chǎn)率的因素 1基質(zhì)濃度 在分批發(fā)酵中，常常因?yàn)榍捌诨|(zhì)量濃度過(guò)高，對(duì)生物合成酶系產(chǎn)生阻遏或抑制或?qū)z生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制如葡萄糖的

4、阻遏或抑制 , 苯乙酸的生長(zhǎng)抑制, 而后期基質(zhì)濃度低限制了菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成 , 為了防止這一現(xiàn)象 , 在青霉素發(fā)酵中通常采用補(bǔ)料分批操作法 , 即對(duì)容易產(chǎn)生阻遏、抑制和限制作用的基質(zhì)進(jìn)行緩慢流加以維持一定的最適濃度。這里必須特別注意的是葡萄糖的流加 , 因?yàn)榧词故浅鲎钸m濃度范圍較小的波動(dòng) , 都將引起嚴(yán)重的阻遏或抑制 , 使生物合成速度減慢或停止。目前 , 糖濃度的檢測(cè)尚難在線進(jìn) 行 , 故葡萄糖的流加不是依據(jù)糖濃度控制 , 而是間接根據(jù)pH 值、溶氧或 CO2 釋放率予以調(diào)節(jié)。 2溫度 青霉素發(fā)酵的最適溫度隨所用菌株的不同可能稍有差異 , 但一般認(rèn)為應(yīng)在25 C 左右。溫度過(guò)高將明顯降低

5、發(fā)酵產(chǎn)率 , 同時(shí)增加葡萄糖的維持消耗 , 降低葡萄糖至青霉素的轉(zhuǎn)化率。對(duì)菌絲生長(zhǎng)和青霉素合成來(lái)說(shuō) , 最適溫度不是一樣的, 一般前者略高于后者, 故有的發(fā)酵過(guò)程在菌絲生長(zhǎng)階段采用較高的溫度，以縮短生長(zhǎng)時(shí)間, 到達(dá)生產(chǎn)階段后便適當(dāng)降低溫度 , 以利于青霉素的合成。 3 pH 值 青霉素發(fā)酵的最適 pH 值一般認(rèn)為在 6. 5 左右 , 有時(shí)也可以略高或略低一些 , 但應(yīng)盡量防止 pH 值超過(guò)7.0, 因?yàn)榍嗝顾卦趬A性條件下不穩(wěn)定, 容易加速其水解。在緩沖能力較弱的培養(yǎng)基中, pH 值的變化是葡萄糖流加速度上下的反映。過(guò)高的流加速率造成酸性中間產(chǎn)物的積累使 pH 值降低； 過(guò)低的加糖速率缺乏以中

6、和蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)生的氨或其他生理堿性物質(zhì)代謝產(chǎn)生的堿性化合物而引起 pH 值上升。 4溶氧 對(duì)于好氧的青霉素發(fā)酵來(lái)說(shuō) , 溶氧濃度是影響發(fā)酵過(guò)程的一個(gè)重要因素。當(dāng)溶氧濃度降到 30% 飽和度以下時(shí), 青霉素產(chǎn)率急劇下降, 低于 10% 飽和度時(shí), 那么造成不可逆的損害。溶氧濃度過(guò)高 , 說(shuō)明菌絲生長(zhǎng)不良或加糖率過(guò)低, 造成呼吸強(qiáng)度下降, 同樣影響生產(chǎn)能力的發(fā)揮。溶氧濃度是氧傳遞和氧消耗的一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡點(diǎn), 而氧消耗與碳能源消耗成正比, 故溶氧濃度也可作為葡萄糖流加控制的一個(gè)參考指標(biāo)。幾種常見(jiàn)便攜式溶氧檢測(cè)儀 5菌絲濃度 發(fā)酵過(guò)程中必須控制菌絲濃度不超過(guò)臨界菌體濃度, 從而使氧傳遞速率與氧消耗速率在

7、某一溶氧水平上到達(dá)平衡。青霉素發(fā)酵的臨界菌體濃度隨菌株的呼吸強(qiáng)度 (取決于維持因數(shù)的大小, 維持因數(shù)越大,呼吸強(qiáng)度越高) 、發(fā)酵通氣與攪拌能力及發(fā)酵的流變學(xué)性質(zhì)而異。呼吸強(qiáng)度低的菌株降低發(fā)酵中氧的消耗速率，而通氣與攪拌能力強(qiáng)的發(fā)酵罐及黏低的發(fā)酵液使發(fā)酵中的傳氧速率上升, 從而提高臨界菌體濃度。青霉菌的菌絲形態(tài) 6菌絲生長(zhǎng)速度 用恒化器進(jìn)行的發(fā)酵試驗(yàn)證明，在葡萄糖限制生長(zhǎng)的條件下，青霉素比生產(chǎn)速率與產(chǎn)生菌菌絲的比生長(zhǎng)速率之間呈一定關(guān)系。當(dāng)比生長(zhǎng)速率低于0.015h-1h時(shí)，比生產(chǎn)速率與比生長(zhǎng)速率成正比, 當(dāng)比生長(zhǎng)速率高于 0. 015h-1h時(shí), 比生產(chǎn)速率與比生長(zhǎng)速率無(wú)關(guān)。因此，要在發(fā)酵過(guò)程中

8、到達(dá)并維持最大比生產(chǎn)速率, 必須使比生長(zhǎng)速率不低0.015h-1 h。這一比生長(zhǎng)速率稱為臨界比生長(zhǎng)速率。事實(shí)上 , 青霉素工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)階段控制的比生長(zhǎng)速率要比這一理論臨界值低得多, 卻仍然能到達(dá)很高的比生產(chǎn)速率。這是由于工業(yè)上采用的補(bǔ)料分批發(fā)酵過(guò)程不斷有局部菌絲自溶, 抵消了一局部生長(zhǎng), 故雖然表觀比生長(zhǎng)速率低, 但實(shí)際比生長(zhǎng)速率卻要高一些。 7菌絲形態(tài) 在長(zhǎng)期的菌株改進(jìn)中 , 青霉素產(chǎn)生菌在漂浮培養(yǎng)中分化為主要呈絲狀生長(zhǎng)和結(jié)球生長(zhǎng)兩種形態(tài)。前者由于所有菌絲體都能充分和發(fā)酵液中的基質(zhì)及氧接觸, 故一般比生產(chǎn)速率較高； 后者那么由于發(fā)酵液黏度顯著降低, 使氣-液兩相間氧的傳遞速率大大提高, 從而

9、允許更多的菌絲生長(zhǎng) (即臨界菌體濃度較高), 發(fā)酵罐體積產(chǎn)率甚至高于前者。 在絲狀菌發(fā)酵中, 控制菌絲形態(tài)使其保持適當(dāng)?shù)姆种Ш烷L(zhǎng)度, 并防止結(jié)球 , 是獲得高產(chǎn)的關(guān)鍵要素之一。而在球狀菌發(fā)酵中, 使菌絲球保持適當(dāng)大小和松緊 , 并盡量減少游離菌絲的含量, 也是充分發(fā)揮其生產(chǎn)能力的關(guān)鍵素之一。這種形態(tài)的控制與糖和氮源的流加狀況及速率、攪拌的剪切強(qiáng)度及比生長(zhǎng)速率密切相關(guān)。三、 主要工藝控制要點(diǎn)1種子質(zhì)量的控制 絲狀菌的生產(chǎn)種子是由保藏在低溫的冷凍安瓿管經(jīng)甘油、葡萄糖、蛋白胨斜面移植到小米固體上，25 C 培養(yǎng) 7 天, 真空枯燥并以這種形式保存?zhèn)溆?。生產(chǎn)時(shí)它按一定的接種量移種到含有葡萄糖、玉米漿、

10、尿素為主的種子罐內(nèi)，26 C 培養(yǎng) 56h 左右, 菌絲濃度達(dá)6%-8%, 菌絲形態(tài)正常, 按 10%-15%的接種量移人含有花生餅粉、葡萄糖為主的二級(jí)種子罐內(nèi),27C 培養(yǎng) 24h, 菌絲體積 10%-12%, 形態(tài)正常, 效價(jià)在700D/ml左右便可作為發(fā)酵種子。某生產(chǎn)車間 球狀菌的生產(chǎn)種子是由冷凍管子孢子經(jīng)混有0. 5% -1. 0 %玉米漿的三角瓶培養(yǎng)原始親米孢子, 然后再移入羅氏瓶培養(yǎng)生產(chǎn)大米孢子(又稱生產(chǎn)米), 親米和生產(chǎn)米均為25 C靜置培養(yǎng), 需經(jīng)常觀察生長(zhǎng)發(fā)育情況在培養(yǎng)到 3-4 天, 大米外表長(zhǎng)出明顯小集落時(shí)要振搖均勻, 使菌絲在大米外表能均勻生長(zhǎng), 待10 天左右形成綠色

11、孢子即可收獲。親米成熟接入生產(chǎn)米后也要經(jīng)過(guò)劇烈振蕩才可放置恒溫培養(yǎng), 生產(chǎn)米的孢子量要求每粒米300萬(wàn)只以上。親米、生產(chǎn)米子孢子都需保存在 5 C冰箱內(nèi). 工藝要求將新鮮的生產(chǎn)米 (指收獲后的孢瓶在10天以內(nèi)使用) 接入含有花生餅粉、玉米胚芽粉、葡萄糖、飴糖為主的種子罐內(nèi),28 C 培養(yǎng) 50-60h當(dāng)pH 值由6. 0-6. 5 下降至 5.5-5. 0, 菌絲呈菊花團(tuán)狀,平均直徑在 100- 130m, 每毫升的球數(shù)為 6萬(wàn) -8萬(wàn)只, 沉降率在 85% 以上, 即可根據(jù)發(fā)酵罐球數(shù)控制在 8000-11000只/ml 范圍的要求, 計(jì)算移種體積, 然后接入發(fā)酵罐, 多余的種子液棄去。球狀菌

12、以新鮮孢子為佳, 其生產(chǎn)水平優(yōu)于真空枯燥的孢子，能使青霉素發(fā)酵單位的罐批差異減少。2培養(yǎng)基成分的控制 a. 碳源 產(chǎn)黃青霉菌可利用的碳源有乳糖、蕉糖、葡萄糖等。目前生產(chǎn)上普遍采用的是淀粉水解糖、糖化液 (DE 值 50% 以上) 進(jìn)行流加。 b. 氮源 氮源常選用玉米漿、精制棉籽餅粉、麩皮，并補(bǔ)加無(wú)機(jī)氮源硫酸氨、氨水或尿素。 c. 前體 生物合成含有芐基基團(tuán)的青霉素 G, 需在發(fā)酵液中加人前體。前體可用苯乙酸、苯乙酰胺, 一次參加量不大于0.1%, 并采用屢次參加, 以防止前體對(duì)青霉素的毒害。 d.無(wú)機(jī)鹽 參加的無(wú)機(jī)鹽包括硫、磷、鈣、鎂、鉀等, 且用量要適度。另外, 由于鐵離子對(duì)青霉菌有毒害作

13、用, 必須嚴(yán)格控制鐵離子的濃度, 一般控制在30 g/ml 。3發(fā)酵培養(yǎng)的控制a. 加糖控制 加糖量的控制是根據(jù)殘?zhí)橇考鞍l(fā)酵過(guò)程中的 pH 值確定 , 最好是根據(jù)排氣中CO2 量及 O2 量來(lái)控制, 一般在殘?zhí)墙抵?0.6% 左右, pH 值上升時(shí)開(kāi)始加糖。b. 補(bǔ)氮及加前體 補(bǔ)氮是指加硫酸銨、氨水或尿素, 使發(fā)酵液氨氮控制在 O. 01%-0.05%,補(bǔ)前體以使發(fā)酵液中殘存苯乙酰胺濃度為 0.05%-0.08% 。c. pH 值控制 對(duì)pH 值的要求視不同菌種而異, 一般為 pH 6.4-6.8, 可以補(bǔ)加葡萄糖來(lái)控制。目前一般采用加酸或加堿控制pH值。d. 溫度控制 前期 25- 26C,

14、 后期 23C, 以減少后期發(fā)酵液中青霉素的降解破壞。e. 溶解氧的控制 一般要求發(fā)酵中溶解氧量不低于飽和溶解氧的30% 。通風(fēng)比一般為1 : 0. 8L/(L min), 攪拌轉(zhuǎn)速在發(fā)酵各階段應(yīng)根據(jù)需要而調(diào)整。f. 泡沫的控制 在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生大量泡沫, 可以用天然油脂, 如豆油、玉米油等或用化學(xué)合成消泡劑“泡敵來(lái)消泡, 應(yīng)當(dāng)控制其用量并要少量屢次參加, 尤其在發(fā)酵前期不宜多用, 否那么會(huì)影響菌體的呼吸代謝。g. 發(fā)酵液質(zhì)量控制 生產(chǎn)上按規(guī)定時(shí)間從發(fā)酵罐中取樣 , 用顯微鏡觀察菌絲形態(tài)變化來(lái)控制發(fā)酵。生產(chǎn)上慣稱 鏡檢 ,根據(jù) 鏡檢 中菌絲形變化和代謝變化的其他指標(biāo)調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度, 通過(guò)追加糖或補(bǔ)加前體等各