實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

1、 PCR技術(shù) 即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction ），PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。 PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列

2、為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。 重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需24分鐘，23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。反應(yīng)過程變性退火延伸實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（RT-PCR,QPCR）熒光定量PCR技術(shù)指在PCR反應(yīng)中加入熒光基團(tuán)，通過連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)出現(xiàn)的先后順序及信號(hào)強(qiáng)弱的變化，及時(shí)分析目的基因的初始量。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中，對(duì)整個(gè)PCR反應(yīng)過程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)和連續(xù)分析擴(kuò)增相關(guān)熒光信號(hào)，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，檢測(cè)到的熒光信號(hào)的變化可以繪制成一條曲線。曲線一般

3、分為基線期，指數(shù)增長(zhǎng)期，線性增長(zhǎng)期和平臺(tái)期。指數(shù)增長(zhǎng)期 平臺(tái)期線性增長(zhǎng)期基線期兩個(gè)概念一，熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長(zhǎng)期設(shè)定的一個(gè)熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)。一般熒光閾值設(shè)置為3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，但實(shí)際應(yīng)用時(shí)要結(jié)合具體情況來綜合考慮。二，Ct值為擴(kuò)增曲線與閾值線的交點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，即Ct值與熒光閾值有關(guān)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的數(shù)學(xué)原理理想的PCR反應(yīng)：Xn=X02n非理想的PCR反應(yīng)：Xn=X0(1+Ex)n方程式兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)得: log Xn=log (X0 (1+Ex)n)整理方程式得:log X0= (- log(1+Ex) )n+ log Xn將C(t)和達(dá)到C(

4、t)值時(shí)終產(chǎn)物的量Xc(t)帶入上式得：log X0= (- log(1+Ex) ) C(t)+ log Xc(t) C(t)=-log X0/log(1+Ex)+log Xc(t)/log(1+Ex) 對(duì)于一個(gè)特定的反應(yīng)來說，Ex是恒定的，即， 初始濃度的對(duì)數(shù)與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系n：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)Xn：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0：初始模板量Ex：擴(kuò)增效率TaqMan探針 熒光探針的一種，基于熒光共增能量轉(zhuǎn)移的原理：當(dāng)某個(gè)熒光基團(tuán)的發(fā)射譜與另一個(gè)熒光基團(tuán)的吸收光譜重疊，且兩個(gè)基團(tuán)距離足夠近時(shí)，能量可以從短波長(zhǎng)（高能量）的熒光基團(tuán)傳遞到長(zhǎng)波長(zhǎng)（低能量）的熒光基團(tuán)，這個(gè)過程稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移(F

5、RET),實(shí)際相當(dāng)于短波長(zhǎng)熒光基團(tuán)釋放的熒光被屏蔽。TaqMan探針 利用Taq酶的5外切活性，即Taq酶具有天然的5-3核酸外切酶活性，能水解雙鏈DNA 5端的核苷酸。 依據(jù)目的基因設(shè)計(jì)一條能與之特異雜交的探針，5端標(biāo)記報(bào)告基團(tuán)Reporter，3端標(biāo)記淬滅基團(tuán)Quencher，正常情況下兩個(gè)基團(tuán)的空間距離很近，構(gòu)成FRET關(guān)系，熒光基團(tuán)信號(hào)被淬滅。PCR擴(kuò)增時(shí)，引物與探針結(jié)合到模板上，探針位于上下游引物之間。當(dāng)擴(kuò)增延伸到探針結(jié)合的位置時(shí)，Taq酶利用5-3外切酶活性，將探針5端連接的熒光分子從探針上切割下來，破壞了兩個(gè)熒光分子的FRET關(guān)系，從而發(fā)出熒光。 反應(yīng)過程MGB探針新型TaqMa

6、n探針，其3端采用了非熒光性的淬滅基團(tuán)，吸收?qǐng)?bào)告基團(tuán)的能量后并不發(fā)光，大大降低本底信號(hào)的干擾。此外MGB探針3端還連接了一個(gè)小溝結(jié)合物-二氫環(huán)化吲哚卟啉-三肽，可以大大穩(wěn)定探針與模板的雜交，提高探針Tm值，使得較短的探針也能達(dá)到較高的Tm值，淬滅效果更好，熒光背景更低。此外，還其它非熒光類淬滅基團(tuán)如BHQ1，BHQ2等。 熒光標(biāo)記組合 報(bào)告熒光: 6-FAM、JOE、VIC、NED、CY3、Texas Red、CY5 淬滅熒光: MGB-NFQ、TAMRA、BHQ 參比熒光: ROX報(bào)告熒光基團(tuán)淬滅(熒光)基團(tuán)FAM野生型WTAMRA,BHQ1,MGBVIC，JOE，HEX突變型MTAMRA,

7、BHQ1,MGBROX內(nèi)參BHQ2,MGB常用的熒光組合：校準(zhǔn)物理誤差:參比熒光(ROX)Master Mix中ROX濃度固定ROX不參與PCR擴(kuò)增，信號(hào)強(qiáng)度只與Master Mix用量有關(guān)ROX的功能：校準(zhǔn)物理誤差 耗材質(zhì)量、管蓋厚度、透光性能 反應(yīng)體系監(jiān)控：蒸發(fā)、操作熒光定量PCR過程一 體系配制組分名稱作用10buffer（Tri-Hcl、( NH4)2SO4、K+、Mg2+等）緩沖液-提供反應(yīng)環(huán)境引物mixPCR反應(yīng)的出發(fā)點(diǎn)探針mix發(fā)出信號(hào)，指示擴(kuò)增Taq酶（10U/ul）聚合酶-催化合成反應(yīng)UNG酶（1U/ul）防污染dNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP）2

8、0mMPCR反應(yīng)合成原料H2OTotal體積偏小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定；體積偏大，浪費(fèi)原料二 熒光基團(tuán)及淬滅基團(tuán)的設(shè)置Reporter和Quencher中選擇所標(biāo)記的熒光基團(tuán)及淬滅基團(tuán)。對(duì)于Quencher的選擇，如果是 MGB探針，選擇 NFQ-MGB；如果是TAMRA探針，選擇TAMRA；如果是其他形式的非熒光淬滅基團(tuán)（如BHQ），選擇None。一些儀器不需要設(shè)置淬滅基團(tuán)。三 程序的設(shè)置1.95左右預(yù)變性 對(duì)酶的活性進(jìn)行激活，時(shí)間視酶修飾的種類而定?？贵w修飾的酶1min左右，化學(xué)修飾的酶10min。2.95左右變性，15s-30s 解開DNA雙鏈結(jié)構(gòu)為單鏈，以便它與引物，探針結(jié)合。3.65左右退

9、火/延伸，1min左右 引物，探針與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合，開始擴(kuò)增。并在此步收集熒光信號(hào)。TaqMan探針法的產(chǎn)物大小在50-150bp之間，適用于TaqMan探針法的酶為保證其特異性經(jīng)過特殊修飾，導(dǎo)致其擴(kuò)增效率不高（正常Taq酶1min擴(kuò)增1kb），因此時(shí)間偏長(zhǎng)。4.循環(huán)數(shù)設(shè)置 40-50個(gè)循環(huán)。循環(huán)數(shù)過高非特異性擴(kuò)增信號(hào)增強(qiáng)，陰性對(duì)照也可能會(huì)出現(xiàn)擴(kuò)增。上述為兩步法擴(kuò)增過程。此外，還有三步法擴(kuò)增過程。即將退火/延伸步驟分開。 1.95左右預(yù)變性 2.95左右變性，15s-30s 3.65左右退火，30s 4.72延伸，1min兩步法擴(kuò)增有利于提高特異性，三步法擴(kuò)增有利于提高擴(kuò)增效

10、率。四 數(shù)據(jù)分析從核酸的提取到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的獲得，中間的步驟繁多，因而影響反應(yīng)的因素也很多，主要包括：反應(yīng)體系，模板的濃度與純度，Mg2+濃度，引物與探針的濃度，反應(yīng)循環(huán)數(shù)，Taq酶活性，擴(kuò)增程序等。因而實(shí)驗(yàn)結(jié)果也會(huì)出現(xiàn)各種各樣的問題，主要包括：信號(hào)強(qiáng)度低，擴(kuò)增效率低，特異性低，體系穩(wěn)定性差等。問題及優(yōu)化策略問題原因解決策略無信號(hào)退火/延伸溫度過高，引物未擴(kuò)增或者探針未結(jié)合；探針設(shè)計(jì)不合理；引物設(shè)計(jì)不合理；取擴(kuò)增后的產(chǎn)物5ul，2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察電泳結(jié)果。若無條帶或條帶較弱，則降低退火/延伸溫度，增加離子強(qiáng)度，若優(yōu)化無結(jié)果，則需重新設(shè)計(jì)引物；若有條帶，則說明探針未結(jié)合，則降低退火/延伸溫度，

11、若優(yōu)化無結(jié)果，則需重新設(shè)計(jì)探針。信號(hào)強(qiáng)度低，可能會(huì)導(dǎo)致鋸齒狀曲線； 基團(tuán)本身信號(hào)弱；探針與引物量不足；退火/延伸溫度過高，探針結(jié)合能力弱；模板含有抑制物；離子強(qiáng)度低；增加Mg2+的量；添加K+；增加探針與引物的量；降低退火/延伸溫度；提高模板濃度；添加增強(qiáng)劑；增加qpcr mix的量；擴(kuò)增曲線下滑或斷裂；模板濃度高；基線期范圍大于Ct值；降低模板濃度；減小基線終點(diǎn)值（小于Ct值），重新分析數(shù)據(jù)個(gè)別擴(kuò)增曲線突然驟降反應(yīng)管內(nèi)留有氣泡，升溫時(shí)氣泡突然破裂，導(dǎo)致曲線驟降體系上機(jī)前離心，并仔細(xì)檢查反應(yīng)管內(nèi)是否有氣泡擴(kuò)增效率低引物設(shè)計(jì)不當(dāng)；Taq酶活性低；模板含有抑制物；降低退火/延伸溫度，延長(zhǎng)退火/延伸時(shí)間；提高引物濃度；添加K+；改用三步法擴(kuò)增；添加增強(qiáng)劑；換酶